生肌白玉膏對大鼠深I(lǐng)I度燙傷創(chuàng)面EGF和VEGF表達(dá)的影響

王思農(nóng) 張 博柳文紅 楊鵬斐

生肌白玉膏對大鼠深I(lǐng)I度燙傷創(chuàng)面EGF和VEGF表達(dá)的影響

王思農(nóng) 張 博?柳文紅 楊鵬斐

目的: 評價生肌白玉膏對大鼠深I(lǐng)I度燙傷創(chuàng)面肉芽組織中表皮生長因子(EGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的影響。方法: 80只深I(lǐng)I度燙傷大鼠隨機(jī)分為生肌白玉膏組、美寶濕潤燒傷組，生理鹽水組和空白組，在第3、7、14、21天用免疫組化方法測定創(chuàng)面肉芽組織中EGF、VEGF陽性細(xì)胞變化。結(jié)果: 實(shí)驗(yàn)組大鼠創(chuàng)面肉芽組織中EGF和VEGF陽性表達(dá)明顯高于其他組(P＜0.01)。結(jié)論:生肌白玉膏可能通過影響EGF和VEGF促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

生肌白玉膏； 創(chuàng)面； EGF； VEGF

生肌白玉膏為甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，主要作用是化腐生肌、消腫止痛、和血止血；主治燙(燒)傷、癰疽瘡毒和皮膚潰瘍久不收口等外科疾患。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法測定各組創(chuàng)面肉芽組織中EGF、VEGF的表達(dá)，進(jìn)一步明確生肌白玉膏促進(jìn)大鼠深I(lǐng)I度燙傷創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級SD大鼠80只，雌雄各半，體重180±20 g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF實(shí)驗(yàn)中心提供(實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證許可證號:SCXK(甘)2011－0001，動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用證編號:SCXK(甘)2011－0001－0001333))。生肌白玉膏(甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院批號:20091020)，美寶濕潤燒傷膏(汕頭市美寶制藥有限公司，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字Z20000004，專利號:ZL 93100276.1；ZL 95116651.4)，生理鹽水(四川科倫藥業(yè)有限公司，2012.7.14，批號:N12071307－2 250 ml:2.25 mg)。實(shí)驗(yàn)儀器:BI－2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，MiE圖像處理系統(tǒng)(山東易創(chuàng)電子有限公司)，OLYMPUS顯微鏡(日本，型號CX21型)。小鼠SP檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司批號:12127A11)，兔SP檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司批號:12122A11)，VEGF抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司批號: ZS－72690 lot:K2311)，EGF抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司批號:BS3549 lot NO:G22121)，陽離子防脫片(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司批號:ZLI－9506)，DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司批號:K1266071)。

1.2 方法

1.2.1 造模1造模前大鼠禁食12 h，自由飲水1天，用脫毛膏在大鼠背部脫毛，面積約3 cm×3 cm，清水洗凈，擦干。除空白組外，其余3組以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，其背部浸入直徑3 cm，溫度95℃的燒瓶中約10 s，造成大鼠深I(lǐng)I度燙傷(經(jīng)病理證實(shí))。燙傷后3組均以林格氏液30 mL/kg腹腔注射，抗休克治療。

1.2.2 分組及給藥 造模成功后，將80只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行分組，空白組8只，實(shí)驗(yàn)組、對照組及模型組各24只，分別涂抹生肌白玉膏1 g、美寶濕潤燒傷膏1 g及生理鹽水。每日1次，連續(xù)給藥至處死前1天，共3周?？瞻捉M不予任何處理，正常飼養(yǎng)。

1.2.3 取材 分別于造模后3、7、14、21天觀察記錄創(chuàng)面愈合情況，每個觀測點(diǎn)對6只大鼠取材，剪取大鼠背部創(chuàng)面肉芽組織約1 cm×1 cm，放入4%的甲醛中固定。待組織完全固定后石蠟包埋，切片用做免疫組化備用，每組6只大鼠創(chuàng)面肉芽組織均做免疫組化切片。

1.2.4 免疫組化SP法及步驟 (1)石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水；(2)采用高壓熱修復(fù)，3.5%H2O2去離子水(無色液體)孵育15min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗，3 min×3次；(3)滴加正常山羊血清工作液室溫孵育15 min，傾去，勿洗；(4)滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗抗兔抗鼠EGF或VEGF，4℃過夜；(5) PBS沖洗，3min×3次；(6)滴加生物素化二抗山羊抗兔IgG抗體工作液，室溫或37℃孵育15min；(7)PBS沖洗，3 min×3次；(8)滴加生物素化二抗山羊抗小鼠IgG抗體工作液，室溫或37℃孵育15 min；(9)PBS沖洗，3 min×3次；(10)DAB顯色劑顯色5 min；(11)自來水充分沖洗；(12)選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┓馄?/p>

1.2.5 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 創(chuàng)面組織中EGF、VEGF陽性細(xì)胞的判斷，EGF在新生的肉芽組織中(成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及炎性細(xì)胞為主)表現(xiàn)為棕黃色、黃褐色顆粒狀物。VEGF在成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)明顯，呈棕黃色、黃褐色。光鏡下觀察細(xì)胞漿顏色，無特異性顏色表達(dá)者為陰性(－)，輕度表達(dá)為黃色(＋)，中度表達(dá)為棕色(＋＋)，明顯表達(dá)為深棕色(＋＋＋)。采用BI－2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)及MiE圖像處理系統(tǒng)并攝片，結(jié)果以平均光密度表示，其值大小與平均光密度成正比。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用ˉx±s表示，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件做單因素方差分析比較組間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

圖1 第7、14、21天創(chuàng)面肉芽組織中EGF的表達(dá)，a～c:實(shí)驗(yàn)組；d～f:對照組；g～i:模型組(SP法，×200)

圖2 第7、14、21天創(chuàng)面肉芽組織中VEGF的表達(dá)，a～c:實(shí)驗(yàn)組；d～f:對照組；g～i:模型組(SP法，×200)

2.1 創(chuàng)面組織中EGF、VEGF水平檢測 造模第3天時各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織中EGF、VEGF的表達(dá)差異不明顯，在細(xì)胞漿中有少量淡黃色陽性細(xì)胞的表達(dá)但不均勻，陽性細(xì)胞核呈藍(lán)色顆粒狀表達(dá)。造模第7天時，模型組表現(xiàn)為(＋)，實(shí)驗(yàn)組與對照組陽性表現(xiàn)為(＋＋)。造模第14天時，模型組表現(xiàn)為(＋＋)，實(shí)驗(yàn)組與對照組表現(xiàn)為(＋＋＋)。造模第21天時，各組陽性細(xì)胞的表達(dá)均有所下降，模型組表現(xiàn)為(－～＋)，其它2組陽性細(xì)胞表現(xiàn)為(＋＋)但仍高于模型組。創(chuàng)面肉芽組織中第21天時對照組VEGF的表達(dá)較實(shí)驗(yàn)組有所上升(圖1、2)。

2.2 大鼠創(chuàng)面愈合過程中各組肉芽組織EGF、VEGF比較 見表1、2。

表1 創(chuàng)面肉芽組織中EGF的表達(dá)

表2 創(chuàng)面肉芽組織中VEGF的表達(dá)

3 討論

生肌白玉膏由熟石膏、爐甘石、紫草、當(dāng)歸、甘草、冰片、醫(yī)用白蠟等組成，實(shí)驗(yàn)研究表明熟石膏中Ca2＋離子能抑制神經(jīng)肌肉興奮性，減少血管通透性，故有抗炎、鎮(zhèn)靜、抗過敏、抗?jié)B作用，可明顯減少創(chuàng)面滲液，改善創(chuàng)面血液循環(huán)。2爐甘石能夠改善創(chuàng)面的血液循環(huán)，加速創(chuàng)面的新陳代謝，促進(jìn)傷口成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管的形成，加快肉芽組織增生，從而加速皮膚創(chuàng)口的愈合。3紫草的主要成分為紫草素，具有較好的抗菌、抗病毒、抗炎、抗過敏等作用，4在創(chuàng)面形成保護(hù)層，保持創(chuàng)面滋潤，刺激毛細(xì)血管再生和肉芽組織形成，并促進(jìn)參與傷口愈合的生長因子的產(chǎn)生。5已有實(shí)驗(yàn)研究表明當(dāng)歸具有抗炎、清除氧自由基的作用，其提取物水劑型相關(guān)護(hù)膚品具有增加小鼠表皮含水量和提高小鼠皮膚細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)活性的作用，6故對創(chuàng)面肉芽組織的生長也有一定的促進(jìn)作用。甘草中所含的甘草黃酮能提高大鼠創(chuàng)面SOD酶活力使小鼠抗應(yīng)激能力增強(qiáng)。7冰片具有明顯的抗炎、抗菌作用，可抑制或殺滅金黃色葡萄球菌、乙型溶菌性鏈球菌等5種常見細(xì)菌，對循環(huán)系統(tǒng)有一定的改善作用，可促進(jìn)藥物經(jīng)皮膚和黏膜的吸收，8提高藥物的利用率。以上藥物聯(lián)合運(yùn)用，共具活血止痛散瘀，消腫生肌斂瘡的作用，使氣血運(yùn)行通暢，肌膚得以濡養(yǎng)新生，達(dá)到治療的目的。實(shí)驗(yàn)研究表明，重組人表皮生長因子(rhEGF)用于II度燒創(chuàng)面的治療可以加快創(chuàng)面愈合速度，明顯減少愈合時間，抑制創(chuàng)面瘢痕增生且無毒副作用，是一種安全有效的藥物。9VEGF可刺激和促進(jìn)皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)因子的產(chǎn)生和活化，調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，10進(jìn)一步促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

本實(shí)驗(yàn)中對創(chuàng)面肉芽組織中不同時間EGF、VEGF表達(dá)的檢測表明，生肌白玉膏在創(chuàng)面修復(fù)過程中能調(diào)節(jié)EGF、VEGF的表達(dá)，EGF可同時作用于成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞等，具有化學(xué)趨化作用，是多種細(xì)胞的有絲分裂原，促進(jìn)細(xì)胞由細(xì)胞周期NDA合成前期進(jìn)入DNA合成期，VEGF是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能細(xì)胞因子，既能促使微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，又能增加微血管的通透性，使血液中的大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)中，形成纖維蛋白凝膠等，有利于新生血管和基質(zhì)細(xì)胞生長。EGF、VEGF表達(dá)的升高能明顯促進(jìn)成纖細(xì)胞生長，毛細(xì)血管新生，進(jìn)而促進(jìn)肉芽組織生長，促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)，因此生肌白玉膏促進(jìn)燙(燒)傷創(chuàng)面愈合可能與其上調(diào)EGF、VEGF的表達(dá)具有一定的相關(guān)性。

1楊軍，劉曉瑾.大鼠燙傷創(chuàng)面模型的制備和創(chuàng)面觀察.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2009，38(7):794－795.

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(收稿:2013－10－22 修回:2013－12－13)

Effects of Shengjibaiyu ointment on the expression of EGF and VEGF in deep second degree scald wounds

WANG Si-nong，ZHANG Bo，LIU Wen-hong，et al.Gansu University of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou，730000

Objective:To evaluate the effects of Shengjibaiyu ointment on the expression of epidermal growth factor(EGF)and vascular endothelial growth factor(VEGF)in granulation tissue of deep II degree scald wounds in rats.Methods:Eighty ratswere divided into Shengjibaiyu ointment group，MEBO group，saline group and blank group.EGF and VEGF were detected by immunohistochem icalmethod at day 3，7，14，21.Results:The expression of EGF and VEGF in experimental group was higher than those in other groups (P＜0.01).Conclusion:Shengjibaiyu ointmentmay promote the scald wound healing by influencing EGF and VEGF.

Shengjibaiyu ointment；wounds；EGF；VEGF

甘肅省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(編號:GZK－2012－19)

甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州，730000

?通信作者