軟棗獼猴桃優(yōu)良品系“2008-07”組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)研究

郭志欣，顧地周，閆中雪，沈紅梅，袁 浩，張學(xué)士，王秋爽

(通化師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 通化 134002)

軟棗獼猴桃(Actinidiaarguta(Sieb.et Zucc.) Planch.ex Miq.)別名中華軟棗獼猴桃、軟棗子、獼猴梨、獼猴桃、軟棗等，是獼猴桃科獼猴桃屬藤本落葉植物，其果實(shí)可食用，營養(yǎng)價(jià)值很高，富含維生素C、淀粉、果膠質(zhì)等，可加工成果醬、果汁、果脯、罐頭，也可釀酒或用于制作糕點(diǎn)、糖果等多種食品[1]，還可藥用，有解熱、健胃、止血等功能，其根及根皮對(duì)消化道癌癥有一定的治療和抑制作用。另外，軟棗獼猴桃種子含油率35.62%，是一種較好的干性油。總之，軟棗獼猴桃具有極高的經(jīng)濟(jì)和藥用等價(jià)值，還是良好的蜜源和觀賞植物[2]。

目前，軟棗獼猴桃以野生為主，生產(chǎn)上多采用種子播種、扦插等方式進(jìn)行常規(guī)繁殖，但種子繁殖易產(chǎn)生性狀分離，而扦插生根率和嫁接成活率極低[3-5]，且因采集枝條或種子而對(duì)野生資源造成極大的破壞。組織培養(yǎng)繁殖大多以嫩芽、嫩莖、嫩葉等為材料，多采取愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織再分化、繼代增殖、生根或腋芽直接再生、繼代增殖、生根等多步方式才能成苗[6-10]，盡管生根率較高，但有時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)、再分化和繼代增殖時(shí)，可能已經(jīng)產(chǎn)生了變異或突變。

軟棗獼猴桃優(yōu)良品系“2008-07”是2008年由通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院顧地周高級(jí)工程師經(jīng)甲基磺酸乙酯處理野生軟棗獼猴桃葉片后誘導(dǎo)愈傷組織，從愈傷組織再分化的芽苗中選出的突變體，該品系果大、質(zhì)優(yōu)、豐產(chǎn)性好。本研究以“2008-07”的嫩莖段為材料，通過篩選影響離體莖段生根和腋芽萌發(fā)生長的主要植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)及其適宜用量，建立軟棗獼猴桃的高效植株再生體系，以期為軟棗獼猴桃及其優(yōu)良品種的開發(fā)利用和工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2007-11-15，剪取軟棗獼猴桃優(yōu)良品系“2008-07”的枝條(長度30 cm)，每20根1捆，用濾紙包裹后放入-4～4 ℃的冰柜中冷藏45 d，再將冷藏后的枝條進(jìn)行水培促其腋芽萌發(fā)生長。待腋芽長至3～5 cm時(shí)，將嫩枝剪下，置于培養(yǎng)皿中用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇涮洗10 s后，移至30 g/L次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，無菌水沖洗6次，無菌濾紙吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸鈉損傷的組織和葉片后，切割成1葉1芽莖段(長度約0.5 cm)作為外植體備用。

1.2 植株再生體系的建立

為研究植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)6-芐氨基腺嘌吟(6-BA)、吲哚乙酸(IAA)和吲哚丁酸(IBA)對(duì)軟棗獼猴桃優(yōu)良品系“2008-07”嫩莖段生根率及腋芽生長速度的影響，采用均勻設(shè)計(jì)法U10(103)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)所用基本培養(yǎng)基為：(NH4)2SO426.8 mg/L，CaCl2·2H2O 30 mg/L，NaH2PO4·H2O 30 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 6.95 mg/L，Na2·EDTA·2H2O 9.325 mg/L，MnSO4·4H2O 1.25 mg/L，ZnSO4·7H2O 0.25 mg/L，KI 0.095 mg/L，瓊脂條7.8 g/L，食用白糖10 g/L，調(diào)節(jié)pH值至6.0。培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)質(zhì)量濃度為6-BA(0.02，0.03，0.04，0.05，0.06和0.07 mg/L)、IAA(0.05，0.06，0.07，0.08，0.09和0.10 mg/L)和IBA(0.03，0.04，0.05，0.06，0.07和0.08 mg/L)。將外植體接種不同的培養(yǎng)基，每處理接種10個(gè)莖段，重復(fù)3次，在光照強(qiáng)度700 lx、光照5 h/d和溫度(26±2) ℃條件下培養(yǎng)25 d，統(tǒng)計(jì)生根率，測(cè)定植株高度，結(jié)果取平均值。生根率=(生根的莖段數(shù)/接種的莖段總數(shù))×100%；植株高度為1個(gè)培養(yǎng)周期后的植株總高度，植株高度(cm)=0.5+生長長度。

1.3 植株成苗培養(yǎng)及煉苗移栽

以再生植株莖節(jié)為材料，采取莖節(jié)增殖方式擴(kuò)繁[11-12]，待小植株生長至約3 cm后，在無菌狀態(tài)下打開培養(yǎng)瓶，將小植株靠近根部留1葉后的上部苗干剪下，并切割成1葉1段(長度約0.5 cm)的小莖段，將小莖段轉(zhuǎn)接到不同培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根和莖段生長培養(yǎng)。

當(dāng)軟棗獼猴桃種苗擴(kuò)繁到一定數(shù)量、小植株長至約2.5 cm時(shí)，將小植株從培養(yǎng)瓶中取出，放入20 mg/L高錳酸鉀溶液中洗凈根上的瓊脂，再將其栽植到經(jīng)10%多菌靈可濕性粉劑消毒的由草炭土、腐爛松針和河砂按體積比3∶2∶1配成的混合基質(zhì)中，覆蓋塑料薄膜保濕保溫，控制溫度為(15±2) ℃、空氣相對(duì)濕度為70%，自然光照12 h/d，若溫度升高至20 ℃時(shí)適當(dāng)打開薄膜換氣通風(fēng)，早晚各噴灑1次清水。

煉苗10～12 d揭去塑料薄膜，每隔3 d于早上噴灑1次清水，15 d后每隔7 d噴施質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的KH2PO4溶液，待苗長至25～30 cm時(shí)，連同根部土塊按株距80～100 cm、行距150～200 cm定植于大田，加強(qiáng)肥水管理。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)分析處理后，確定出不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)軟棗獼猴桃莖段生根和莖段腋芽萌發(fā)生長影響的顯著性。在此基礎(chǔ)上，確定對(duì)莖段生根和腋芽萌發(fā)生長影響顯著的主要植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，再進(jìn)一步補(bǔ)充試驗(yàn)確定其適宜水平。均勻設(shè)計(jì)所用軟件為Uniform Design 3.0V。

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA、IAA和IBA對(duì)軟棗獼猴桃莖段生根和腋芽萌發(fā)生長的影響

表1生根率(Y1)數(shù)據(jù)經(jīng)均勻設(shè)計(jì)分析處理后，可得回歸方程為：Y1=57.5+631X1-122X2-0.932X3，復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.986 1，剩余標(biāo)準(zhǔn)差S=2.120 0，檢驗(yàn)值Ft=123.3>臨界值F(0.05,2,7)=4.737，回歸方程具有顯著性。由6-BA、IAA和IBA對(duì)生根影響的顯著性可知，6-BA和IAA對(duì)生根具有顯著影響，而IBA對(duì)生根無顯著影響。計(jì)算6-BA和IAA對(duì)生根的貢獻(xiàn)值(U6-BA、UIAA)和貢獻(xiàn)率(U6-BA/U、UIAA/U)可知，U6-BA=949，U6-BA/U=85.8%；UIAA=35.7，UIAA/U=3.22%，說明6-BA對(duì)生根的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)大于IAA。

表1植株高度(Y2)數(shù)據(jù)經(jīng)分析處理后，可得回歸方程為：Y2=2.07+11.9X1-11.6X2+6.97X3，復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.870 8，剩余標(biāo)準(zhǔn)差S=0.195 0，檢驗(yàn)值Ft=10.98>臨界值F(0.05,2,7)=4.737，回歸方程具有顯著性。由6-BA、IAA和IBA對(duì)生根影響的顯著性可知，6-BA和IAA均對(duì)軟棗獼猴桃腋芽萌發(fā)生長有顯著影響，而IBA對(duì)軟棗獼猴桃腋芽萌發(fā)生長影響不顯著。計(jì)算6-BA和IAA對(duì)莖段腋芽萌發(fā)生長的貢獻(xiàn)值(U6-BA、UIAA)和貢獻(xiàn)率(U6-BA/U、UIAA/U)可知，U6-BA=0.340，U6-BA/U=40.8%；UIAA=0.323，UIAA/U=38.7%，說明6-BA對(duì)軟棗獼猴桃莖段腋芽萌發(fā)生長的貢獻(xiàn)大于IAA。

表1 基于U10(103)設(shè)計(jì)的不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)軟棗獼猴桃優(yōu)良品系“2008-07”嫩莖段生根與腋芽生長的影響

2.2 6-BA和IAA對(duì)軟棗獼猴桃莖段生根和腋芽萌發(fā)生長的影響

由前文分析結(jié)果可知，6-BA與生根率和莖段腋芽萌發(fā)生長呈正相關(guān)，IAA與生根率和莖段腋芽萌發(fā)生長呈負(fù)相關(guān)。由此推測(cè)，培養(yǎng)基中IAA的質(zhì)量濃度低于0.05 mg/L、6-BA的質(zhì)量濃度高于0.07 mg/L時(shí)可能會(huì)使軟棗獼猴桃莖段生根率更高，腋芽萌發(fā)生長情況更好。為驗(yàn)證此推測(cè)，設(shè)置6-BA質(zhì)量濃度為0.15，0.14，0.13，0.12，0.11，0.10，0.09，0.08和0.07 mg/L，IAA質(zhì)量濃度為0.05，0.04，0.03，0.02，0.01和0 mg/L，開展9個(gè)水平的補(bǔ)充試驗(yàn)(表2)，每處理接種10個(gè)莖段，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

2.2.1 莖段生根 將處理后的軟棗獼猴桃莖段轉(zhuǎn)接到含有6-BA(0.07～0.15 mg/L)和IAA(0～0.05 mg/L)的基本培養(yǎng)基中(圖1-A)，培養(yǎng)3 d后發(fā)現(xiàn)，在莖段基部表面出現(xiàn)白色凸起，6 d后凸起漸漸變形為白色錐狀體，11 d后錐狀體逐漸伸長形成不定根， 17 d后可見3～5條肉質(zhì)的不定根形成(圖1-B)。由表2可知，在6-BA質(zhì)量濃度為0.10～0.12 mg/L，IAA質(zhì)量濃度為0.01和0.04 mg/L時(shí)莖段生根率較高，平均生根率最高可達(dá)99.9%，均高于表1所列的10個(gè)處理。

2.2.2 腋芽萌發(fā)生長 由表2可知，莖段在含有質(zhì)量濃度為0.11 mg/L 6-BA和0.04 mg/L IAA的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，腋芽萌發(fā)生長較好。培養(yǎng)7 d軟棗獼猴桃莖段開始生根，10 d后腋芽開始萌發(fā)生長(圖1-C)，苗的生長較快，經(jīng)過22 d的培養(yǎng)，苗的高度最高可達(dá)2.87 cm，高于表1中所列的10個(gè)處理的植株高度。

由以上分析可知，影響生根的主要因素及水平為0.10～0.12 mg/L 6-BA，0.01和0.04 mg/L IAA，而影響莖段腋芽萌發(fā)生長的主要因素及水平為0.11 mg/L 6-BA和0.04 mg/L IAA，IBA對(duì)莖段生根和腋芽萌發(fā)生長的影響均不顯著。因此，適宜軟棗獼猴桃莖段生根和腋芽萌發(fā)生長的培養(yǎng)基為：基本培養(yǎng)基+0.12 mg/L 6-BA+0.04 mg/L IAA，此條件下成苗良好(圖1-D)，成苗率達(dá)98.7%以上。

表2 基于U9(92)設(shè)計(jì)的6-BA和IAA對(duì)軟棗獼猴桃優(yōu)良品系“2008-07”嫩莖段生根與腋芽生長的影響

圖1 軟棗獼猴桃優(yōu)良品系“2008-07”組培快繁各階段的形態(tài)

2.3 軟棗獼猴桃植株成苗培養(yǎng)

在培養(yǎng)瓶內(nèi)以軟棗獼猴桃再生植株莖節(jié)為材料，按照1.2節(jié)中的方法，待小植株生長至約3 cm時(shí)，留1葉將苗干剪下，切割成1葉1段的小莖段(長度約0.5 cm)，轉(zhuǎn)接到不同培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)莖段生根和生長，20～22 d可形成小植株(圖1-E)。

2.4 軟棗獼猴桃小植株的煉苗和移栽

小植株長至約2.5 cm時(shí)，煉苗10～12 d后，苗成活良好(圖1-F)，成活率可達(dá)到98.0%以上；45 d后，苗高可達(dá)25～30 cm，將其連同根部土塊定植于大田，移栽苗成活良好(圖1-G)，成活率達(dá)99.5%以上。

3 結(jié)論與討論

在軟棗獼猴桃嫩莖段生根時(shí)，向基本培養(yǎng)基中添加0.10～0.12 mg/L 6-BA，0.01和 0.04 mg/L IAA，軟棗獼猴桃嫩莖段生根速度快，平均生根率高達(dá)99.9%以上。當(dāng)IAA質(zhì)量濃度低于0.01 mg/L時(shí)，芽苗生根率僅為65.0%；IAA和6-BA質(zhì)量濃度分別高于0.04 mg/L和0.12 mg/L時(shí)，芽苗基部膨脹并產(chǎn)生愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)根會(huì)從愈傷組織上產(chǎn)生，但有這樣根的苗在煉苗移栽時(shí)，根會(huì)隨愈傷組織從苗基部脫落，成活率極低，原因可能是根中和苗莖的輸導(dǎo)組織連接疏松所致，Danielle等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。通過6-BA、IAA和IBA對(duì)軟棗獼猴桃莖段生根影響的顯著性檢驗(yàn)可知，6-BA和IAA對(duì)生根率影響顯著，而IBA對(duì)生根率影響不顯著，6-BA和IAA對(duì)生根的貢獻(xiàn)率分別為85.8%和3.22%，表明6-BA對(duì)嫩莖段的生根貢獻(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于IAA，這說明軟棗獼猴桃試管苗的生根對(duì)植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)具有選擇性，生根所需的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)主要為6-BA。據(jù)相關(guān)報(bào)道[14-15]，在培養(yǎng)基中輔以適量的細(xì)胞分裂素，有利于植物細(xì)胞趨于根器官功能的分化，本研究在軟棗獼猴桃生根培養(yǎng)基中加入6-BA便對(duì)生根起主要調(diào)節(jié)作用，這與顧地周等[16]對(duì)長白瑞香組培苗生根的研究結(jié)果一致。

在軟棗獼猴桃嫩莖段腋芽萌發(fā)生長時(shí)，6-BA和IAA質(zhì)量濃度分別控制在0.11和0.04 mg/L，軟棗獼猴桃嫩莖段腋芽萌發(fā)生長速度快，經(jīng)過22 d的培養(yǎng)，莖段高度最高達(dá)2.87 cm。通過6-BA、IAA和IBA對(duì)軟棗獼猴桃嫩莖段腋芽萌發(fā)生長影響的顯著性檢驗(yàn)可知，6-BA和IAA對(duì)嫩莖段腋芽萌發(fā)生長影響顯著，而IBA對(duì)嫩莖段腋芽萌發(fā)生長影響不顯著，6-BA和IAA對(duì)莖段腋芽萌發(fā)生長的貢獻(xiàn)率分別為40.8%和38.7%，說明二者對(duì)莖段腋芽萌發(fā)生長的作用相當(dāng)，

由6-BA和IAA對(duì)軟棗獼猴桃嫩莖段生根和腋芽萌發(fā)生長的影響結(jié)果可知，軟棗獼猴桃莖段生根和腋芽萌發(fā)生長的適宜培養(yǎng)基為：基本培養(yǎng)基+0.12 mg/L 6-BA+0.04 mg/L IAA，該培養(yǎng)基的成苗率達(dá)98.7%以上。同時(shí)也說明不同植物對(duì)植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)具有不同的選擇性[17]，這可能是由植物自身的基因型控制的，不同的基因型決定了細(xì)胞分裂、分化和器官重建所依賴的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)種類及其濃度高低的不同。

軟棗獼猴桃高效植株再生體系縮短了莖節(jié)的增殖周期，提高了增殖倍數(shù)，王雯雯等[18]開展的大字杜鵑快繁研究也報(bào)道了該方法。該方法成本低，簡捷而可操作性強(qiáng)，可用于工廠化育苗。

目前，國內(nèi)外已有許多獼猴桃優(yōu)良品種的人工繁殖獲得成功[19-20]。我國野生獼猴桃品種資源豐富，但這些品種人工繁殖并開發(fā)利用的極少。軟棗獼猴桃是我國珍貴的經(jīng)濟(jì)植物資源，特別是優(yōu)良性狀株系至今未見推廣應(yīng)用。本研究建立了軟棗獼猴桃的高效植株再生體系，為軟棗獼猴桃及其優(yōu)良品種的開發(fā)利用和工廠化育苗奠定了基礎(chǔ)。

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