甲胎蛋白化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑的研制與臨床應(yīng)用

戴志文 ，蔡祥霞 ，楊湘越 ，戴振賢 ，謝玉玲 ，薛正翔 ，吳玉水

(1、福建省洪誠生物藥業(yè)有限公司，福建 莆田351254；2、解放軍臨床檢驗醫(yī)學(xué)研究所,福建 福州350025)

腫瘤標(biāo)志物的血清含量水平與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、消退、復(fù)發(fā)等具有良好的相關(guān)性。定量檢測腫瘤標(biāo)志物的血清含量對相關(guān)惡性腫瘤的早期診斷、療效和預(yù)后判斷等均有重要參考價值。但是，目前發(fā)現(xiàn)的用于腫瘤篩查診斷的標(biāo)記物大都在患者體內(nèi)含量很低，一般的檢測方法不夠敏感，難于精確定量測定?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)具有靈敏度高、線性范圍寬、光信號持續(xù)時間長、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好、檢測快速、綠色環(huán)保、便于自動化及實驗室之間的標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點[1]。

甲胎蛋白 (AFP)是早期診斷原發(fā)性肝癌最敏感、最特異的指標(biāo)，70～95%的原發(fā)性肝癌患者的AFP升高。目前臨床實驗室大多采用國外的檢測系統(tǒng)，檢測成本高昂。因此，研制腫瘤標(biāo)志物化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑具有重要社會效益和經(jīng)濟價值。本文報道甲胎蛋白(AFP)腫瘤標(biāo)志物化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑的研制及其檢測方法的建立，并初步進行臨床應(yīng)用評價。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 解放軍臨床檢驗醫(yī)學(xué)研究所2011年8月22日至2011年11月3日臨床血清樣本351份，所有血清均-20℃保存待檢。男241份,女109份,年齡 17～92歲，平均 53.2歲。

1.2 主要試劑與儀器 魯米諾化學(xué)發(fā)光底物液 (自制)；AFP標(biāo)準(zhǔn)品、AFP包被抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的AFP抗體均購自美國輝瑞公司；AFP國家參考品購自中國藥品生物制品檢定所 (批號：150542-0004)；HC-CLA-III化學(xué)發(fā)光分析儀(洪誠公司產(chǎn)品)；洗板機(北京天石公司)；對照試劑為：西門子公司生產(chǎn)的AFP定量檢測試劑 (批號：110764)；白色不透明微孔板購自深圳市金燦華實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3 .1校準(zhǔn)品的配制 將AFP抗原原液標(biāo)定后溶于小牛血清中,配制成含0,5,25,75,150,400 ng/ml的校準(zhǔn)品溶液。

1.3 .2 Anti-AFP-HRP溶液的制備 用含有50%小牛血清的PBS將HRP標(biāo)記的AFP抗體作適當(dāng)稀釋,2～8℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 .3抗體包被板的制備 將AFP包被抗體用0.05 mol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液作不同濃度稀釋后，向微孔板各孔中加入100μl，4℃包被過夜，棄去包被液，加入含10g/L牛血清白蛋白的PBS緩沖液封閉，4℃封閉過夜。棄去封閉液，除濕干燥后備用。

1.3 .4實驗操作方法 采用雙抗體夾心一步法定量檢測 AFP 含量。 實驗設(shè)校準(zhǔn)品(0、5、25、75、150、400ng/ml)共6孔以及待檢樣品孔等。簡要操作步驟如下：分別向微孔板中加入各校準(zhǔn)品或樣品(每孔25μl)，再加酶結(jié)合物50μv混勻后，置37℃溫育60min；用PBS洗孔5次，拍干。每孔加發(fā)光底物液A和B各50μl，混勻后室溫避光放置10min。最后用化學(xué)發(fā)光分析儀測量各孔相對發(fā)光值(RLU)。繪出劑量-反應(yīng)曲線，從劑量-反應(yīng)曲線求得樣品的AFP含量。

1.4 試劑性能評估

1.4 .1 準(zhǔn)確性實驗 將研制的三批次 (批號：120618、120628、120708)AFP化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑分別用于測定AFP國家參考品 (檢測方法同上)，其結(jié)果的相對偏差應(yīng)在±10%以內(nèi)。

1.4 .2靈敏度 平行測定20孔零值校準(zhǔn)品血清，以S0+2SD作為試劑盒的最低檢測濃度。

1.4 .3精密度 平行測定兩個不同濃度(12ng/mL和120 ng/ml)的質(zhì)控血清各20孔，求出批內(nèi)和批間變異系數(shù)。

1.4 .4特異性實驗 用人血清白蛋白(10000ng/ml)、癌胚抗原(80ng/ml)、糖類抗原 125(500U/ml)、糖類抗原 15-3(500U/ml)、糖類抗原19-9(400U/ml)與研制的AFP抗體包被板進行交叉反應(yīng)檢測 (檢測方法同上)，其測定結(jié)果均應(yīng)小于2.5ng/ml。

1.4 .5穩(wěn)定性實驗 將所研制的AFP化學(xué)發(fā)光診斷試劑(批次：120708)置37℃3d后，用于AFP檢測試劑國家參考品的測定分析(檢測方法同上)，測定結(jié)果應(yīng)符合產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 與進口對照試劑比對 將研制的AFP檢測試劑(考核試劑，批次:120221)與西門子公司生產(chǎn)的AFP定量檢測試劑(對照試劑，批次:110764)同時對350份臨床樣本進行比對檢測。嚴格按照試劑盒中操作步驟進行檢測，并在試劑盒有效期內(nèi)使用。以正常人血清的AFP含量小于10ng/ml為判定標(biāo)準(zhǔn)，將臨床樣本檢測值按陰陽性結(jié)果進行統(tǒng)計分析，求出靈敏度、特異性和總符合率；并對兩種試劑的測定值進行相關(guān)性分析，求出相關(guān)系數(shù)r值?？己嗽噭┡c對照試劑檢測結(jié)果之間的一致性比較采用Kappa值進行分析。

2 結(jié)果

2.1 劑量-反應(yīng)曲線 以所配制校準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，發(fā)光值的對數(shù)為縱坐標(biāo)，用雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理，劑量-反應(yīng)曲線線性方程Y=1.0416X+3.156，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9999，表明所建立的化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測方法具有良好的劑量反應(yīng)線性關(guān)系。

2.2 準(zhǔn)確性 三批試劑 (批號：120618、120628、120708)用于測定AFP檢測試劑國家參考品，檢測結(jié)果均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) (質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及檢測結(jié)果見表1)。

2.3 穩(wěn)定性 將所研制的試劑 (批次：120708)置37℃3d后，用于AFP檢測試劑國家參考品的測定分析。測定結(jié)果表明試劑的各項性能符合產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求(見表1)。

2.4 特異性 檢測結(jié)果表明人血清白蛋白(10000 ng/ml)、癌胚抗原 (80ng/ml)、糖類抗原125(500U/ml)、糖類抗原 15-3(500U/ml)、糖類抗原 19-9(400 U/ml)的測定結(jié)果均小于2.5ng/mL，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.5 與進口對照試劑比對 以西門子的AFP試劑盒檢測結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，特異性 (陰性符合率)=(199/200)×100%=99.50%；靈敏度 (陽性符合率)=(148/150)×100%=98.7%； 總 符 合 率=(347/350)×100%=99.1%(見表 2)。與對照試劑比對，Kappa值=0.98，一致性強度最強(0.81～1.0)。兩種方法檢測結(jié)果具有良好相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r=0.9823，見圖1)。

表1 AFP檢測試劑國家參考品測定結(jié)果

表2 兩種檢測試劑350份臨床樣本AFP測定結(jié)果對比

圖1 兩種檢測試劑350份臨床樣本AFP測定值的相關(guān)性分析

3 討論

原發(fā)性肝癌患者血清AFP水平顯著高于肝硬化患者和健康體檢者，而肝硬化患者血清AFP水平又顯著高于健康體檢者。AFP水平升高對原發(fā)性肝癌及肝硬化等肝病的診斷具有重要價值，對血清AFP升高者，可通過閾值判斷患者是原發(fā)性肝癌或者肝硬化。對患者血清AFP水平進行動態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)慢性肝炎、肝硬化患者血清AFP水平升高多為一過性升高或呈反復(fù)波動性，而原發(fā)性肝癌患者多為穩(wěn)定持續(xù)性升高。朱瑜等臨床實驗結(jié)果表明血清腫瘤標(biāo)志物中AFP的檢測對于乙型肝炎相關(guān)肝癌具有診斷價值[2]。

化學(xué)發(fā)光免疫法同時具備了高靈敏度、高特異性、定量檢測范圍寬、無環(huán)境污染等優(yōu)點,而且其檢測用儀器兼容性好,價格相對便宜易于普及和推廣,因此近幾年來在國內(nèi)發(fā)展迅猛。然而,目前國內(nèi)用于化學(xué)發(fā)光免疫法測定用的試劑大都以進口試劑為主,這些試劑與所用儀器采用封閉式系統(tǒng),使得試劑與儀器必須相互依賴、相互配套,同時由于進口試劑和儀器的價格比較昂貴,也不利于在國內(nèi)的普及和推廣。因此,研制腫瘤標(biāo)志物化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑具有重要社會效益和經(jīng)濟效益。

我們采用AFP單抗包被微孔板，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的AFP抗體為二抗，結(jié)合魯米諾化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)，研制了AFP化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑并建立了檢測方法。實驗結(jié)果表明，所研制的試劑性能符合AFP檢測試劑國家參考品各項質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。試劑的批內(nèi)變異系數(shù)4.1%～5.2%、批間變異系數(shù)4.7%；試劑盒置37℃考核3d，其穩(wěn)定性良好。并且與其他的腫瘤標(biāo)志物無交叉反應(yīng)，特異性高。與進口西門子對照試劑同時檢測臨床血清樣本350份，結(jié)果表明兩種檢測方法具有良好相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r=0.9823)。以正常人血清的AFP含量小于10ng/mL為判定標(biāo)準(zhǔn)，將臨床樣本的檢測值按照陰陽性結(jié)果進行統(tǒng)計分析，結(jié)果陰性符合率99.5%、陽性符合率98.7%，總符合率為99.1%，Kappa值為0.98,兩種方法檢測結(jié)果的一致性強度為最強，表明所研制的AFP化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑與市售的進口同類產(chǎn)品同效。本文成功建立了快速、特異、敏感和穩(wěn)定的腫瘤標(biāo)志物AFP化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑并建立其檢測方法，適合在臨床上推廣應(yīng)用。

[1]汪晨,吳潔,宗晨,等.化學(xué)發(fā)光免疫分析方法與應(yīng)用進展[J].分析化學(xué),2012,40(1):3-10.

[2]朱瑜.AFP、CEA、CA199診斷乙型肝炎相關(guān)肝癌初步研究[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2011,29(5):541-542.