來(lái)曲唑在子宮內(nèi)膜異位癥治療中的作用

龐麗娜

（錦州市婦嬰醫(yī)院，遼寧 錦州 121001）

來(lái)曲唑在子宮內(nèi)膜異位癥治療中的作用

龐麗娜

（錦州市婦嬰醫(yī)院，遼寧 錦州 121001）

目的 通過觀察芳香化酶抑制劑－來(lái)曲唑作用于體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜細(xì)胞（Ectopic endometrial cells of women with endometriosis，EE）后芳香化酶及芳香化酶轉(zhuǎn)錄刺激因子－類固醇源性因子（SF-1）的表達(dá)情況，探討來(lái)曲唑作為芳香化酶抑制劑對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥（內(nèi)異癥）的作用。方法 以0、0.1、1、10、100 nmol/L濃度的來(lái)曲唑?qū)w外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜異位癥者的在位內(nèi)膜細(xì)胞（EE）分別進(jìn)行刺激。72 h后采用RT-PCR法從核酸水平檢測(cè)Aromatase和SF-1的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果 不同濃度的來(lái)曲唑均可明顯抑制細(xì)胞內(nèi)Aromatasem RNA及SF-1mRNA表達(dá)，與空白組比較有顯著性差異（P＜0.05）；且抑制作用呈濃度依賴性。結(jié)論 芳香化酶抑制劑－來(lái)曲唑?qū)?nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞具有明顯抑制EE細(xì)胞內(nèi)芳香化酶及其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SF-1的與mRNA表達(dá)。

來(lái)曲唑；子宮內(nèi)膜異位癥；芳香化酶

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 組織來(lái)源：EE內(nèi)膜標(biāo)本取自2010年8月至2011年8月在錦州市婦嬰醫(yī)院婦科，因子宮內(nèi)膜異位癥巧克力囊腫接受手術(shù)的20例患者，年齡在22～44歲；患者均無(wú)內(nèi)科合并癥，月經(jīng)規(guī)律，周期5～7/27～32 d，無(wú)其他免疫、代謝性或內(nèi)分泌性疾病，手術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未接受雌激素，孕激素或雄激素治療。研究組年齡為（34.9±5.9）歲，對(duì)照組年齡為（37.2±6.1）歲，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

1.1.2 在位內(nèi)膜的采集：于月經(jīng)周期第7～10天取標(biāo)本，病理檢查證實(shí)內(nèi)膜均為增殖期，內(nèi)膜采集方法為無(wú)菌留取手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜或術(shù)中刮宮獲得的內(nèi)膜。所得標(biāo)本均在手術(shù)獲得后0.5 h內(nèi)置于冰浴的F-12/ DMEM混合培養(yǎng)基（FD）中。24 h以內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)處理。

1.2 方法

1.2.1 建立細(xì)胞模型：①子宮內(nèi)膜細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)：對(duì)EM患者的在位子宮內(nèi)膜（簡(jiǎn)稱在位內(nèi)膜eutopic endometrium EE）細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，參照Noble等[1]的分離、培養(yǎng)方法，略有改動(dòng)。②共培養(yǎng)子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底面時(shí)，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行傳代、凍存與復(fù)蘇。③子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞的純度鑒定：上述細(xì)胞經(jīng)倒置顯微鏡觀察：進(jìn)行腺上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)差異比較，并攝影；對(duì)細(xì)胞免疫化學(xué)進(jìn)行鑒定：共培養(yǎng)的間質(zhì)細(xì)胞及腺上皮細(xì)胞分別用波形蛋白Vimentin抗體及細(xì)胞角化蛋白cytokeratin進(jìn)行免疫染色，采用不加任何一抗者為陰性對(duì)照。

1.2.2 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Semiquantitative RT-PCR）檢測(cè)來(lái)曲唑?qū)E細(xì)胞芳香化酶及其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SF-1mRNA水平的影響：引物設(shè)計(jì)與合成：從Genebank中檢索芳香化酶（Aromatase）、sF-1及GAPDH的基因序列，結(jié)合文獻(xiàn)[2]選取引物序列，引物自身之間及與GAPDH之間不存在互補(bǔ)配對(duì)現(xiàn)象。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法

①將EE細(xì)胞以2×105/mL的密度接種于面積為75cm2培養(yǎng)瓶中。置95%空氣，5%CO2，37 ℃溫箱培養(yǎng)；待細(xì)胞生長(zhǎng)接近鋪滿瓶底時(shí)，換用10%FBS培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；24 h后，用0、0.1、1、10、100 nmol/L濃度的來(lái)曲唑?qū)w外培養(yǎng)的內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜細(xì)胞（EE），分別進(jìn)行刺激。每間隔24 h換液一次，72 h后終止實(shí)驗(yàn)；72 h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，冷卻后于-70 ℃保存。②進(jìn)行RNA純度鑒定。③根據(jù)cDNA first chain amplification system說(shuō)明書，建立20 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。④確定PCR擴(kuò)增條件，據(jù)此，確定各實(shí)驗(yàn)循環(huán)數(shù)。⑤PCR擴(kuò)增。⑥PCR產(chǎn)物的電泳及半定量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用（）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

①倒置相差顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)，間質(zhì)細(xì)胞體積比腺上皮細(xì)胞明顯增大，長(zhǎng)度變短，呈紡錘狀，核不明顯，細(xì)胞與細(xì)胞之間呈平行排列；腺上皮細(xì)胞輪廓清晰，外形似蝌蚪，核較大而且明顯，細(xì)胞間有小絲狀物相互連接，且常圍繞成細(xì)胞小團(tuán)。間質(zhì)細(xì)胞大而不規(guī)則。內(nèi)異癥內(nèi)膜細(xì)胞與非內(nèi)異癥內(nèi)膜細(xì)胞在形態(tài)學(xué)特點(diǎn)上差別在于：非內(nèi)異癥內(nèi)膜細(xì)胞較小，形態(tài)規(guī)則，排列整齊，具有極性；內(nèi)異癥內(nèi)膜細(xì)胞較大，形態(tài)多不規(guī)則，排列紊亂，沒有極性。②內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。為了進(jìn)一步鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞及其純度，分別用上皮細(xì)胞特異的細(xì)胞骨架蛋白cytokeratin與間質(zhì)細(xì)胞特異的骨架蛋白vimentin的抗體進(jìn)行染色。腺上皮細(xì)胞cytokeratin染色陽(yáng)性，而vimentni染色陰性；相反間質(zhì)細(xì)胞eytokeratin陰性，而vimentin染色陽(yáng)性，結(jié)果表明：原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中，cytokeratin染色陽(yáng)性占絕大多數(shù)，純度率約90%，間質(zhì)細(xì)胞vimentin染色陽(yáng)性，純度率達(dá)95%以上。

2.2 RT-PCR檢測(cè)來(lái)曲唑?qū)E細(xì)胞芳香化酶及其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SF-1 mRNA水平的影響

所有組織標(biāo)本均檢測(cè)到內(nèi)參照基因GAPDH的穩(wěn)定表達(dá)，證實(shí)逆轉(zhuǎn)錄所得產(chǎn)物cDNA完整性和PCR反應(yīng)成功。內(nèi)參照基因GAPDH mRNA的 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為576 bp，目的基因Aromatase mRNA的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為264 bp，SF-1 mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為340 bp。①來(lái)曲唑?qū)?nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞Aromatase mRNA表達(dá)有抑制作用，呈濃度依賴性。見表1。②來(lái)曲唑?qū)?nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞SF-1 mRNA表達(dá)有抑制作用，呈濃度依賴性。見表1。③來(lái)曲唑?qū)romatase mRNA和SF-1 mRNA的表達(dá)不同濃度組間比較，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1、圖2。

表1 RT-PCR檢測(cè)來(lái)曲唑?qū)E細(xì)胞芳香化酶及其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SF-1 mRNA水平的影響

3 討 論

內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜細(xì)胞SF-1 mRNA水平異常增高，內(nèi)異癥在位內(nèi)膜就具有SF-1的異常表達(dá)趨勢(shì)。SF-1能與CYP19基因的啟動(dòng)子Ⅱ結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄芳香化酶mRNA，進(jìn)一步表達(dá)合成芳香化酶。內(nèi)異癥患者的內(nèi)膜細(xì)胞能表達(dá)SF-1，刺激內(nèi)膜細(xì)胞轉(zhuǎn)錄與表達(dá)芳香化酶，催化內(nèi)膜細(xì)胞合成雌激素，促進(jìn)內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展。這樣，當(dāng)有異常表達(dá)SF-1趨勢(shì)的在位內(nèi)膜異位到其他組織部位時(shí)，其SF-1表達(dá)水平進(jìn)一步增高。SF-1能調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞的增生與分化，可刺激甾體類酶的表達(dá)，在卵巢器官分化形成中起決定作用[3]。促使細(xì)胞異常表達(dá)芳香化酶，進(jìn)爾催化合成雌激素，促使局部雌二醇水平增高，子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)展以及局部炎癥、免疫反應(yīng)的發(fā)生。因此，我們推測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜芳香化酶、SF-1的高表達(dá)可能就是子宮內(nèi)膜異位癥患者發(fā)生內(nèi)膜異位的根本原因之一。抑制在位內(nèi)膜芳香化酶、SF-1的高表達(dá)可作為治療此疾病的新靶點(diǎn)。

圖1 RT-PCR檢測(cè)來(lái)曲唑?qū)?組EE細(xì)胞芳香化酶mRNA水平的影響

圖2 RT-PCR檢測(cè)來(lái)曲唑?qū)?組EE細(xì)胞芳香化酶轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SF-1 mRNA水平的影響

一般認(rèn)為，芳香化酶抑制劑治療內(nèi)異癥的機(jī)制：一是通過抑制卵巢和卵巢外組織芳香化酶的活性，降低血清和病灶局部雌激素的濃度；二是降低異位病灶局部芳香化酶的表達(dá)。本研究實(shí)驗(yàn)證實(shí)芳香化酶抑制劑可以明顯抑制細(xì)胞內(nèi)芳香化酶及其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SF-1的mRNA表達(dá)。進(jìn)一步支持內(nèi)異癥發(fā)生的“源頭理論”或“在位內(nèi)膜決定論”。

[1] 譚先杰,劉東遠(yuǎn),郎景和,等.子宮內(nèi)膜腺上皮及基質(zhì)細(xì)胞分離,培養(yǎng)作為子宮內(nèi)膜異位癥體外細(xì)胞模型的探索[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展,2002,11(1):30-32.

[2] 羅輝,呂忠士,史玉霞.芳香化酶在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及意義[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2003,19(11):1222-1223.

[3] 王化麗,于靜,王蓮芬,等.細(xì)胞色素芳香酶P450在正常,子宮內(nèi)膜異位癥子宮內(nèi)膜的表達(dá)及意義[J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志,2003,19(2):95-96.

R711.71

：B

：1671-8194（2014）08-0107-02