VEGF在大鼠脊髓損傷后股骨干骨痂形成過程中的表達(dá)

安 福，王永剛，劉文忠，張 先，王東敏，汪 靜,孫竹監(jiān)

(1.甘肅省中醫(yī)醫(yī)院脊柱一科，蘭州 730050； 2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030；3.甘肅省武威市涼州區(qū)第三人民醫(yī)院外一科,甘肅 武威 733000； 4.蘭州市肺科醫(yī)院放射科,蘭州 730030)

在臨床工作中，骨折是一種常見病，并且在骨折愈合過程中，出現(xiàn)骨折不愈合及延遲愈合，這是引起患者及骨科醫(yī)師關(guān)注的問題。那么，如何促進(jìn)骨折早期愈合或如期愈合，已成為廣大學(xué)者及醫(yī)務(wù)工作者急于解決的難題。在臨床中，骨科醫(yī)師發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷合并四肢骨折的患者，四肢骨折愈合的速度增快，甚至出現(xiàn)異位骨化或骨化性肌炎，這在近些年來國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)中也有許多報(bào)道[1-3]。有些學(xué)者在相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中得出，中樞神經(jīng)損傷的患者及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其他生長因子大量升高[4]。但在骨折愈合中，VEGF也起到十分重要的作用[5-6]?？梢酝茢?，在脊髓損傷伴有骨折的患者，機(jī)體全身或骨折局部可能有大量的VEGF。本實(shí)驗(yàn)證明，在脊髓損傷合并骨折的大鼠，VEGF對于骨折的愈合起著十分重要的作用。

1 材料與方法

1.1材料 取12周齡雄性大鼠40只，體質(zhì)量為250～300(272.1±13.8) g,均來自甘肅省中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,并經(jīng)過檢測均為健康大鼠，無任何疾病，隨機(jī)分為兩組，每組20只，實(shí)驗(yàn)組平均體質(zhì)量為(269.3±14.5) g，對照組平均體質(zhì)量為(275.0±12.7) g。兩組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1脊髓損傷模型制作 采取改良的Allen′s法[7]，將實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用3.6%水合氯醛300 mg/kg的劑量注射于腹腔進(jìn)行麻醉，麻醉成功后置于俯臥位。以胸椎彎曲最大處為中心，用剪刀備皮，常規(guī)消毒，剪開皮膚及皮下筋膜，于后緣逐層切開，分離肌肉，暴露棘突。由于胸椎最高點(diǎn)為T10水平，然后確定T10、T11 椎體位置。咬去T10、T11棘突及相應(yīng)椎板，充分暴露脊髓背面及兩側(cè)，實(shí)驗(yàn)組采用Allen′s法打擊設(shè)備，分別以1 g×2.5 cm、2 g×2.5 cm、3 g×2.5 cm、3 g×5 cm力致傷(數(shù)字為質(zhì)量×高度)，打擊完畢后，無菌縫合傷口。實(shí)驗(yàn)組股骨干骨折模型在脊髓損傷制備完后在同一麻醉下完成，方法同股骨干骨折模型制作。術(shù)后常規(guī)人工排尿每日2～3次，直至恢復(fù)自主膀胱。且術(shù)后3 d腹腔注射青霉素10 U預(yù)防感染。

1.2.2股骨干骨折模型制作 采取開放性股骨干骨折模型制作[7-8]，麻醉方法同上,取左股骨干外側(cè)切口，縱行切開,長約1 cm，逐層分開深筋膜，從肌肉間隙進(jìn)入暴露股骨干，鋸斷股骨干，將克氏針(直徑1 mm)一端插入骨折近端髓腔,穿出大轉(zhuǎn)子及皮膚；將克氏針另一端插入骨折遠(yuǎn)端髓腔，穿出股骨髁間及皮膚。然后將穿出皮膚的克氏針緊貼皮膚折彎，防止克氏針抽出；多余部分剪除后逐層閉合切口。

1.2.3X線檢查 所有大鼠在模型制作完成后，每周進(jìn)行股骨干X線[柯達(dá)(kodak)DR3000]檢查，觀察骨痂生長情況。

1.2.4標(biāo)本制備 分別將實(shí)驗(yàn)組、對照組大鼠從模型制作完成以后，在1周、2周、3周、4周隨機(jī)選擇5只處死，收集骨折上下段0.5 cm的骨痂，放人塑料盒，先經(jīng)4%中性緩沖甲醛液固定8 h以上，然后置于乙二胺四乙酸二鈉脫鈣液中加蓋放入40～56 ℃的溫箱，每2日換一次新鮮液體，以保證脫鈣液的效力。1～2周完成(視骨質(zhì)密度而定)。脫鈣終點(diǎn)判斷：隨時(shí)觀察脫鈣情況，用鑷子感覺脫鈣標(biāo)本已經(jīng)變軟或用大頭針試探能穿入骨密質(zhì)即可。脫鈣后標(biāo)本需流水沖洗，以去除組織中的乙二胺四乙酸二鈉。而后常規(guī)石蠟制片方法處理，切片厚4 μm，分別進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色 用10%緩沖中性甲醛固定24 h后用石蠟包埋，經(jīng)70%乙醇30 min(1次)、80%乙醇30 min(1次)、90%乙醇30 min 2次、95%乙醇30 min 2次、100%乙醇30 min 2次、二甲苯透明30 min 2 次、55 ℃石蠟中30 min 2次，用銅制模具包埋組織塊；從每塊石蠟標(biāo)本切五塊約5 μm的切片,低溫保存?zhèn)溆?，將厚? μm的組織切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60 ℃過夜；將切片浸于二甲苯中5 min 2次、100%乙醇5 min 2次、95%乙醇5 min 2次、90%乙醇5 min 2次、85%乙醇5 min 2次、75%乙醇5 min 2次、自來水沖洗、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗2次；1%甲醇雙氧水,室溫10 min,蒸餾水洗1次,0.1 mol/L PBS洗3次；切片上滴加抗原修復(fù)液,室溫10 min，0.1 mol/L PBS洗3次各5 min；切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗。切片上滴加第一抗體，4 ℃過夜，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。切片上滴加生物素化第二抗體，37 ℃20 min，0.1 mol/L PBS洗3次各5 min；切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃20 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min；二氨基聯(lián)苯胺顯色：使用二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒1 ml蒸餾水加顯色劑A、B、C各一滴，混勻，加至標(biāo)本上，顯色6 min，充分水洗；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min，充分水洗，1%鹽酸乙醇分化、1%胺水反藍(lán)、充分水洗，經(jīng)70%乙醇5 min、80%乙醇5 min、90%乙醇5 min 2次、95%乙醇5 min 2次、100%乙醇5 min 2次脫水，二甲苯透明5 min 2次，中性樹脂封片。

1.2.6結(jié)果觀察與數(shù)據(jù)處理 選擇實(shí)驗(yàn)組和對照組的陽性和陰性結(jié)果，進(jìn)行100×和400×的顯微照相，選擇有意義的組織相，經(jīng)采集、分析、讀取數(shù)據(jù)、存盤，進(jìn)行圖像分析。

計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)由CMOS(日本OLYMPUS公司)及專用軟件(美國Imaging技術(shù)公司)組成。依據(jù)陽性免疫反應(yīng)的圖像灰度選擇合適的灰度分割閾值，實(shí)現(xiàn)雙閾值分割,得到樣品的半灰度目標(biāo)圖像，以人機(jī)交互方式測定陽性免疫染色強(qiáng)度及面積。實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取30個(gè)切片，對照組隨機(jī)取20個(gè)切片，每例測5個(gè)視野。

2 結(jié) 果

2.1X線表現(xiàn) 對照組在1周、2周、3周可見骨折線明顯，4周時(shí)骨折線模糊不清，骨折周圍骨痂含量從1周至4周逐漸增加。實(shí)驗(yàn)組1周、2周、3周骨折線明顯，在第4周可見骨折線消失，骨折周圍骨痂含量1～4周逐漸增加，在第4周明顯增多，骨折基本愈合，局部增粗，骨密度增高，并且與對照組相比，明顯多于同時(shí)期的骨折端的骨痂含量(。VEGF在大鼠脊髓損傷后股骨干骨痂形成過程中的表達(dá)

圖1 對照組各時(shí)間點(diǎn)X線表現(xiàn)

圖2 實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)X線表現(xiàn)

3-13-23-33-4

圖3股骨干骨折(對照組)各時(shí)間點(diǎn)免疫組織化學(xué)表現(xiàn)(免疫組化SP法×40)

4-14-24-34-4

圖4脊髓損傷伴股骨干骨折(實(shí)驗(yàn)組)各時(shí)間點(diǎn)免疫組織化學(xué)表現(xiàn)(免疫組化SP法×40)

2.2免疫組織化學(xué)染色 術(shù)后1周，骨膜內(nèi)增殖細(xì)胞以及骨折斷端周圍肉芽組織中的成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、早期軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞胞質(zhì)中均有廣泛的VEGF陽性表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組中陽性細(xì)胞數(shù)量多于對照組，并且顯色強(qiáng)(圖3-1和圖4-1，見封三)。術(shù)后2周，上述細(xì)胞仍持續(xù)陽性表達(dá)，但間充質(zhì)細(xì)胞的陽性表達(dá)已經(jīng)開始減弱，實(shí)驗(yàn)組中陽性細(xì)胞數(shù)量多于對照組(圖3-2和圖4-2，見封三)。術(shù)后3周，成骨細(xì)胞表達(dá)持續(xù)增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)組中陽性細(xì)胞數(shù)量多于對照(圖3-3和圖4-3，見封三)。術(shù)后4周，骨細(xì)胞有表達(dá)，成骨細(xì)胞表達(dá)減弱，但實(shí)驗(yàn)組中陽性細(xì)胞數(shù)量多于對照(圖3-4和圖4-4，見封三)。

2.3VEGF在骨痂中表達(dá)結(jié)果 對照組VEGF表達(dá)從骨折第1周開始出現(xiàn)，持續(xù)到第3周達(dá)高峰，在第4周開始降低；實(shí)驗(yàn)組VEGF表達(dá)從第1周開始出現(xiàn)，并在第3周達(dá)高峰，在第4周開始降低，實(shí)驗(yàn)組中VEGF的表達(dá)較同時(shí)期顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 VEGF在骨痂中表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù) (個(gè)/視野)

實(shí)驗(yàn)組: 脊髓損傷伴股骨干骨折； 對照組: 單純股骨干骨折

3 討 論

3.1VEGF VEGF由Ferrara等[9]在1989年從小牛垂體濾泡-星狀細(xì)胞培養(yǎng)基中分離純化而來。VEGF是具有高度選擇性的一種血管內(nèi)細(xì)胞有絲分裂原，VEGF分子結(jié)構(gòu)由2條亞基間和其亞基內(nèi)的二硫鍵連接而成，是同源性二聚體糖蛋白化合物。正常生理狀態(tài)下，VEGF可選擇性地分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)中，而且在機(jī)體內(nèi)組織中均可檢測到VEGF mRNA及其蛋白的表達(dá)。

在本實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF在成骨細(xì)胞中表達(dá)明顯提高，而且VEGF的表達(dá)與脊髓缺氧呈劑量依賴關(guān)系。目前認(rèn)為，VEGF主要在增生明顯、功能活躍的組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，導(dǎo)致VEGF表達(dá)的常見因素很多，但主要是局部組織缺氧[10]。并且發(fā)現(xiàn)VEGF有多種生物學(xué)效應(yīng)：①增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性；②血管維持功能；③促進(jìn)血管生成。

3.2脊髓損傷與VEGF關(guān)系 VEGF在正常人和很多動(dòng)物的組織中表達(dá)水平較低，而且發(fā)現(xiàn)在正常成人腦和腦膜組織中VEGF少量表達(dá)。我國學(xué)者黃書嵐等[11]進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在顱腦損傷后，VEGF在腦組織中有陽性表達(dá)，并且VEGF表達(dá)率隨著腦組織損傷程度的加重而增加，表現(xiàn)為VEGF表達(dá)率與變性壞死神經(jīng)元數(shù)量之間呈正相關(guān)；但是在顱腦損傷程度進(jìn)一步加重時(shí)，即神經(jīng)元開始大量壞死時(shí)，VEGF表達(dá)開始明顯下降，這時(shí)VEGF表達(dá)率與變性壞死神經(jīng)元數(shù)量之間呈負(fù)相關(guān)。

關(guān)永林等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓急性損傷12 h時(shí)，VEGF即可在大鼠脊髓的軟脊膜、脊髓內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，1 d后達(dá)到高峰，并持續(xù)到3 d，7 d時(shí)開始下降。當(dāng)脊髓急性損傷時(shí)可上調(diào)VEGF在脊髓血管內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)VEGF可能通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長對損傷神經(jīng)元起一定的保護(hù)作用?？傊?，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性損傷時(shí)，VEGF會(huì)大量的表達(dá)，這可能是本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組骨痂中VEGF的表達(dá)明顯多于對照組的原因。

3.3骨折與VEGF關(guān)系 骨折愈合是一個(gè)多步驟的過程，涉及幾種類型的細(xì)胞遷移、增殖、分化、激活。骨形成可以通過兩個(gè)不同的過程發(fā)生，如果骨折段穩(wěn)定，或在一些頭骨和面部骨骼發(fā)展過程中，骨髓間充質(zhì)前體細(xì)胞分化，直接進(jìn)入骨形成成骨細(xì)胞的進(jìn)程，稱為膜內(nèi)骨化；在生物力學(xué)不穩(wěn)定的環(huán)境中，或在長骨和椎體的發(fā)展過程中，骨形成通過軟骨成骨這個(gè)過程稱為軟骨內(nèi)骨化。骨愈合的過程中有如成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生的生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、VEGF和骨形態(tài)發(fā)生蛋白等這些特殊的生長因子的表達(dá)，在骨愈合中可能發(fā)揮的作用。事實(shí)上，這些因子中，除VEGF外，其他的因子在動(dòng)物模型中刺激的骨愈合已被證明。因此，骨折骨痂中包含的因素很多，通過協(xié)調(diào)血管和骨生成的動(dòng)態(tài)平衡來促進(jìn)骨愈合。本實(shí)驗(yàn)中X線檢查顯示，骨折端的骨折生長，脊髓損傷伴股骨干骨折明顯高于單純股骨干骨折，這說明在脊髓損傷時(shí)，產(chǎn)生了一種能促進(jìn)骨折愈合的因子，或是促進(jìn)骨折愈合的因子在脊髓損傷時(shí)明顯增多。本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)結(jié)果證實(shí)，骨折端骨痂中的成骨細(xì)胞中VEGF表達(dá)明顯增多，并且脊髓損傷伴股骨干骨折中的表達(dá)明顯高于單純股骨干骨折，在損傷第3周為一個(gè)表達(dá)高峰期。說明在骨折愈合過程中微血管的數(shù)量和VEGF表達(dá)呈同向變化。

骨折部位微血管重建經(jīng)歷了3個(gè)階段，即① 形成期：骨折早期(3 d以內(nèi))，骨折部位血腫形成，其內(nèi)僅有少量新生血管；② 高峰期：骨折中期(骨折后3～28 d)，編織骨骨痂形成，有大量新生血管長入骨痂；③ 重建期：骨折晚期(骨折42 d以后)。編織骨向板層骨轉(zhuǎn)化，骨痂新生血管數(shù)量減少并逐漸轉(zhuǎn)為正常形態(tài)。

骨折愈合是一個(gè)獨(dú)立的再生過程，除其他因素之外，血管生成在骨折愈合過程中占據(jù)主要的作用。在體外的幾個(gè)研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF在動(dòng)脈、靜脈中促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成，誘發(fā)新的血管生成，血管生成在軟骨內(nèi)成骨起到主要作用，在血管生成過程中，無血管的軟骨組織逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒艿墓墙M織[13]。VEGF能夠誘導(dǎo)新生血管的生成，所以在骨折愈合過程中有著重要的地位。

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