刃天青-酵母混合試劑快速鑒定小麥種子活力研究

劉春香, 胡 畔, 張君玉, 趙華恬

(濰坊學院 山東省高校生物化學與分子生物學重點實驗室, 山東 濰坊 261061)

小麥是一種在世界各地廣泛種植的禾本科植物，是世界上總產(chǎn)量第二的糧食作物，僅次于玉米。目前，我國耕地面積難以增加，而人口日益增長，糧食的穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)顯得尤為重要。良種是提高作物產(chǎn)量及生產(chǎn)率的最經(jīng)濟有效的措施，且小麥的精密播種機械大量使用[1],人工操作日漸減少，這就要求優(yōu)良小麥品種要具有高活力，以確保田間整齊出苗，減少人工間苗和補苗，保障糧食穩(wěn)產(chǎn)。種子活力是確保在廣泛的田間條件下能夠出苗，并長成健壯幼苗的重要指標[2]。有效的活力測定方法比種子標準發(fā)芽率更能說明種子質(zhì)量的優(yōu)劣[3-4]。

雖然國際上有許多測定種子活力的方法[5]，各有其優(yōu)缺點。依賴發(fā)芽的檢測方法消耗時間長，快速測定如電導率測定[2]、TTC 定量測定、丙二醛含量測定等活力檢測方法受條件約束，有的檢測復雜，重現(xiàn)性不好，有些效果不穩(wěn)定。因此有必要探索一種快速可靠的方法，用來快速、無損傷地測定小麥種子活力。Tai Gi Min等[6-7]發(fā)明的刃天青顯色法，簡單、快速、可靠，已經(jīng)應(yīng)用于十字花科植物種子活力的檢驗。刃天青的鈉鹽溶液為藍色，有輕微毒性，是一種氧化還原酶指示劑，可被還原而褪色，在食品研究中廣泛用來檢查需氧細菌的含量，在缺氧環(huán)境下由藍色變?yōu)榉凵?，最終變?yōu)闊o色[8]。最近的研究還發(fā)現(xiàn)刃天青可以檢測細胞增殖、細胞活力和細菌數(shù)量及對輻射的耐受性[9-11]。

種子在衰老過程中其活力不可避免地會有不同程度的下降。衰老主要表現(xiàn)為氧化損傷和細胞膜損傷。膜損傷導致種子內(nèi)含物如可溶性糖、氨基酸和電解質(zhì)外滲。電導率測定活力就是基于膜損傷的原理，種子中滲漏的各種物質(zhì)的量和種子活力的損失程度是成正相關(guān)的[12-13]，然而用電導率測定結(jié)果不夠敏感。本研究主要探討刃天青顯色法是否可以快速、準確地進行小麥種子活力的檢測。

1 材料與方法

1.1 種子老化方法

在種子老化箱中采用41℃、相對濕度為90%的人工老化方法處理小麥原種53646種子，分別處理0、3、6 d，老化后室內(nèi)自然干燥后使用。

1.2 標準發(fā)芽實驗

隨機分別各取3份老化0、3、6 d的小麥種子，按照標準發(fā)芽實驗條件進行，3次重復，每天觀察記載發(fā)芽情況，第8天末次計數(shù)后對幼苗稱量，按照文獻[2]的方法計算發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

1.3 刃天青-酵母混合試劑的配制

將蒸餾水調(diào)節(jié)至pH值7.0，預熱至30 ℃，用電子天平稱取刃天青鈉(購自上海生工生物技術(shù)公司)試劑0.002 5 g于1 mL離心管中，加入1 mL蒸餾水溶解制成原液，移入容量瓶定容至25 mL；用電子天平稱取干酵母0.025 g于1 mL離心管中，并加入1 mL蒸餾水溶解制成原液，移入容量瓶定容至25 mL；將兩種試劑混合均勻(該試劑需要現(xiàn)配現(xiàn)用)成刃天青-酵母混合試劑(以下簡稱刃天青溶液)。

1.4 顯色條件的探索與顯色后種子處理

將配置好的刃天青溶液用移液器注入平底帶蓋96-孔板，第1批每孔注入180 μL，第2批每孔注入160 μL；然后用鑷子選取均勻完好的小麥種子放入板孔中，并且保證刃天青溶液完全浸沒種子。小麥種子在孔板中的分布為：老化0 d(未經(jīng)老化處理)位于1—4列，老化3 d位于5—8列，老化6 d位于9—12列，每列8行，每個樣品32個孔。將恒溫培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為35 ℃，共做3個時間處理，分別用刃天青溶液浸泡5 h、5.5 h、6 h，每處理一個96孔板。

保溫浸泡到時間后，取出96孔板，按順序取出小麥種子，將96孔板迅速放入伯樂model680型酶標儀內(nèi)于570 nm進行吸光度測定，并拍照。先在發(fā)芽紙上用鉛筆標出板孔位置號，將每個位置的小麥種子用清水漂洗后放入發(fā)芽盒相應(yīng)位置，按標準發(fā)芽實驗方法進行發(fā)芽，每天觀察記載，至第8 d末次計數(shù)完。

1.5 統(tǒng)計分析

用Excel進行數(shù)據(jù)整理，并用其中的函數(shù)計算相關(guān)系數(shù)，對標準發(fā)芽實驗參照文獻[14]的方法做多重比較計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 刃天青溶液與乙醇和葡萄糖的顯色反應(yīng)

呼吸代謝的底物為葡萄糖，酒精是無氧呼吸的一種產(chǎn)物。為確定種子是否有外滲有機物參與酵母無氧呼吸和變色反應(yīng)，本研究用不同濃度的乙醇和葡萄糖進行了顯色反應(yīng)。從圖1可以看出：藍紫色的刃天青溶液在體積分數(shù)為5%～0.01%的乙醇中作用2 h后，溶液基本會呈現(xiàn)淺粉色，且這一顯色反應(yīng)在0.05%的低濃度下完全可以發(fā)生；在0.5～0.000 1 mol/L濃度范圍的葡萄糖溶液中刃天青溶液都變成粉色，濃度較低時顯略帶淺藍的粉色，較高時為粉色。乙醇、葡萄糖等有機物是使刃天青溶液發(fā)生反應(yīng)變成藍粉色、粉色或淺粉色的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖1 刃天青溶液中添加乙醇、葡萄糖反應(yīng)2 h后的變色情況

2.2 標準發(fā)芽實驗的種子活力分析

種子活力可以通過發(fā)芽實驗后的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等進行度量。通過老化處理后小麥種子的標準發(fā)芽實驗結(jié)果見表1，由表1可見老化3 d種子的發(fā)芽率并未顯著下降，但活力指數(shù)顯著下降，老化種子的活力明顯低于未老化種子，老化6 d的種子的全部指標顯著低于對照。

表1 不同老化處理小麥種子的活力狀況

注：同一列中，相同字母表示5%水平差異不顯著，不同字母代表5%水平差異顯著。

2.3 刃天青溶液的適當體積

從標準發(fā)芽實驗可知，老化3 d的種子活力顯著低于未老化的種子。從圖2可以看出，老化0、3、6 d的小麥種子在180 μL刃天青溶液里的板孔都呈現(xiàn)較深的藍色，變粉色和無色的板孔數(shù)量較少，與種子對應(yīng)的發(fā)芽率相關(guān)度不高；而在160 μL刃天青溶液里，未經(jīng)老化處理的種子所在板孔較多，老化3 d、6 d的種子所在板孔呈粉紅色、淺藍色比例明顯增加，與表1得出的種子活力參數(shù)相關(guān)性顯著。因此，160 μL是適宜的顯色體積，過小的顯色體積不能浸沒小麥種子。

圖2 浸泡保溫5.5 h的180 μL刃天青溶液和160 μL刃天青溶液的比較

2.4 刃天青溶液的適宜保溫浸泡時間

隨著種子在刃天青溶液中保溫浸泡時間的延長，種子內(nèi)含物外滲的量逐漸增加。圖3顯示，保溫浸泡時間過短(5 h)，各個處理間差異不夠明顯，低活力種子藍色比例過高；保溫時間過長(6 h以上)，活力高與活力低的種子藍色都變淺、開始變粉，甚至無色，老化0、3、6 d的小麥種子差異不明顯。因此5.5 h(見圖2(b))是適宜的保溫時間，在此溫度下，高活力種子普遍呈藍色，低活力種子多數(shù)呈粉色或無色；而小于5.5 h時雖然各處理間通過吸光度值可以顯示出差異，但肉眼觀察辨別難度較大。

圖3 浸泡保溫5 h和6 h的比較

2.5 經(jīng)種子浸泡后刃天青溶液的平均吸光度與種子活力的關(guān)系

用刃天青溶液浸泡老化小麥種子后溶液的平均吸光度與浸泡時間關(guān)系曲線見圖4。

圖4 不同老化處理時間刃天青溶液在570 nm的平均吸光度變化曲線

高活力種子與低活力種子相比，細胞膜損傷普遍較小，但都會隨種子吸脹時間(即保溫浸泡時間)的延長，滲漏物質(zhì)增加。從圖4可以看出，在刃天青溶液中，小麥種子隨著35 ℃下吸脹時間的延長，滲漏物質(zhì)增加，從而使刃天青溶液在570 nm的吸光度下降，無論未老化還是老化的種子都有這一趨勢；未老化的高活力種子平均吸光度明顯高于老化3、6 d的低活力種子，吸脹5～6 h的3組數(shù)據(jù)中都顯示這一特點，說明種子滲漏物質(zhì)與不同老化處理間存在顯著的差異，通過這一差異可以反映種子活力的高低。

經(jīng)刃天青溶液浸泡處理的種子在570 nm處的吸光度與發(fā)芽率和活力指數(shù)的相關(guān)關(guān)系見表2(表2中R為相關(guān)系數(shù))。每粒種子經(jīng)過刃天青溶液浸泡后都會發(fā)生顏色變化，用570 nm的吸光度值可以將顏色變化以數(shù)據(jù)的形式表現(xiàn)出來。由表2的數(shù)據(jù)可知，無論將保溫5 h、5.5 h還是6 h，經(jīng)過刃天青溶液浸泡后的小麥種子再做發(fā)芽實驗，其發(fā)芽率與對應(yīng)的板孔中溶液平均吸光度均呈極顯著正相關(guān)，說明同一區(qū)域板孔顏色的均值可以反映種子活力水平的高低。將刃天青溶液平均吸光度與小麥種子經(jīng)過標準發(fā)芽實驗計算的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)進行比較分析發(fā)現(xiàn)，浸泡5.5 h和6 h的平均吸光度均與發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)呈顯著正相關(guān)，但浸泡時間過短，相關(guān)性不顯著。說明以平均吸光度反映種子活力，且5.5 h、6 h均為適宜的反應(yīng)時間。

表2 刃天青溶液的平均吸光度與種子發(fā)芽率和活力間的指數(shù)相關(guān)關(guān)系

注：*表示顯著相關(guān)，**表示極顯著相關(guān)。

2.6 不同活力種子與刃天青溶液顏色的關(guān)系

顏色可以通過肉眼觀察，不必動用儀器設(shè)備，通過顏色變化來衡量種子活力高低是一種簡便的方法。種子在刃天青溶液中經(jīng)過一段時間的保溫浸泡后，顏色均發(fā)生了不同程度的變化。對呈藍色的板孔數(shù)與對應(yīng)區(qū)域的種子發(fā)芽率，以及標準發(fā)芽實驗各處理種子的標準發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)做相關(guān)分析，其相關(guān)系數(shù)見表3。保溫浸泡5 h和5.5 h的藍色板孔數(shù)與其對應(yīng)區(qū)域的發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)，且保溫5.5 h的相關(guān)性達到極顯著水平，說明5.5 h為最佳保溫浸泡時間，通過藍色孔數(shù)多少可以反映其發(fā)芽率的高低；由標準發(fā)芽實驗得到的種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均與5.5 h藍色板孔數(shù)呈顯著正相關(guān)。綜合以上結(jié)果可知，通過反應(yīng)5.5 h后的藍色孔數(shù)多少可以反映種子活力的高低，而反應(yīng)6 h不適宜肉眼觀察判斷活力大小。

表3 種子質(zhì)量與刃天青溶液藍色板孔數(shù)的關(guān)系

2.7 小麥種子經(jīng)刃天青溶液浸泡后的發(fā)芽情況

小麥種子經(jīng)刃天青溶液浸泡后的發(fā)芽情況見圖5—圖8。

圖5 未老化處理小麥種子浸泡5 h后發(fā)芽結(jié)果

圖6 老化3 d小麥種子浸泡5 h后發(fā)芽結(jié)果

一般高活力的種子細胞膜修復能力強，多數(shù)種子經(jīng)刃天青顯色后均呈藍色，發(fā)芽后幼苗茁壯，如圖5和圖8左側(cè)所示，圖8中有些板孔雖呈現(xiàn)粉紫色，如A3、G3、C2等，這些孔中的小麥雖然多數(shù)發(fā)芽較好，但籽粒明顯變黑，個別不能發(fā)芽。老化3 d(圖6和圖8中部區(qū))板孔顏色和發(fā)芽情況的比較可以看出，A6、A7、A8、B6、B7均呈粉色或無色，這些種子最終都沒有發(fā)芽。老化6 d的C9、G11、B10沒有發(fā)芽，種皮明顯變，板孔顏色較淺，藍色孔的種子基本能發(fā)芽(見圖7和圖8右側(cè))。從上面的比較可以看出，種子在板孔中的顯色情況說明了種子膜的完好程度，總體上與發(fā)芽呈對應(yīng)關(guān)系，也存在少部分不符合的現(xiàn)象。

圖7 老化6 d小麥種子浸泡5 h后發(fā)芽結(jié)果

圖8 種子在板孔內(nèi)的顯色情況

2.8 刃天青溶液對小麥種子發(fā)芽的毒性分析

從標準發(fā)芽實驗和浸泡后發(fā)芽實驗的比較(見圖9)可知，未老化的高活力種子發(fā)芽率沒有受到刃天青溶液的影響，而低活力種子(老化3 d、6 d)發(fā)芽率則顯著地受到影響，發(fā)芽率降低幅度大。另一方面，從小麥種子浸泡后的胚周圍顏色可以看出(見圖10)，吸脹后活躍的種子胚對刃天青的進入有一定的阻礙作用，滲透較少，而周圍的組織則顯示了明顯的刃天青還原后的顏色(紅色)，說明刃天青已經(jīng)進入了胚周圍的組織。圖10的第9—12列(老化6 d的種子)可知，其變色總體較淺，說明胚周圍組織還原力較弱。以上兩方面說明，刃天青對小麥種子有一定的毒性，高活力的種子可以克服其影響，不影響后續(xù)發(fā)芽，而低活力的種子不能完全克服，發(fā)芽率嚴重下降，種子浸泡后的發(fā)芽率也是衡量種子活力高低的重要依據(jù)。

圖9 小麥種子標準發(fā)芽率與浸泡后發(fā)芽率的比較

圖10 小麥種子經(jīng)刃天青溶液浸泡6 h后胚周圍的變色情況

3 討論

刃天青溶液顏色變淺、變粉說明從老化了的種子中流出的溶質(zhì)使刃天青發(fā)生反應(yīng)而減少。那么，能誘發(fā)變色反應(yīng)的溶質(zhì)是什么呢？種子中滲出的物質(zhì)不僅有揮發(fā)性物質(zhì)，還有可溶性糖、氨基酸、電解質(zhì)等多種物質(zhì)[12]。本研究將葡萄糖和乙醇加入刃天青溶液中，發(fā)現(xiàn)兩種物質(zhì)均能使藍色變?yōu)榉凵?，說明乙醇和葡萄糖都可以誘發(fā)變色反應(yīng)，酵母在其中的作用是利用種子中滲漏的有機物進行呼吸代謝，從而產(chǎn)生還原力。Deborah A 等[8]、Guerin 等[15]認為刃天青在還原力的作用下脫氧產(chǎn)生粉色的物質(zhì)——試鹵靈(rezorufin)，試鹵靈繼續(xù)得到氫和電子可以變成無色化合物(二氫試鹵靈)，從而使溶液變成無色。李靈芝等[16]認為小麥浸泡出來的可溶性糖與種子活力密切相關(guān)，Kataki P K等[17]認為呼吸代謝的副產(chǎn)物乙醇，其產(chǎn)量是種子質(zhì)量的指示劑，人工老化可以加速呼吸代謝副產(chǎn)物乙醇的形成[7]，加速種子質(zhì)量的劣變。

在本實驗中也發(fā)現(xiàn)，種子在刃天青溶液中浸泡保溫6 h后多數(shù)孔呈現(xiàn)淺藍色、淺粉色或無色，說明隨著浸泡保溫時間的延長，種子中的滲出物質(zhì)增多，經(jīng)過酵母的呼吸代謝最終將刃天青還原為二氫試鹵靈而失去顏色[8]。因此，浸泡保溫時間是關(guān)鍵因素，浸泡保溫時間越長，褪色越明顯；浸泡保溫時間短，則多數(shù)種子不變色，因此要篩選適宜的浸泡保溫時間以區(qū)分不同活力的種子。本研究認為以平均吸光度反映種子活力，5.5～6 h是適宜的浸泡保濕時間，從板孔顏色與發(fā)芽率的相關(guān)系數(shù)和與種子活力的相關(guān)系數(shù)看，5～5.5 h是適宜的反應(yīng)時間，從平均吸光度和顏色綜合考慮，5.5 h是最佳浸泡時間。Tai Gi Min等[6]則認為4h是蘿卜種子的最佳反應(yīng)時間，可能是不同種子滲出物質(zhì)的速度和多少有差異導致的。

細胞滲出物質(zhì)多少與種子活力密切相關(guān)，它反映了膜的自我修復能力[4,16]。隨著吸脹時間(即浸泡保溫時間)的延長，有機物質(zhì)滲漏到溶液中的量逐漸增加。在同一反應(yīng)時間，種子滲漏物質(zhì)快慢即種子細胞膜滲透性大小是反映種子差別的重要因素，有研究認為老化時間越長，細胞膜的損壞越嚴重，滲出物質(zhì)越多[18]。本研究依據(jù)上述理論進行種子活力的刃天青變色檢測。種子發(fā)芽與否是綜合因素決定的[4]，就單個種子而言，細胞膜滲漏物質(zhì)多，只是活力差的一種表現(xiàn)，有的種子即使細胞膜通透性較高也能發(fā)芽，而有些種子因為內(nèi)部某種重要因素導致不能發(fā)芽，其膜的通透性也有高有低。因此根據(jù)單個板孔的顏色判斷種子是否發(fā)芽有時是不準確的，但多數(shù)種子的平均滲漏水平可以反映這批種子的平均活力。本研究的結(jié)果證實，通過刃天青溶液的顏色變化比例能夠推斷小麥種子活力。

老化后低活力的小麥種子經(jīng)刃天青溶液浸泡后的發(fā)芽率與未浸泡的發(fā)芽率差異顯著，造成這種差異的原因可能是刃天青具有輕微毒性，活力高的未老化種子在發(fā)芽過程中能克服其毒性，而活力低的種子則較難克服，一部分種子因此不能發(fā)芽。這與Tai Gi Min等[6]認為的刃天青檢測對種子無毒是相矛盾的，其原因可能是刃天青毒性較小，且沒有與標準發(fā)芽實驗結(jié)果進行比較。是否可以依據(jù)這種弱毒性來度量種子活力的高低有待進一步研究，本實驗認為刃天青溶液浸泡后的種子發(fā)芽率與種子活力高低有相關(guān)性。

總之，在嚴格掌握浸泡條件和時間的基礎(chǔ)上，采用96孔板刃天青-酵母試劑鑒定小麥種子活力具有快速、顏色變化簡單、無損傷、準確的優(yōu)點。如果能有吸光度檢測儀器，則測定結(jié)果更為客觀、可靠。

[1] 唐慶海, 趙慶城, 馬淑英. 我國機械播種技術(shù)與播種機械發(fā)展概況與趨勢[J]. 河北農(nóng)業(yè)技術(shù)師范學院學報, 1994,8(3):59-64.

[2] 顏啟傳. 種子檢驗原理和技術(shù)[M]. 浙江：浙江大學出版社, 2001.

[3] 埃米爾·扎曼·可汗，哈馬永恩·可汗，羅茲納·可汗, 等. 通過活力測試對小麥種子批質(zhì)量進行等級區(qū)分并預測其田間出苗率[J].馬志強，譯.種子, 2010,29(8)：129-132.

[4] 孫群, 王建華, 孫寶啟. 種子活力的生理和遺傳機理研究進展[J].中國農(nóng)業(yè)科學, 2007,40(1):48-53.

[5] 杜清福,賈希海,律保春,等.不同類型玉米種子活力檢測適宜方法的研究[J].玉米科學, 2007,15(6):122-127.

[6] Tai Gimin, Woo Sikkang. A Simple, Quick and Nondestructive Method for Brassicaceae Seed Viability Measurement with Single Seed Base Using Resazurin[J]. Hort Environ Biotechnol,2011,52(3):240-245.

[7] Tai Gimin. Detection of Ethanol Released from Aged Radish (Raphanus sativus L.) Seeds Using Resazurin[J]. Hort Environ Biotechnol,2012,53(1):66-71.

[8] Dimitar Karakashev1, Danka Galabova1,Ivan Simeonov.Simple and rapid test for differentiation of aerobic from anaerobic bacteria[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2003(19):233-238.

[9] Kavitha Murugan , Vidhya V I. Differential growth inhibition of cancer cell lines and antioxidant activity of extracts of red, brown,and green marine algae[J]. In Vitro Cell Dev Biol-Anima, 2013,49:324-334.

[10] Xiao Jing, Zhang Ying, zheng Jian，et al. Monitoring of Cell Viability and Proliferation in Hydrogel-Encapsulated System by Resazurin Assay[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2010,162:1996-2007.

[11] Deborah A Hudman , Neil J Sargentini. Resazurin-based assay for screening bacteria for radiation sensitivity[J]. Hudman and Sargentini Springer Plus, 2013,2(1):55.

[12] Abdul-Baki A A, Anderson J D. Viability and leaching of sugar from germinating Barley[J]. Crop Sci, 1970,10:31-34.

[13] Dadlani M, Agrawa P K. Factors influencing leaching of sugar and electrolytes from carrots and okra seeds[J]. Scient Hort, 1983,19:39-44.

[14] 馬育華.田間試驗和統(tǒng)計方法[M].2版. 北京：農(nóng)業(yè)出版社, 1993.

[15] Guerin T F, Mondido M, McClenn B, et al. Application of resazurin for estimating abundance of contaminant-degrading micro-organisms[J]. Letters in Applied Microbiology,2001,32(5):340-345.

[16] 李靈芝, 陳叔平, 盧新雄,等. 非破壞性方法測定小麥種子活力研究[J]. 華北農(nóng)學報, 2002,17(2):75-81.

[17] Kataki P K, Taylor A G. Ethanol, a respiratory by product:An indicator of seed quality[M]//Ellis R H, Black M, Murdock A J, et al. Basic and applied aspects of seed biology Boston：Kluwer A cademic Publishers,1997:421-427.

[18] Chen Wenbin, Zhao Kentian. Cellular substance exudation and seed vigour[J]. J Northeast For Univ,1992, 3(1):37-41.