文蛤蛋白水解制備抗氧化活性肽的研究

宋文靜，白仁奧，何傳波，魏好程，馬 英，熊何健

(1.集美大學 生物工程學院，福建 廈門 361021；2.集美大學 水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021)

生物活性肽是介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間的分子聚合物，由天然氨基酸以不同的組成和排列方式構(gòu)成，分子質(zhì)量一般小于 6 000 u，在空間構(gòu)象上比較松散，是一類對生物機體的生命活動有益或具有特定生理作用的多功能化合物[1].許多生物活性肽具有良好的理化性質(zhì)，使得它們在一些應用上比氨基酸和蛋白質(zhì)更加廣泛.作為營養(yǎng)物質(zhì)，一些小肽的吸收速率比同一組成的氨基酸快，而且多肽溶液與相對應的氨基酸溶液相比較，具有較低的滲透壓，口服時不易引起腹瀉.多肽良好的水溶性和易吸水的特性，可以作為食品添加劑中優(yōu)良的保濕劑.另外，生物活性肽具有多方面的生物活性功能，如抗微生物、降血壓(ACE抑制)、抗氧化、細胞免疫調(diào)節(jié)和腫瘤抑制活性[2-6].

文蛤是我國主要的灘涂經(jīng)濟貝類之一，富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物以及鈣、鉀、鎂、磷、鐵等多種人體所需的礦物質(zhì)[7].近年來的研究表明，文蛤含有多種天然活性物質(zhì)，具有多方面的生理調(diào)節(jié)功能.文蛤中多糖類物質(zhì)具有增強免疫和調(diào)節(jié)血糖的功效，文蛤中天然多肽和蛋白質(zhì)也表現(xiàn)出較強的腫瘤抑制活性、抗氧化活性、ACE酶抑制活性等[8-11].

本研究通過用蛋白酶對文蛤蛋白進行水解，制備抗氧化活性肽，提高文蛤的資源利用率和經(jīng)濟附加值，有利于促進文蛤養(yǎng)殖、加工產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活文蛤，購于廈門市集美區(qū)，-18 ℃冷凍4 h后取肉、去內(nèi)臟，絞成肉糜，分裝后于-18 ℃凍存.

復合蛋白酶(Protamex)、中性蛋白酶(Neutrase)和堿性蛋白酶(Alcalase 2.4 L)購于諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；風味蛋白酶(Flavourzyme)和木瓜蛋白酶(Papain)，購于廣西龐博生物工程有限公司.福林酚試劑，甲醛，乙酸乙酯，TFA等所用化學試劑無特殊說明，都為分析純(AR).

UDK132自動凱氏定氮儀：意大利VELP公司；Lab Scale Millipore超濾系統(tǒng): Millipore；Ultimate 3000 高效液相色譜儀：DIONEX；4800 型質(zhì)譜儀：Applied Biosystem.

1.2 實驗方法

1.2.1 水解液多肽粉的制備

文蛤肉用復合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶和木瓜蛋白酶在其最佳水解條件下分別水解1～5 h，85 ℃滅酶15 min，冷卻后 5 000 r·min-1離心20 min，取上清液冷凍干燥，收集多肽粉凍存于-20 ℃冰箱.

1.2.2 多肽粉分子量分布的測定

HPLC分析條件：DIONEX Ultimate 3 000 HPLC，TSK gel G 2 000 SWXL( 7.8 mm×300 mm)凝膠柱，流動相為V(乙腈)∶V(超純水)∶V(TFA)=45∶55∶0.1，流速為0.5 mL/min，檢測波長為220 nm.

1.2.3 DPPH自由基(DPPH·)清除活性的測定

用95%乙醇配制濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液，取2 mL一定濃度的樣品溶液，加入2 mL上述濃度的DPPH溶液，震蕩混勻，避光室溫放置30 min，在517 nm測定吸光值，記為Ai；對照組取2 mL 95%乙醇加入2 mL DPPH溶液，吸光值記為Ac；2 mL一定濃度的樣品溶液加入2 mL 95%乙醇混勻后測定的吸光值記為Aj；以2 mL蒸餾水加2 mL 95%乙醇調(diào)零.

建議給涉農(nóng)企業(yè)和人員建立單獨的“數(shù)據(jù)采集平臺”，將所有涉稅信息進行上傳，有關(guān)部門信息共享，工作人員會比較迅速和準確地進行處理，及時做出反應和判斷，做好稅收管理各項工作，提升執(zhí)行力度和速度。涉農(nóng)企業(yè)及人員也應盡量配合“平臺”運轉(zhuǎn)，按照要求及時登錄“平臺”，必要時機關(guān)指派專人協(xié)助完成此項工作，將票據(jù)和數(shù)據(jù)等整理后上傳平臺并做好相關(guān)信息登統(tǒng)工作。合理、科學地運用現(xiàn)代化技術(shù)進行稅收管理，既能更加快速地通知企業(yè)、人員享受最新的稅收優(yōu)惠政策，也強化了稅收管理力度，打擊非法偷逃稅行為，共同營造公平公正的納稅環(huán)境，保護涉農(nóng)企業(yè)和人員的合法權(quán)益。

1.2.4 超濾膜分離抗氧化多肽組分

將制備的文蛤多肽粉用超純水溶解，配制多肽溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾.然后依次過截留分子質(zhì)量(MWCO)為8 ku和截留分子質(zhì)量為5 ku的超濾膜，將木瓜蛋白酶分成分子質(zhì)量大于8 ku，5 ku至8 ku和小于5 ku 3部分，并將其分別凍干，測定各個組分在1 mg·mL-1質(zhì)量濃度下對DPPH自由基的清除率.

1.2.5 Sephadex G-25凝膠色譜柱分離抗氧化多肽組分

將處理過的葡聚糖凝膠Sephadex G-25裝入2.5 cm×60 cm玻璃柱，用蒸餾水過夜平衡，將DPPH清除活性最高的活性肽超濾組分用超純水溶解，配制多肽溶液，并經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾、上柱，用蒸餾水以60 mL/h流速洗脫，每管收集4 mL洗脫溶液，將收集的組分用紫外可見光分光光度計測定其280 nm處吸光度，并繪制吸光度曲線，按照先后順序收集洗脫峰，冷凍干燥，并測定其DPPH·清除率.

1.2.6 RP-HPLC分離抗氧化多肽

將DPPH·清除率最高的Sephadex G-25凝膠分離組分用超純水溶解，配制多肽溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，用高效液相色譜儀DIONEX-Ultimate 3000(VWD-3400RS檢測器)進行進一步地分離純化[16].分離純化條件如下：色譜柱Waters SunFire C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，上樣量100 μL，流速0.6 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長220 nm，線性梯度洗脫為乙腈(含0.1%TFA)5%至35%，洗脫54 min.收集各個組分峰，冷凍干燥，并測定各個組分峰的DPPH自由基清除率.

1.2.7 文蛤抗氧化多肽相對分子質(zhì)量測定、結(jié)構(gòu)鑒定

完成一級MS后，直接選擇與對照基質(zhì)有差異的肽段進行MS/MS分析，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS,Applied Biosystem 4800，USA)對抗氧化肽一級結(jié)構(gòu)進行分析鑒定[13].

1.2.8 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)都以平均值和標準偏差的形式表示，每個實驗重復3次，結(jié)果采用 SPSS 軟件進行方差分析(ANOVA)，P<0.05的顯著水平結(jié)果被采用.

表1 5種蛋白酶不同酶解時間水解產(chǎn)物的DPPH·清除率

2 結(jié)果與分析

2.1 5種蛋白酶水解產(chǎn)物的DPPH·清除活性

表1比較了5種蛋白酶不同酶解時間水解產(chǎn)物的DPPH·清除率(%)，樣品測定質(zhì)量濃度為1 mg/mL.結(jié)果顯示，5種蛋白酶水解產(chǎn)物清除DPPH自由基強弱順序依次是：木瓜蛋白酶(Papain)>堿性蛋白酶(Alacalase 2.4 L)>風味蛋白酶(Flavourzyme)>中性蛋白酶(Neutrase)>復合蛋白酶(Protamex)，其中，木瓜蛋白酶4 h水解產(chǎn)物的DPPH·清除率最高，達55.74%，故選用該水解產(chǎn)物進行后續(xù)抗氧化活性肽的篩選.

2.2 水解產(chǎn)物分子量分布

以細胞色素C、aprotinin、GSSG、GSH為標準品，洗脫體積為橫坐標，標準品的分子質(zhì)量的對數(shù)值為縱坐標作標準曲線，結(jié)果如圖1所示，線性良好.

木瓜蛋白酶在其最佳水解條件下水解文蛤蛋白4 h，測定其水解產(chǎn)物中肽的分子質(zhì)量分布(見表2).結(jié)果表明，分子質(zhì)量低于 5 000 u的肽占95%以上.

2.3 抗氧化活性組分的分離純化

2.3.1 超濾法分離純化抗氧化多肽

木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物依次過截留分子質(zhì)量(MWCO)為8 ku和5 ku的超濾膜，獲得分子質(zhì)量大于8 ku(Ⅰ)、5 ku至8 ku(Ⅱ)、小于5 ku(Ⅲ)3個組分，表3顯示的是3組分的DPPH·清除率.結(jié)果表明，水解產(chǎn)物中分子質(zhì)量小于5 ku的產(chǎn)物具有較好的DPPH自由基的清除率，且該組分水溶性好，樣品較均一，有利于后續(xù)的分離純化，因此，選用該組分進行后續(xù)的組分分離操作.

表2 木瓜蛋白酶4 h水解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布

表3 木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物超濾組分的DPPH·清除率

2.3.2 凝膠層析法分離純化抗氧化多肽

將超濾后分子質(zhì)量小于5 ku的樣品用Sephadex G-25凝膠色譜柱進行層析分離，得到4個主要組分PA、PB、PC和PD(如圖2).它們對DPPH·的清除率依次為：(45.74±1.38)%、(61.53±1.68)%、(11.65±0.86)%和(16.3±1.12)%(見圖3).峰PB清除DPPH·的活性最強，將此組分利用RP-HPLC進行進一步的分離.

2.4 RP-HPLC分離抗氧化多肽

圖4顯示的是組分PB進行RP-HPLC純化分離的色譜圖，按照出峰的先后順序收集了12個組分，收集并凍干樣品，測定不同組分對DPPH·清除率得到如圖5所示結(jié)果，結(jié)果顯示，PB4對DPPH自由基的清除率最高，為(71.41±1.1)%，對應的樣品為圖4所示的4號峰.

2.5 抗氧化多肽的結(jié)構(gòu)鑒定

2.5.1 組分PB-4的質(zhì)量指紋圖譜

圖6為MAILDI-TOF/TOF MS測定的PB-4組分的一級質(zhì)譜圖，即分子量質(zhì)譜圖.圖譜顯示組分PB-4的分子質(zhì)量分布在(800～1 500)u之間.

實驗采用MAILDI-TOF/TOF MS結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜儀(TOF-MS/MS)的方法分析PB-4組分的氨基酸序列.在組分PB-4一級質(zhì)譜的基礎上，我們選取所有可能的目的肽段，對其氨基酸序列進行進一步的分析鑒定，得到4個符合要求的目的多肽，其TOF-MS/MS圖譜如圖7所示，它們的氨基酸序列分別是：LNFNLEKSR(1 120.3 u)、SWLRPR(814.4 u)、RIGNIISQY(1 063.3 u)和LNFNLEK(877.2 u).

3 討論

蛋白質(zhì)水解時，由于蛋白酶的酶切位點的差異和水解度的不同，會導致產(chǎn)物的肽鏈長度、暴露的氨基酸基團、分子質(zhì)量分布等的不同，因而產(chǎn)物抗氧化活性也不同.Ajibola等[14]發(fā)現(xiàn)非洲涼薯種子蛋白水解產(chǎn)物中分子質(zhì)量小于 1 000 u的肽段抗氧化活性更強.Li等[15]報道的鷹嘴豆蛋白水解產(chǎn)物抗氧化活性最強的組分，其分子質(zhì)量分布主要介于200～3 000 u；Zhong等[16]在水解白鰱內(nèi)臟蛋白的研究中，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量小于1 ku的組分具有最佳的自由基清除能力.Ajibola等發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量小于 1 000 u的肽段抗氧化活性最強，其中疏水性氨基酸和芳香族氨基酸在抗氧化活性中起重要作用，可能是因為這些疏水性氨基酸提高了非極性環(huán)境下多肽的溶解性，促進其與自由基的相互作用進而清除自由基.本研究用復合蛋白酶(Protamex)、中性蛋白酶(Neutrase)、木瓜蛋白酶(Papain)、堿性蛋白酶(Alcalase2.4 L)和風味蛋白酶(Flavorzyme)5種蛋白酶單酶水解文蛤蛋白，并測定其不同酶解時間水解產(chǎn)物的DPPH·清除率，結(jié)果表明木瓜蛋白酶4 h水解產(chǎn)物的DPPH清除率最高，該水解產(chǎn)物中分子質(zhì)量小于5 ku的肽組分占95.78%，DPPH清除率達到52.31%.進一步地用超濾、凝膠色譜柱層析和RP-HPLC進行分離，并進行結(jié)構(gòu)鑒定，得到4個目的多肽：LNFNLEKSR( 1 120.3 u)、SWLRPR(814.4 u)、RIGNIISQY( 1 063.3 u)和LNFNLEK(877.2 u).這4段多肽中疏水性氨基酸(HAA)和芳香族氨基酸(AAA)占絕大部分，其中Leu、Phe，Ile等疏水性氨基酸最多.

4 結(jié)語

木瓜蛋白酶水解文蛤蛋白的水解產(chǎn)物具有較高的抗氧化活性，其中分子質(zhì)量小于 3 000 u的多肽具有更強的抗氧化活性，分離純化后得到的4種符合要求的目的多肽，它們的氨基酸序列如下：LNFNLEKSR( 1 120.3 u)、SWLRPR(814.4 u)、RIGNIISQY( 1 063.3 u)和LNFNLEK( 877.2 u).

參考文獻:

[1] 李維, 蘭海楠, 郭風, 等. 生物活性肽的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī), 2012, 39(10): 105-107.

[2] LEE J K, PARK S C, HAHM K S, et al. A helix-PXXP-helix peptide with antibacterial activity without cytotoxicity against MDRPA-infected mice[J].Biomaterials, 2014, 35(3): 1025-1039.

[3] DOYEN A, UDENIGWE C C, MITCHELL P L, et al. Anti-diabetic and antihypertensive activities of two flaxseed protein hydrolysate fractions revealed following their simultaneous separation by electrodialysis with ultrafiltration membranes[J].Food Chemistry, 2014, 145: 66-76.

[4] TAHERI A, SABEENA FARVIN K H, JACOBSEN C, et al. Antioxidant activities and functional properties of protein and peptide fractions isolated from salted herring brine[J].Food Chemistry, 2014, 142: 318-326.

[5] WANG H, XIAO H, ZHONG L, et al. Cell-penetrating fusion peptides OD1 and OD2 interact with Bcr-Abl and influence the growth and apoptosis of K562 cells[J].Molecular and Cellular Biochemistry, 2014, 385(1/2): 311-318.

[6] NING X, ZHAO J, ZHANG Y, et al. A novel anti-tumor protein extracted fromMeretrixmeretrixLinnaeus induces cell death by increasing cell permeability and inhibiting tubulin polymerization[J].International Journal of Oncology, 2009, 35(4): 805-812.

[7] KARNJANAPRATUM S, BENJAKUL S, KISHIMURA H, et al. Chemical compositions and nutritional value of Asian hard clam ( Meretrix lusoria) from the coast of Andaman Sea[J].Food Chemistry, 2013, 141(4): 4138-4145

[8] 袁強, 袁弘. 文蛤多糖對實驗性糖尿病大鼠免疫功能的影響[J].浙江中醫(yī)藥大學學報, 2007, 30(6): 612-613.

[9] 吳杰連, 張鉑, 黃春洪, 等. 文蛤糖肽 (MGP 0501) 體外抗癌活性研究[J].藥物生物技術(shù), 2006, 13(4): 260-264.

[10] 張昊, 任發(fā)政. 天然抗氧化肽的研究進展[J].食品科學, 2008, 29(4): 443-447.

[11] 于志鵬, 趙文竹, 劉博群, 等. 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽研究進展[J].食品科學, 2010, 31(11): 308-311.

[12] ZHANG X, SU B, LI J, et al. Analysis by RP-HPLC of mangiferin component correlation between medicinal loranthus and their mango host trees[J].Journal of Chromatographic Science, 2014, 52(1): 1-4.

[13] ZHANG J, ZHANG H, WANG L, et al. Isolation and identification of antioxidative peptides from rice endosperm protein enzymatic hydrolysate by consecutive chromatography and MALDI-TOF/TOF MS/MS[J].Food Chemistry, 2010, 119(1): 226-234.

[14] AJIBOLA C F, FASHAKIN J B, FAGBEMI T N, et al. Effect of peptide size on antioxidant properties of African yam bean seed (Sphenostylis stenocarpa) protein hydrolysate fractions[J].International Journal of Molecular Sciences, 2011, 12(10): 6685-6702.

[15] LI Y, JIANG B, ZHANG T, et al. Antioxidant and free radical-scavenging activities of chickpea protein hydrolysate (CPH)[J].Food Chemistry, 2008, 106(2): 444-450.

[16] ZHONG S, MA C, LIN Y C, et al. Antioxidant properties of peptide fractions from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) processing by-product protein hydrolysates evaluated by electron spin resonance spectrometry[J].Food Chemistry, 2011, 126(4): 1636-1642.