道地產(chǎn)區(qū)不同牛膝種群的遺傳多樣性分析

孔德政，張 偉，李 永

(1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2 信陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000)

牛膝(AchyranthesbidentataBl.)為莧科(Amaranthaceae)牛膝屬(AchyranthesL.)多年生草本植物，是中醫(yī)臨床常用傳統(tǒng)藥材之一,以干燥根入藥。其道地產(chǎn)區(qū)位于河南地區(qū)，產(chǎn)于河南的牛膝為懷牛膝，藥效最好，是我國(guó)著名的四大懷藥之一[1]。牛膝對(duì)多種疾病有很好的治療效果，生牛膝可活血、通經(jīng)，治產(chǎn)后腹痛、月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、難產(chǎn)、尿血、淋病、鼻衄、虛火牙痛、腳氣水腫、喉痹、癰腫和跌打損傷；熟牛膝有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之功效，可治腰膝骨痛，四肢拘攣、萎痹、肝腎虧虛和跌打瘀痛。由于牛膝根的藥用價(jià)值高且經(jīng)濟(jì)效益好，市場(chǎng)需求量逐年增加，但是牛膝的栽培面積較小，藥材市場(chǎng)供不應(yīng)求。在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，對(duì)野生牛膝的掠奪式采挖愈演愈烈，嚴(yán)重破壞了道地產(chǎn)區(qū)牛膝的野生資源，因此急需對(duì)其采取保護(hù)措施。

以往對(duì)牛膝的研究主要集中于其藥理和生化方面[2-3]，對(duì)于牛膝遺傳多樣性和保護(hù)生物學(xué)方面的研究尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以牛膝道地產(chǎn)區(qū)河南省境內(nèi)的8個(gè)野生牛膝種群為對(duì)象，選用葉綠體基因片段psbA-trnH[4]對(duì)其種群的遺傳變異情況進(jìn)行分析，以期闡明其遺傳多樣性水平，為牛膝野生種群的保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取河南8個(gè)牛膝野生種群，每個(gè)種群隨機(jī)采集6～10個(gè)個(gè)體，個(gè)體間距保持10 m以上，共采集68個(gè)個(gè)體，采樣地信息見表1。采取牛膝當(dāng)年萌發(fā)的新葉，放在保鮮袋中，用硅膠干燥，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于-70 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表 1 供試道地產(chǎn)區(qū)牛膝種群的基本信息

1.2 psbA-trnH基因的PCR擴(kuò)增與測(cè)序

使用上海生工柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(SK8262)提取牛膝基因組DNA，操作流程按試劑盒說明書進(jìn)行。用8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取DNA的質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)[4]，選用psbA-trnH片段的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在MJ Research PTC-200 PCR 儀(美國(guó)伯樂公司)上進(jìn)行，擴(kuò)增反應(yīng)體系為30 μL，包括30 ng基因組DNA，10 mmol/L dNTPs(天根生化科技有限公司) 0.6 μL，10 μmol/L 通用引物[4]( 華大基因科技股份有限公司合成)0.9 μL，3 μLTaqBuffer和1 UTaq酶(天根生化科技有限公司)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒E.Z.N.A? Gel Extraction Kit (Omega Bio-Tek)純化后送華大基因科技股份有限公司測(cè)序。將所得到的葉綠體基因psbA-trnH序列用ClustalX1.81[5]軟件進(jìn)行序列比對(duì)，并進(jìn)行人工校正，然后適當(dāng)?shù)丶羟惺姑織l序列前后端對(duì)齊。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DnaSP version4.0軟件估算單倍型多樣性指數(shù)(h)[6]和核苷酸多樣性指數(shù)(π)[7]，評(píng)估道地產(chǎn)區(qū)8個(gè)牛膝野生種群的總體及種群遺傳多樣性，并用此軟件估算種群間的基因流(Nm)與分化系數(shù)(Фst)。應(yīng)用ARLEQUIN軟件包(Version 3.1)中的分子變異分析AMOVA(Analysis of Molecular Variance)檢測(cè)種群間和種群內(nèi)的遺傳變異組成。用Phylip軟件對(duì)8個(gè)種群的遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，計(jì)算出葉綠體基因核酸間的凈差異[8]，采用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建嚴(yán)格一致性樹。用TCS 軟件進(jìn)行單倍型的系統(tǒng)關(guān)系分析，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)樹。應(yīng)用IBD(Isolation-by-distance)軟件分析牛膝種群平均遺傳距離與地理距離(經(jīng)緯度)之間的相關(guān)性，并進(jìn)行1 000次重復(fù)的顯著性檢驗(yàn)。

對(duì)牛膝葉綠體基因片段進(jìn)行Tajima’s D[9]和 Fu & Li’sD*、F*[10]檢測(cè)，判斷這些位點(diǎn)是否符合中性進(jìn)化模式，以鑒定牛膝種群大小的歷史變化。為了進(jìn)一步驗(yàn)證牛膝的種群歷史變化，假設(shè)種群恒定為零，進(jìn)行失配分布分析(Mismatch distribution analysis)，以推測(cè)種群是否經(jīng)歷過擴(kuò)張或瓶頸效應(yīng)[8,11]。中性檢驗(yàn)與失配分布分析均用DnaSP version4.0 軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同牛膝種群的遺傳多樣性分析

試劑盒提取的DNA產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，條帶清晰明亮，可以用于PCR擴(kuò)增。

對(duì)68個(gè)牛膝個(gè)體葉綠體基因片段psbA-trnH進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，獲得了332 bp的目的片段，該片段存在5個(gè)堿基替代位點(diǎn)，有Ⅰ～Ⅵ 6個(gè)單倍型(表2)， 將其DNA序列提交至GenBank，依次獲得JQ621856～JQ621861 6個(gè)登錄號(hào)。由表3可見，單倍型Ⅰ個(gè)體數(shù)最多，有42個(gè)；單倍型Ⅱ、Ⅴ個(gè)體數(shù)最少，僅有3個(gè)。單倍型Ⅰ分布最廣，存在于7個(gè)種群；單倍型Ⅳ次之，存在于4個(gè)種群；單倍型Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ分布范圍較窄，只出現(xiàn)于1個(gè)種群。為了進(jìn)一步闡明單倍型Ⅰ～Ⅵ的系統(tǒng)關(guān)系，本研究構(gòu)建了單倍型的網(wǎng)絡(luò)樹，結(jié)果見圖1。由圖1可見，單倍型Ⅰ為祖先單倍型，位于網(wǎng)絡(luò)樹中間位置,與其他單倍型僅差一個(gè)突變步。對(duì)8個(gè)野生種群68個(gè)牛膝個(gè)體進(jìn)行計(jì)算，其單倍型多樣性指數(shù)為 0.594，核苷酸多樣性指數(shù)為2.13×10-3。淮源牛膝種群(HY)的遺傳多樣性水平明顯高于其他7個(gè)種群(表3)。

表2 不同牛膝種群葉綠體基因片段psbA-trnH位點(diǎn)變化產(chǎn)生的6個(gè)單倍型信息

表3 基于葉綠體基因psbA-trnH的不同牛膝種群的遺傳多樣性指數(shù)

2.2 不同牛膝種群的遺傳進(jìn)化關(guān)系

分子變異分析結(jié)果表明，8個(gè)種群間的遺傳變異為49.07%，而種群內(nèi)的遺傳變異為50.93%，種群分化系數(shù)為0.499，表明牛膝的遺傳變異在種群內(nèi)與種群間大致相當(dāng)，種群間分化水平稍低，種群間基因流較高(Nm=0.25)。由圖2可以看出，九蓮山種群(JL)與其他7個(gè)種群有較大分化，雞公山種群(JG)、龍峪灣種群(LY)、大乘山種群(DC)和萬仙山種群(WX)的親緣關(guān)系最近。IBD分析檢驗(yàn)表明，牛膝種群遺傳距離與地理距離相關(guān)性較低(r=0.091)，不存在正相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。

圖1 基于葉綠體基因psbA-trnH的不同牛膝種群?jiǎn)伪缎?/p>

2.3 不同牛膝種群的歷史變化分析

對(duì)8個(gè)牛膝種群進(jìn)行中性檢驗(yàn)，Tajima’sD值為負(fù)值，但不顯著(D=-0.734，P>0.10)；Fu & Li’sD*、F*均為正值，且均不顯著(D*=1.070，P>0.10；F*=0.579，P>0.10)。失配分布分析結(jié)果(圖3)同樣支持牛膝種群沒有快速增長(zhǎng)，失配分布并未顯著偏離種群恒定零假設(shè)(r=0.152，P=0.264)。結(jié)果表明，該片段符合中性進(jìn)化模式，在整體水平上牛膝種群并未經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)或快速擴(kuò)張等歷史事件。

圖2 基于葉綠體基因psbA-trnH的不同牛膝種群進(jìn)化關(guān)系的鄰接樹

3 討 論

遺傳多樣性是生物所攜帶的遺傳信息的總和，是物種長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果。一個(gè)種群遺傳多樣性越高或越豐富，其適應(yīng)環(huán)境的能力就越強(qiáng)[11]。影響植物遺傳多樣性的因素很多，如地理分布范圍、繁育系統(tǒng)、種群大小等[12]。異交和混交物種一般比自交物種有更高的遺傳多樣性，地理分布范圍廣的物種比分布范圍狹窄的物種遺傳多樣性高，大種群比小種群的遺傳多樣性高[12-15]。

牛膝是廣泛分布于中國(guó)暖溫帶及亞熱帶地區(qū)的多年生草本植物，種群規(guī)模很大，是以昆蟲傳粉為主的兼性傳粉植物[16]，理論上而言應(yīng)該具有較高的遺傳多樣性。本試驗(yàn)對(duì)道地產(chǎn)區(qū)河南牛膝種群的遺傳多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其遺傳多樣性(h=0.594)較Qiu等[17]研究的中國(guó)其他種子植物低(10個(gè)物種平均，h=0.817)。這可能是因?yàn)榈赖禺a(chǎn)區(qū)牛膝遭到大規(guī)模的采挖，種群數(shù)量有所下降；另一個(gè)原因可能是采樣范圍狹小，如果進(jìn)一步擴(kuò)大采樣區(qū)域，其遺傳多樣性指數(shù)可能會(huì)上升。本研究結(jié)果顯示，淮源種群(HY)牛膝的遺傳多樣性(h=0.806，π=3.68×10-3)明顯高于其他7個(gè)種群，這可能與淮源種群受人為干擾程度較小有關(guān)。人為干擾很大程度上會(huì)造成種群隔離、生境破碎化，且對(duì)傳粉者有較大的影響，從而增加了種群的近交系數(shù)，使種群有較高的遺傳同源性，從而導(dǎo)致遺傳多樣性的丟失，最終形成干擾較多的地區(qū)牛膝種群遺傳多樣性較低的格局。

本研究結(jié)果表明，道地產(chǎn)區(qū)牛膝種群間有很低的遺傳分化(ФST=0.499)。供試牛膝種群間基因流較高(Nm=0.25)，這可能是由于葉綠體基因由種子進(jìn)行傳播，而成熟的牛膝種子往往有刺狀的小萼片宿存[17]，此類種子多靠動(dòng)物進(jìn)行傳播，其傳播距離較遠(yuǎn)，所以種群間基因流較高。牛膝九蓮山種群(JL)與其他7個(gè)種群有較大分化，雞公山種群(JG)、龍峪灣種群(LY)、大乘山種群(DC)和萬仙山種群(WX)4個(gè)種群的親緣關(guān)系最近，但這4個(gè)種群的地理距離反而相對(duì)較遠(yuǎn)。IBD分析也進(jìn)一步證明, 遺傳距離與地理距離相關(guān)性較低(r=0.091)，不存在正相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。這可能是由于牛膝種子的結(jié)構(gòu)特殊，使種子具有高效的傳播效率，導(dǎo)致在小范圍內(nèi)種群遺傳距離與地理距離之間相關(guān)性較低。

8個(gè)牛膝種群有6個(gè)單倍型(Ⅰ～Ⅵ)，單倍型Ⅰ與其他單倍型僅差一個(gè)突變步，親緣關(guān)系相當(dāng)。單倍型Ⅰ為祖先單倍型且分布最廣，存在于7個(gè)種群，僅在九蓮山種群(JL)未出現(xiàn)。一般來講，親緣關(guān)系近的單倍型在同一地區(qū)或種群中出現(xiàn)的概率較大，而JL種群是一個(gè)較為特殊的現(xiàn)象，其在道地產(chǎn)區(qū)中具有特殊的基因型，應(yīng)該受到更多的保護(hù)。淮源種群(HY)的遺傳多樣性明顯高于其他7個(gè)種群，且有特殊的單倍型Ⅱ和Ⅴ，也應(yīng)該作為一個(gè)保護(hù)單元受到更多的重視。

總之，本研究結(jié)果表明，道地產(chǎn)區(qū)河南野生牛膝種群的遺傳多樣性相對(duì)較低；人類活動(dòng)較多的地區(qū)可能會(huì)造成牛膝種群的遺傳多樣性降低；牛膝種群遺傳距離與地理距離之間不存在正相關(guān)關(guān)系；淮源種群(HY)與九蓮山種群(JL)應(yīng)該作為保護(hù)單元受到更多的重視。

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