法舒地爾對(duì)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞收縮、遷移能力的影響1）

褚銀平，劉愛(ài)軍，程金蓮，張 棟，高奇英，張 羽

肺動(dòng)脈高壓（PAH）是以肺血管阻力進(jìn)行性增高為臨床特征的一組疾病，其發(fā)生發(fā)展最終導(dǎo)致右心室肥厚，右心功能衰竭。肺動(dòng)脈高壓的病理變化主要是肺血管收縮和重構(gòu)，其中肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化，從中膜向內(nèi)膜發(fā)生遷移并過(guò)度增殖是肺血管重構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1-3］。因此，抑制PASMCs收縮、遷移及增殖對(duì)于肺動(dòng)脈高壓的治療具有重要意義。近年來(lái)有較多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，Rho激酶（ROCK）的選擇性抑制劑法舒地爾對(duì)肺動(dòng)脈高壓具有潛在的治療作用。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，法舒地爾對(duì)PASMCs的增殖具有抑制作用，這可能是其阻遏、逆轉(zhuǎn)肺動(dòng)脈高壓的機(jī)制之一，然而，法舒地爾對(duì)PASMCs收縮及遷移能力的影響如何，目前尚無(wú)明確的實(shí)驗(yàn)研究予以報(bào)道。因此，本研究旨在探討法舒地爾對(duì)體外培養(yǎng)的PASMCs收縮、遷移能力的影響，以進(jìn)一步闡明其抗肺動(dòng)脈高壓的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 胎牛血清（FBS）和DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，法舒地爾購(gòu)自天津紅日藥業(yè)股份有限公司，膠原收縮試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cell Biolabs公司，Boyden Chamber遷移小室購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)大鼠PASMCs，選取體重250 g～300 g，雄性SD大鼠，麻醉后于無(wú)菌條件下分離肺動(dòng)脈，仔細(xì)剝除外膜1 mm3的纖維脂肪層及內(nèi)皮細(xì)胞，用眼科剪將肺動(dòng)脈中膜剪成約1 mm3的組織塊，接種于培養(yǎng)瓶中，用含有15%FBS的DMEM培養(yǎng)液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。當(dāng)大部分組織塊長(zhǎng)出細(xì)胞暈，吸棄培養(yǎng)液和組織塊，胰酶消化混勻細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。采用α-肌動(dòng)蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對(duì)PASMCs純度進(jìn)行鑒定，選用（4～6）代生長(zhǎng)良好，純度98%以上的PASMCs細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，當(dāng)其生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%融合后，換無(wú)血清培養(yǎng)液靜息培養(yǎng)24 h使細(xì)胞周期同步化，胰酶消化混懸后，以一定濃度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞隨機(jī)分為正常培養(yǎng)對(duì)照組和不同濃度法舒地爾處理組（10μmol／L，30μmol／L，50μmol／L），作用不同時(shí)間后分別進(jìn)行不同的生物學(xué)檢測(cè)。

1.3 膠原凝膠法檢測(cè)大鼠PASMCs收縮 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PASMCSs，饑餓培養(yǎng)使細(xì)胞同步化后，胰酶消化混勻，計(jì)數(shù)，配成3×106個(gè)／L的細(xì)胞混懸液，按1∶4比例將細(xì)胞懸液與冷的膠原溶液配成細(xì)胞-膠原混合物。于24孔板每孔中加入0.5 m L細(xì)胞-膠原混合物，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，當(dāng)膠原凝集成型后，于其上加入1 m LDMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。孵育2 d后，膠原中形成了足夠的張力，于不同的孔中分別加入不同終濃度的法舒地爾，用滅菌小鏟將膠原從培養(yǎng)皿底面撬起以使其自由收縮，分別培養(yǎng)不同時(shí)間（24 h，48 h）后，掃描儀記錄膠原面積大小，采用Quantity One圖像分析軟件分析膠原面積。

1.4 Boyden Chamber法檢測(cè)大鼠PASMCs遷移 采用Boyden Chamber遷移小室測(cè)定PASMCs的遷移能力，該小室底面為均勻分布有直徑8μm孔洞的聚酯薄膜（PET膜）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PASMCs，饑餓培養(yǎng)使細(xì)胞同步化后，用含0.1%FBS的DMEM制備成濃度為5×105個(gè)／L的細(xì)胞混懸液，取300μL混懸液加入Boyden Chamber小室的上室，于下室加入500μL含1%FBS的DMEM，上下室中均加入不同終濃度（10μmol／L，30 μmol／L，50μmol／L）的法舒地爾。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，將小室取出，90%酒精常溫固定30 min，0.1%結(jié)晶紫常溫染色10 min，清水漂凈，用棉簽除膜上側(cè)面未遷移的細(xì)胞，PBS清洗后，10%乙酸100μL，抽提10 min，于560 nm處測(cè)定OD值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，應(yīng)用SPSSS 13.0軟件分析，比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 法舒地爾對(duì)大鼠PASMCs收縮膠原能力的影響 膠原凝膠細(xì)胞收縮分析結(jié)果表明，PASMCs培養(yǎng)24 h、48 h后，與對(duì)照組相對(duì)比，法舒地爾處理組PASMCs收縮膠原能力顯著降低（P＜0.01），并呈濃度依賴性，法舒地爾濃度為50μmol／L，處理時(shí)間48 h時(shí)，對(duì)PASMCs收縮膠原能力的抑制達(dá)到最大（見(jiàn)圖1、圖2）。

圖1 PASMCs-膠原混合結(jié)構(gòu)面積大小

圖2 法舒地爾對(duì)PASMCs收縮膠原能力的影響

2.2 法舒地爾對(duì)大鼠PASMCs遷移能力的影響 Boyden Chamber遷移小室法分析結(jié)果表明，PASMCs培養(yǎng)12 h后，與對(duì)照組相對(duì)比，法舒地爾處理組PASMCs的膠原收縮能力，顯著降低（P＜0.01），并呈濃度依賴性，當(dāng)法舒地爾濃度為50 μmol／L對(duì)PASMCs膠原收縮能力的抑制達(dá)到最大（見(jiàn)圖3）。

圖3 法舒地爾對(duì)PASMCs遷移能力的影響

3 討 論

肺動(dòng)脈高壓的主要表現(xiàn)是肺血管阻力增加，肺血管重構(gòu)，原位血栓形成，最終導(dǎo)致右心室肥厚，右心功能衰竭，肺血管重構(gòu)是主要的病理變化特征。平滑肌細(xì)胞是肺動(dòng)脈的主要細(xì)胞成分之一，其向收縮表型的轉(zhuǎn)化、過(guò)度遷移及增殖導(dǎo)致中膜增厚、無(wú)肌細(xì)動(dòng)脈肌化、管腔狹窄，是肺血管重構(gòu)和肺動(dòng)脈高壓的重要原因。因此，抑制PASMCs的收縮和遷移，可能對(duì)于肺動(dòng)脈高壓的治療具有重要意義。法舒地爾最初被用于改善和預(yù)防蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦痙攣及其引起的腦缺血癥狀，是目前臨床使用的唯一一種選擇性ROCK抑制劑，ROCK激酶的活化，對(duì)于平滑肌細(xì)胞的一系列細(xì)胞生物學(xué)功能，包括收縮、遷移、增殖及基因表達(dá)等均具有重要調(diào)節(jié)作用［4，5］。法舒地爾具有潛在的抗肺動(dòng)脈高壓作用。長(zhǎng)期應(yīng)用法舒地爾能夠降低野百合堿所致大鼠肺動(dòng)脈高壓，減輕右心室肥大程度，同時(shí)可抑制血管平滑肌增殖，減少巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，改善肺血管壁重構(gòu)［6］。法舒地爾對(duì)高血流量引起的小鼠肺動(dòng)脈高壓及血管重構(gòu)具有抑制作用［7］。法舒地爾對(duì)于重度肺動(dòng)脈高壓患者可以起到迅速舒張肺血管的作用［8］。盡管已有較多體內(nèi)研究證據(jù)顯示，法舒地爾具有潛在的抗肺動(dòng)脈高壓作用，但其細(xì)胞水平上的作用機(jī)制如何，目前的研究還很不充分。本課題組在前期研究中，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，法舒地爾能夠通過(guò)上調(diào)p27 Kip1蛋白表達(dá)抑制血小板衍生生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的PASMCs的增殖［9］，而法舒地爾對(duì)PASMCs收縮及遷移的影響作用，尚不完全清楚。

本研究采用體外分離培養(yǎng)大鼠PASMCs，在細(xì)胞水平上探討法舒地爾對(duì)PASMCs收縮及遷移能力的影響。膠原凝膠收縮實(shí)驗(yàn)證明，法舒地爾對(duì)PASMCs收縮膠原的能力有顯著的抑制作用，并具有濃度依賴性，當(dāng)法舒地爾濃度為50μmol／L，處理時(shí)間為48 h時(shí)，其抑制作用達(dá)到最大。此外，Boyden Chamber法檢測(cè)結(jié)果還顯示，法舒地爾對(duì)PASMCs膠原收縮能力也有顯著抑制作用。本研究結(jié)果表明，法舒地爾可以顯著抑制PASMCs的收縮和遷移能力，這可能是法舒地爾抗肺動(dòng)脈高壓的又一重要機(jī)制。

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