胰腺癌患者外周血與腫瘤組織中KRAS基因突變的研究

權(quán)紅良,于忠和

(北京軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤科，北京 100700)

KRAS(K-ras)基因突變在胰腺癌發(fā)生發(fā)展、診斷、治療及靶向藥物療效預(yù)測中均起重要的作用。目前，胰腺癌KRAS基因檢測標(biāo)本主要局限于組織，由于胰腺處于腹腔深處，活檢難度大且易發(fā)生胰漏等嚴(yán)重并發(fā)癥，臨床難以獲得組織標(biāo)本。目前KRAS檢測方法較多，但是由于費(fèi)用高、敏感度低等缺點(diǎn)致使其不適合臨床推廣。本研究采用高敏感性的高分辨率熔解曲線(high resolution melting,HRM)法檢測胰腺癌患者外周血KRAS基因突變，以探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2011年7月至2012年11月北京軍區(qū)總醫(yī)院、北京恒興醫(yī)院30例住院胰腺癌患者外周血標(biāo)本，所有患者均經(jīng)細(xì)胞學(xué)或病理學(xué)確診。其中男17例、女13例，年齡40～89歲，中位年齡62歲；吸煙9例，不吸煙21例。同時(shí)在北京軍區(qū)總醫(yī)院、北京恒興醫(yī)院、空軍總醫(yī)院、解放軍309醫(yī)院收集胰腺癌石蠟標(biāo)本25例，胰腺癌新鮮組織5例，其TNM分期為Ⅰ期10例，Ⅱ期12例，Ⅲ期4例，Ⅳ期4例；高分化導(dǎo)管腺癌13例，中低分化導(dǎo)管腺癌17例；胰頭癌17例，胰腺體尾癌10例，全胰腺癌3例。研究對(duì)象中，組織標(biāo)本與外周血標(biāo)本配對(duì)13例。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本的收集 術(shù)前或放化療前抽取患者清晨空腹外周血4 mL置于乙二胺四乙酸抗凝管中，編號(hào)后置于-80 ℃冰箱保存待測；收集胰腺癌石蠟切片置于4 ℃冰箱保存待測；收集手術(shù)切除胰腺癌新鮮組織置于濃度為5%的甲醛中保存待測。

1.2.2DNA提取 外周血DNA和石蠟切片組織DNA分別按照北京博邁德公司全血基因組DNA提取試劑盒說明書和石蠟切片組織DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行；胰腺癌新鮮組織DNA的提取是提取甲醛中保存的新鮮腫瘤組織，并用消化酶消化后參照石蠟切片組織DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3DNA濃度監(jiān)測 SMA4000微量紫外/可見分光光度計(jì)購自北京美林恒通科技有限公司。自提取的DNA樣本中，吸取1 μL樣本置于分光光度計(jì)小孔上，自動(dòng)檢測樣本中DNA濃度。

1.2.4熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀器Agilent Technologies Stratagene Mx3000P購自上海吉泰生物科技有限公司，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自北京新基永康生物科技有限公司，KRAS引物序列:正向引物(5′-3′):GGCCTGCTGAAAATGACTGAAT，反向引物(3′-5′):ATTGTTGGATCATATTCGTCCAC；設(shè)計(jì)內(nèi)參、陽性和陰性基因?qū)φ?，?duì)KRAS基因12、13密碼子突變域進(jìn)行體外擴(kuò)增。HRM是通過實(shí)時(shí)監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA染料與聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況，如突變位點(diǎn)由于不匹配雙鏈DNA在升溫過程中會(huì)先解開，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，從熒光強(qiáng)度與時(shí)間曲線上就可以判斷是否存在突變，從而實(shí)現(xiàn)定性分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用Fisher確切概率法，檢驗(yàn)外周血和腫瘤組織中KRAS基因突變的一致性采用Kappa檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1胰腺癌患者外周血及組織標(biāo)本中KRAS基因突變狀態(tài)分析 30例外周血標(biāo)本中檢測出15例KRAS基因發(fā)生突變(突變率為50%)，30例組織標(biāo)本中檢測出21例突變(突變率為70%)。外周血和腫瘤組織配對(duì)的13例標(biāo)本中，腫瘤組織存在8例突變，外周血中存在5例KRAS突變，兩者突變一致性為62.5%(5/8)，一致性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Kappa=0.562,P=0.024)，腫瘤組織KRAS基因突變陰性病例的外周血KRAS基因突變均陰性(表1)。

表1 胰腺癌外周血和組織標(biāo)本KRAS突變一致性

2.2胰腺癌患者外周血及腫瘤組織中KRAS基因突變狀態(tài)與臨床特征的關(guān)系 不同臨床特征突變率不同，經(jīng)Fisher確切概率法分析：胰腺癌外周血中的KRAS基因突變與患者的性別、年齡、吸煙史、腫瘤部位、腫瘤分期無關(guān)(P>0.05)；腫瘤組織中的KRAS基因突變率男性高于女性(P<0.05)，與患者的年齡、吸煙史、腫瘤的部位、癌細(xì)胞分化程度、分期等均無關(guān)系(P>0.05)(表2)。

表2 胰腺癌外周血和組織KRAS基因突變與臨床特征的關(guān)系

a：為突變型；b：為野生型

3 討 論

學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，KRAS基因突變是胰腺癌的早期事件[1],認(rèn)為檢測KRAS基因突變是對(duì)胰腺癌有效的早期基因診斷方法,美國已經(jīng)把KRAS基因的檢測列為消化系統(tǒng)腫瘤早期診斷的常規(guī)項(xiàng)目。Wedén等[2]發(fā)現(xiàn)，KRAS基因突變疫苗可鞏固胰腺癌手術(shù)效果，目前針對(duì)突變KRAS基因的各種基因治療均能有效抑制癌細(xì)胞生長[3-4]；KRAS基因突變也是用于預(yù)測表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑[5]和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)單克隆抗體靶向治療療效的預(yù)測因子[6-7]，運(yùn)用EGFR靶向藥物治療之前必須要進(jìn)行KRAS基因突變檢測，因?yàn)镵RAS基因突變后可以抗拒EGFR單抗而致使EGFR單抗藥物治療無效[8]。但是最新研究發(fā)現(xiàn)[9]，KRAS第13位密碼子的突變對(duì)抗EGFR抗體類藥物有治療反應(yīng)性。Bournet等[10]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),KRAS基因的突變在鑒別胰腺良、惡性疾病中也具有一定的價(jià)值。所以KRAS基因突變對(duì)于胰腺癌的早期診斷、靶向藥物療效預(yù)測、鑒別診斷等具有重要作用。

目前，胰腺癌KRAS基因檢測標(biāo)本主要局限于組織，由于胰腺癌患者70%～80%在確診時(shí)已經(jīng)失去手術(shù)的機(jī)會(huì)，且胰腺處于腹腔深處，活檢難度大、易發(fā)生胰漏等嚴(yán)重并發(fā)癥而不宜活檢，臨床難以獲得組織標(biāo)本。近年來研究者主要致力于檢測胰腺癌患者的胰液、糞便或外周血的KRAS基因突變代替檢測胰腺癌組織。一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果顯示，胰液檢測KRAS基因突變的靈敏度為61%,特異度為82%,雖然胰液KRAS基因的檢測具有比較高的敏感性和特異性，但仍有一定的假陽性率，并且行內(nèi)鏡逆行胰膽管造影檢查同時(shí)收集胰液檢查操作復(fù)雜，術(shù)后并發(fā)胰腺炎的發(fā)生率高[11]。糞便中的KRAS基因檢測無創(chuàng),國外報(bào)道胰腺癌患者糞便KRAS基因檢測的陽性率為42.3%～54.5%，與直接收集胰液相比,糞便中檢出率較低,并且部分大腸癌和大腸腺瘤糞便中也可檢出KRAS基因的突變,所以這種方法的特異性也不高。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞可脫落入外周血，然后瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡并釋放出遺傳物質(zhì)，導(dǎo)致血液中存在游離腫瘤DNA，所以若原發(fā)或轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞存在KRAS基因突變，即可從外周血游離DNA中檢測出來[12]。Mulcahy等[13]對(duì)胰腺癌患者血清的KRAS基因突變進(jìn)行了前瞻性研究,胰腺癌患者血漿DNA檢測有KRAS基因突變,并且血漿和組織中KRAS基因突變類型相同。國外學(xué)者報(bào)道，用不同方法測得胰腺癌外周血KRAS基因的突變率可高達(dá)27%～81%[13-15]。腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物也可能隨著細(xì)胞分化增殖或有效治療發(fā)生改變，所以動(dòng)態(tài)監(jiān)測外周血不失為一種代替腫瘤組織的簡單、易行的方法，且能夠動(dòng)態(tài)監(jiān)測KRAS基因狀態(tài)，其采集方便，對(duì)患者創(chuàng)傷較小，但是胰腺癌組織與血液中KRAS基因突變的一致性問題有待進(jìn)一步研究。

本研究測得胰腺癌患者外周血中KRAS基因突變率為50%，胰腺癌組織突變率為70%,其中配對(duì)樣本13例，胰腺癌組織KRAS突變陽性8例，其外周血突變陽性為5例，突變一致性為62.5%(5/8)；胰腺癌組織KRAS基因突變陰性5例，其外周血突變均為陰性。本研究外周血代替胰腺癌組織標(biāo)本檢測KRAS基因突變未出現(xiàn)假陽性，但3例出現(xiàn)假陰性，分析原因可能為：①此3例標(biāo)本分期較早，腫瘤負(fù)荷均較低，可能釋放入外周血的游離DNA少；②胰腺癌組織與外周血標(biāo)本獲取時(shí)間點(diǎn)不同，所以檢測結(jié)果可能不同。

現(xiàn)有的KRAS基因突變檢測方法主要有限制性片段長度多態(tài)性分析法、直接測序法、TaqMan 探針法、HRM法、擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(ARMS/S)法等，其中測序法是檢測基因突變的標(biāo)準(zhǔn)方法，但由于其敏感性低、操作復(fù)雜而限制了其臨床應(yīng)用，TaqMan探針法、ARMS/S法準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)，但價(jià)格昂貴[16]。本研究采用的HRM法是近年國外興起的一種全新的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法，主要原理是在聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)DNA序列的長度，鳥嘌呤和胞嘧啶的含量以及堿基互補(bǔ)性差異，直接應(yīng)用高分辨率的熔解曲線對(duì)樣品進(jìn)行分析，極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度達(dá)到對(duì)單個(gè)堿基差異的區(qū)分。正常人的血漿中存在極微量的DNA(0.01 g/L),惡性腫瘤患者血漿DNA濃度雖顯著增加,但是如果基因檢測方法靈敏度不高就會(huì)出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。國內(nèi)一個(gè)研究組率先用HRM技術(shù)從突變細(xì)胞比例低至2.5%的混合樣品中檢測出了變異基因[17]。Franklin等[18]在118例結(jié)腸癌標(biāo)本中對(duì)比了HRM法、ARMS/S和直接測序法的檢測效果，結(jié)果表明HRM法相對(duì)比較靈敏。另外有臨床試驗(yàn)證實(shí)，此方法具有高通量、高敏感性、特異性好、重復(fù)性好、操作簡便、低成本、低污染、標(biāo)本范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，適于臨床推廣[19]。

綜上所述，對(duì)胰腺癌患者外周血進(jìn)行KRAS基因檢測，標(biāo)本容易獲取，對(duì)患者創(chuàng)傷較小，適于臨床推廣，在無法獲得組織學(xué)標(biāo)本時(shí)可以用高敏感性的HRM法檢測外周血KRAS基因突變，以提高胰腺癌的早期診斷率及指導(dǎo)胰腺癌的治療，有助于改善胰腺癌患者的預(yù)后，但尚需要更大樣本的深入研究。

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