三七總皂苷抑制毒胡蘿卜素誘導(dǎo)Bip/GRP78和caspase-12的表達(dá)

余 晶* 邱 華 龍福立 石清蘭 陳月橋 毛德文

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝病科，廣西 南寧 530023）

三七總皂苷抑制毒胡蘿卜素誘導(dǎo)Bip/GRP78和caspase-12的表達(dá)

余 晶* 邱 華 龍福立 石清蘭 陳月橋 毛德文

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝病科，廣西 南寧 530023）

目的 探索三七總皂苷在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激條件下的細(xì)胞保護(hù)作用，分析三七總皂苷的抗肝細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制。方法 毒胡蘿卜素（TG）誘導(dǎo)人類肝臟來源的細(xì)胞株Huh7細(xì)胞形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。設(shè)置空白對照，三七總皂苷，毒胡蘿卜素，及三七總皂苷加毒胡蘿卜素不同處理細(xì)胞，加入細(xì)胞培養(yǎng)TG濃度5 μmol/L，三七總皂苷濃度150 μmol/L，培養(yǎng)24 h。熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)形態(tài)學(xué)，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡，免疫印記法檢測Bip/GRP78和pro caspase-12，細(xì)胞caspase-3/7活性分析。結(jié)果 毒胡蘿卜素處理細(xì)胞染色質(zhì)固縮，向外周聚集，周邊化。形成很多顆粒物質(zhì)。大量細(xì)胞核破裂形成碎片，核解體。三七總皂苷共同處理的細(xì)胞改善了細(xì)胞器的完整性，減少形態(tài)學(xué)改變，DAPI染色顆粒物質(zhì)減少了45 %。流式細(xì)胞儀測定顯示三七總皂苷處理減少了2.5倍毒胡蘿卜素引起的細(xì)胞凋亡。三七總皂苷減少TG誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物Bip/GRP78產(chǎn)生，降低pro caspase-12向caspase-12轉(zhuǎn)化。減少caspase-3/7活性50 %。結(jié)論 三七總皂苷具有細(xì)胞保護(hù)作用，對抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。三七總皂苷的抗凋亡作用的機(jī)制與穩(wěn)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境，抵消TG-誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激Bip/GRP78產(chǎn)生，降低pro caspase-12向caspase-12轉(zhuǎn)化有關(guān)。這些研究結(jié)果有助于我們了解三七總皂苷對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的肝臟疾病的治療作用機(jī)制。

三七總皂苷；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；Bip/GRP78

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）是一種重要的真核細(xì)胞器，由于各種原因引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以及Ca2+平衡紊亂的狀態(tài)，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是誘導(dǎo)肝損傷導(dǎo)致凋亡途徑之一。研究表明脂肪肝、膽汁淤積和酒精性肝病，病毒性肝炎等的發(fā)病機(jī)制均與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的肝細(xì)胞凋亡有關(guān)[1]。田七是產(chǎn)于廣西的中藥，中醫(yī)認(rèn)為田七具有活血化瘀，消腫止痛，止血等功能。田七的主要活性成分為三七總皂苷（PNS）。三七總皂苷已廣泛應(yīng)用于治療心腦血管疾病。藥理研究發(fā)現(xiàn)，除了其對心腦血管系統(tǒng)疾病具有治療作用外還具有治療慢性肝炎的作用。但是它的作用機(jī)制并未完全了解，本研究從分子生物學(xué)的角度探索三七皂苷對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的肝細(xì)胞凋亡的作用及其作用機(jī)制。毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG）是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異的鈣離子ATP酶抑制劑，用于建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚2,3]。毒胡蘿卜素通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜鈣離子APT酶，干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子穩(wěn)定， 鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外流，形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。本研究主要觀察三七皂苷保護(hù)肝細(xì)胞的具體作用環(huán)節(jié)，發(fā)現(xiàn)三七皂苷對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)通路的影響位點(diǎn)。為中藥治療肝臟疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 三七總皂苷及毒胡蘿卜素

三七總皂苷（昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，批號：20090701），毒胡蘿卜素購買于美國Sigma公司。三七總皂苷溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，三七總皂苷儲存液的濃度為100 mmol/L，儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?0 %的毒胡蘿卜素在每次使用前用無菌水稀釋。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理

人體肝臟衍生的細(xì)胞系Huh7細(xì)胞在最低必需培養(yǎng)基（MEM），在含10 %胎牛血清（FBS），1 %青霉素G鈉，硫酸鏈霉素，二性霉素。增濕培養(yǎng)箱中，將細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃和5 % CO2。24 h后，將培養(yǎng)基更換為不含F(xiàn)BS的MEM。為了探討三七總皂苷是否發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，細(xì)胞治療與三七總皂苷濃度從10 μmol/L到300 μmol/L過夜，然后細(xì)胞暴露于TG（5 μmol/L）24 h，如以前的實(shí)驗(yàn)顯示，這種條件可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[2]。設(shè)定無細(xì)胞空白對照，細(xì)胞未處理對照，三七總皂苷處理，毒胡蘿卜素處理，和三七總皂苷加毒胡蘿卜素處理5組。

1.3 儀器

ST-360自動(dòng)酶標(biāo)儀（上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司）；311二氧化碳培養(yǎng)箱（美國ThermoForma公司產(chǎn)品）；DLF560型超凈工作臺（荷蘭clear Air Techniek bv公司產(chǎn)品）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶（加拿大 BIOFIL 公司產(chǎn)品）；96孔板（加拿大 BIOFIL 公司產(chǎn)品）；熒光相差顯微鏡（德國萊卡儀器有限公司）；微量移液器（法國Pipetman公司產(chǎn)品）；TB-215丹佛精密天平（德國賽多利斯儀器系統(tǒng)有限責(zé)任公司）。流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur機(jī)型）。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)形態(tài)學(xué)檢查

經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理后，0.2 μg/mL 4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）染色，在熒光相差顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查。

1.4.2 流式細(xì)胞儀對凋亡細(xì)胞測定

運(yùn)用Annexin V/PI雙染色流式法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Invitrogen公司生產(chǎn)，貨號：V13241）按試劑盒的操作指導(dǎo)，細(xì)胞收集：將經(jīng)過50 μg/mL三七總皂苷及TG處理的細(xì)胞直接收集到10 mL的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為（1～5）×106/mL 500～1000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。用孵育緩沖液洗滌1次，500～1000 r/min離心5 min。用100 μL的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15 min。500～1000 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次。加入熒光溶液4 ℃下孵育20 min，避光并不時(shí)振動(dòng)。在每次處理后，含有分離的細(xì)胞和殘留的貼壁細(xì)胞的上清液，用冷PBS洗滌，用胰蛋白酶/EDTA收獲，在室溫下在黑暗中加入Annexin V-FITC和PI并孵育10 min。Annexin V-FITC結(jié)合流式細(xì)胞儀（前488 nm；EM 530 nm）的藻紅蛋白的發(fā)射信號檢測使用FITC信號探測器和碘化染色。每個(gè)樣品計(jì)數(shù)細(xì)胞后，定量分析凋亡性細(xì)胞死亡的百分比。每個(gè)象限染色細(xì)胞百分比量化使用軟件分析熒光的分布顯示為散點(diǎn)圖，測定熒光的細(xì)胞的百分比在每個(gè)象限。這種方法用于區(qū)分完好的活細(xì)胞（FITC-/PI-），凋亡細(xì)胞（FITC+/PI-）和晚期凋亡/壞死細(xì)胞（FITC+/PI+）。

1.4.3 半胱氨酸蛋白酶（Caspase-3/7）活性分析

細(xì)胞半胱氨酸蛋白酶活性熒光定量檢測試劑盒（上海寶曼生物公司科技有限公司 GMS50030.1，GMS50346.2），按試劑盒的操作指導(dǎo)，細(xì)胞按7×104/mL接種于黑色96孔板，設(shè)定無細(xì)胞空白對照，細(xì)胞未處理對照，150 μg/mL三七總皂苷處理，TG處理，和三七總皂苷加TG處理組，每組8個(gè)復(fù)孔。三七總皂苷提前孵育3 h后加入TG孵育48 h，培養(yǎng)終止加入AMC Caspase-3/7活性測定液，每孔50 μL，避光室溫100 r/min搖動(dòng)1 h后，用熒光分光光度計(jì)在Ex 345 nm/Em 442 nm測定熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度代表樣品中存在的活性caspase-3/7的量。

1.4.4 免疫印跡試驗(yàn)

細(xì)胞以3×106個(gè)/mL的濃度接種于4個(gè)10 cm直徑培養(yǎng)器中。設(shè)定細(xì)胞未處理對照，150 μg/mL三七總皂苷處理，5 μmol/LTG處理，和三七總皂苷加TG處理4組。三七總皂苷提前孵育3 h后加入TG 24 h。處理結(jié)束，收細(xì)胞，提蛋白，測蛋白濃度，取等量蛋白上樣，裂解物中的蛋白濃度的測定使用BCA蛋白檢測試劑盒。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。1抗體孵育，清洗，免疫反應(yīng)檢測順序辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，ECL化學(xué)發(fā)光。X線膠片感光顯影。印跡Pro-caspase 12，Bip/GRP78，β-actin作為上樣均等標(biāo)記。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有本文顯示數(shù)據(jù)都經(jīng)過三次以上獨(dú)立試驗(yàn)取得相似結(jié)果。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。比較兩組間差異顯著行用t檢驗(yàn)。P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 三七總皂苷抑制TG誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞凋亡

我們進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。細(xì)胞增殖TG曝光后，下降至49.3 %。但是，這種減少被逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的增殖與三七總皂苷（10～300 μg/mL）的預(yù)處理。在150 μg/mL的三七總皂苷表現(xiàn)出最好的效果，對TG誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，所以三七總皂苷150 μg/mL的選擇最佳劑量探討三七總皂苷的抗凋亡作用在實(shí)驗(yàn)[4]。細(xì)胞形態(tài)學(xué)形態(tài)學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，正常對照的細(xì)胞核：核形完整，染色質(zhì)均勻。毒胡蘿卜素處理細(xì)胞染色質(zhì)固縮，向外周聚集，形成周邊化。形成很多顆粒物質(zhì)。大量細(xì)胞核破裂形成碎片，核解體。三七總皂苷共同處理的細(xì)胞改善了細(xì)胞器的完整性，減少形態(tài)學(xué)改變，DAPI染色顆粒物質(zhì)減少了45 %（圖1）。

圖1 DAPI染色觀察三七總皂苷對TG誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀分析顯示，TG處理24 h后，Annexin V和PI雙陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，然而，三七總皂苷共同處理的細(xì)胞這種細(xì)胞凋亡的細(xì)胞減少了2.5倍（圖2）。三七總皂苷減少細(xì)胞死亡水平，Annexin V的陽性細(xì)胞減少了1.5倍，PI陽性細(xì)胞減少2倍。

圖2 流式細(xì)胞儀分析三七總皂苷對TG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

2.2 三七總皂苷對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號的影響

2.2.1 三七總皂苷抑制TG誘導(dǎo)Bip/GRP78

Bip/GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的指標(biāo)，提示去除蛋白折疊反應(yīng)正在被觸發(fā)。如圖3所示，與TG的處理后的Bip/GRP78蛋白的表達(dá)量增加。與三七總皂苷預(yù)處理抑制TG誘導(dǎo)Bip/GRP78的至少50 %。

圖3 三七總皂苷對ER應(yīng)激信號的影響

2.2.2 三七總皂苷抑制TG誘導(dǎo)的caspase-12的激活

TG是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶抑制劑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的波動(dòng)激活Huh7細(xì)胞內(nèi)的Pro-caspase-12向caspase-12轉(zhuǎn)化。我們研究了三七總皂苷對TG誘導(dǎo)caspase12活化的影響。免疫印記分析表明TG處理細(xì)胞導(dǎo)致Pro-caspase-12的明顯減少。然而預(yù)先用150 μg/mL的三七總皂苷降低TG誘導(dǎo)活化的caspase-12，抑制了Pro-caspase-12向caspase-12轉(zhuǎn)化（圖3）。

2.2.3 三七總皂苷抑制TG誘導(dǎo)的caspase3/7的激活

通過測量caspase3/7活性，我們研究了三七總皂苷對TG誘導(dǎo)蛋白酶3/7的激活的影響。 TG處理24 h后，與未處理的細(xì)胞相比caspase-3/7活性增加超過5倍。三七總皂苷處理后抑制的caspase-3/7活性的至少50 %（圖4）。

圖4 三七總皂苷抑制TG誘導(dǎo)的caspase3/7的激活（對照（C），三七總皂苷（PNS），毒胡蘿卜素（TG））

3 討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)承擔(dān)新生蛋白質(zhì)的折疊、組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)。在蛋白質(zhì)折疊過程中，由于各種原因會(huì)使得未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白增多。然而，在細(xì)胞內(nèi)存在一種機(jī)制，這一機(jī)制可以通過調(diào)整內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白的數(shù)量和加強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的折疊能力，來減少未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白的進(jìn)一步生成，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，當(dāng)缺乏分子伴侶或細(xì)胞能量，氧化還原環(huán)境破壞，蛋白質(zhì)變異，Ca2+外流，可以干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，形成應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞信號通路的激活被稱為去蛋白折疊反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）。GRP78是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白，是細(xì)胞為了適應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)所產(chǎn)生的一組應(yīng)激蛋白，GRP78結(jié)合Ca2+保護(hù)細(xì)胞免受錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的有害影響，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)調(diào)整去蛋白質(zhì)折疊反應(yīng)，細(xì)胞避免死亡；在應(yīng)激調(diào)節(jié)時(shí)其基因的轉(zhuǎn)錄活性提高，過度GRP78表達(dá)從而維持了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+穩(wěn)定及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，轉(zhuǎn)移內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的錯(cuò)誤折疊蛋白，保持細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下蛋白質(zhì)繼續(xù)合成，降低因Ca2+的波動(dòng)而引起的細(xì)胞死亡[5]。然而，蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊是持久或過度時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)細(xì)胞死亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)也可以導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生，這也可以積累后發(fā)生折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。線粒體活性氧也可以作為質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的Ca2+釋放和內(nèi)線粒體膜的去極化作用的結(jié)果產(chǎn)生的。因此，氧化應(yīng)激相關(guān)的內(nèi) 質(zhì)網(wǎng) 應(yīng) 激造 成 多途 徑的細(xì) 胞死 亡[6,7]。 三 七總 皂苷減 少Huh7細(xì)胞毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的ROS生成[4]。因此，三七總皂苷細(xì)胞保護(hù)作用是從多方面進(jìn)行。Pro-caspase 12是caspase 12蛋白酶前體（相對分子質(zhì)量約60×103），主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷可特異性地介導(dǎo)其活化。非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致凋亡不會(huì)引起caspase 12的活化，有實(shí)驗(yàn)用免疫印跡法檢測TG誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞凋亡過程中caspase 12的活化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TG誘導(dǎo)12 h pro-caspase 12表達(dá)增高，可能是由于受到TG刺激后細(xì)胞作出的生理反應(yīng)性增高。在18 h以后隨著細(xì)胞進(jìn)展至凋亡，細(xì)胞內(nèi)pro-caspase 12被切割形成活化的caspase 12而逐漸減少[8]。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

我們的研究結(jié)果表明，三七總皂苷對TG誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，信號通路激活形成凋亡具有細(xì)胞保護(hù)作用。三七總皂苷誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用是與穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境，抑制TG誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少procaspase-12的轉(zhuǎn)化，抑制下游信號蛋白酶caspase3/7的激活。

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R285.5

：B

：1671-8194（2014）01-0049-03

廣西壯族自治區(qū)科學(xué)技術(shù)廳廣西科學(xué)基金項(xiàng)目（合同編號：桂科回0991010）

*通訊作者:E-mail: jingy1237@126.com