八角蓮不同部位鬼臼毒素和4′-去甲鬼臼毒素含量的測定

馬志剛,鄭永雯,馮益青,王沛霖,楊保濤,邵婭婷,劉彥雄,曹秋娥

(云南大學 化學科學與工程學院 教育部自然資源藥物化學重點實驗室，云南 昆明 650091)

鬼臼毒素是八角蓮、桃兒七、山荷葉等小檗科多年生草本類群鬼臼亞科屬植物中的重要活性成分,具有抗腫瘤、抗癌、抗病毒和免疫調節(jié)作用等功能,尤其是在抗癌方面發(fā)揮了重要的作用[1-4].4′-去甲鬼臼毒素是鬼臼毒素衍生物之一,既具有抗癌活性且毒副作用小等優(yōu)點,也是重要的抗癌藥物如VP-16和VM-26結構改造的前體.因此對鬼臼毒素類物質的研究包括對其含量的測定引起了廣泛的關注.

目前,測定鬼臼毒素含量的方法主要有光度法[5]、熒光法[6]、高效毛細管電泳[7]和高效液相色譜法[8-12].這些已有的報道方法各有其不同的特點,但都沒有涉及鬼臼毒素和4′-去甲鬼臼毒素的同時分離測定.用反相高效液相色譜法,建立了一個同時分離測定鬼臼毒素和4′-去甲鬼臼毒素的方法,并以此方法對八角蓮不同部位中4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素的含量進行了研究,結果在八角蓮的葉、莖、須和根中都沒有檢測到4′-去甲鬼臼毒素,但都檢測到了鬼臼毒素,而且發(fā)現(xiàn),鬼臼毒素的含量在根部最多,而在葉中的含量最少.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters1525-HPLC色譜儀帶，Waters2996 PAD二極管陣列檢測器，Waters717plus Autosampler自動進樣器，Empower中文色譜工作站.

標準對照品鬼臼毒素(PPT)和4′-去甲鬼臼毒素(DMEP)均為Sigma公司產(chǎn)品.八角蓮樣品采自云南省玉溪地區(qū)野生珍稀植物栽培區(qū).色譜分析用溶劑為色譜純,其它試劑均為分析純,實驗用水為超純水.

1.2 對照品溶液配制

儲備液鬼臼毒素(1.500 mg/mL)和4′-去甲鬼臼毒素(1.000 mg/mL)分別用乙醇配制，4℃下保存.各對照品工作溶液由儲備液用乙醇稀釋得到.

1.3 樣品溶液的制備

準確稱取八角蓮的葉、莖、須和根各 1.000 0 g，均用50 mL無水乙醇于80 ℃回流提取8 h后，再超聲提取30 min，過濾.濾液用旋轉蒸發(fā)儀在0.06 MPa下減壓濃縮至干，殘渣用無水乙醇溶解并定容至10 mL，得樣品溶液.所有樣品溶液均經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后直接進樣分析.

1.4 色譜條件

色譜柱:Waters Spherisorb ODS2 5 μm(4.6 mm i.d.×250 mm)；流動相:甲醇-水混合溶劑(65∶35，V/V)；流速:1.0 mL/min；柱溫:40 ℃；檢測波長:207 nm；進樣量:20μL.

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化選擇

流動相的組成影響分析的靈敏度、峰的分離度以及分析時間.考察了流動相中甲醇含量變化對4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素的保留時間和分離度的影響，結果見圖1.可見，4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素的保留時間均隨流動相中甲醇含量的增大而減小，而兩組分的分離度卻隨甲醇含量的增大先降低后有所增加.為兼顧分離度和分析時間，實驗選用了體積比為65∶35的甲醇-水混合溶液作為流動相.

2.2 色譜圖

按上述優(yōu)化的色譜條件得到的標準色譜圖見圖2.

2.3 方法的線性關系

取乙醇儲備液稀釋后的的4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素對照品混合物平行進樣6次,記錄色譜峰面積,以峰面積為縱坐標,質量濃度為橫坐標進行線性回歸,線性范圍和回歸方程見表1.

2.4 精密度試驗

取同一供試品溶液,分別連續(xù)進樣6次,計算2個組分的保留時間和峰面積的相對標準偏差(RSD),結果見表1.

2.5 重現(xiàn)性試驗

取八角蓮的莖6份,按樣品溶液的制備方法制備成6份,分別進樣20 μL，測定峰面積,計算含量,結果鬼臼毒素含量的RSD為3.50%，表明方法重現(xiàn)性良好.

2.6 回收率試驗

在各樣品提取液中分別加入一定量的4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素對照品,用0.45 μm微孔濾膜過濾后,濾液分別進樣20 μL,進行加樣回收實驗,結果見表2.

2.7 樣品測定

采用上述HPLC方法分析八角蓮葉、莖、須和根中4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素的含量,結果見表2.樣品的色譜圖見圖3.

表1 工作曲線與精密度(n=6)

表2 八角蓮不同部位鬼臼毒素和4′-去甲鬼臼毒素的測定結果 (n=6)

注：表中“—”表示未檢出.

3 結語

采用甲醇-水為流動相,反相色譜分離模式分離和測定八角蓮中4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素的含量.測定結果表明，八角蓮根、莖、葉和須的乙醇提取物中均未檢測到4′-去甲鬼臼毒素，而鬼臼毒素在八角蓮的葉、莖、須和根中的分布是不一樣的,其中在根部的含量最高，而在葉中的含量則最低,這一結果與文獻報道結果是一致的[7].

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