典型藥物污染物的SPE-UPLC-MS-MS檢測方法

楊曉凡，陸光華，劉建超

1.河海大學環(huán)境學院，江蘇 南京 210098 2.安徽工程大學環(huán)境工程系，安徽 蕪湖 241000

全世界每年消耗100 000 t以上的藥物，包括消炎止痛藥、抗生素、降血脂藥、β-阻滯劑、激素、類固醇、抗癌藥、鎮(zhèn)靜劑、癲癇藥、利尿劑、興奮劑等[1]。進入動物體或人體的藥物大約有30%～95%隨糞便排出體外[2-3]，對污水處理廠出水檢測的結果表明污水處理廠并不能完全去除藥物污染物[4-5]。藥物是新興污染物PPCPs(藥物和個人護理品)的重要組成部分，大部分藥物不具有POPs的環(huán)境難降解特性，但持續(xù)不斷地排入水環(huán)境所形成的“假持久性”,對水生生物及人體健康構成潛在的威脅[6]。

歐美等國家對各類藥物在自然水體中的污染研究高度重視[7-9]。在中國，自然水體中的藥物污染研究剛剛起步，對水體藥物污染物的多殘留檢測方法[10-11]及其污染特征[12-13]等研究仍然集中在抗生素領域。而抗生素只是大量藥物中的一部分，在科研和實踐中，為了滿足對不同類藥物污染特征及其相關毒理學的研究，迫切需要建立能夠滿足同時檢測不同種類藥物的多殘留檢測方法。

在對中國常用藥物調查的基礎上，參照水環(huán)境中優(yōu)先控制藥物篩選方法[14]及國內外污染藥物的檢出頻率、持久性和水生生物毒性，選擇了10種藥物作為典型的藥物污染物(氧氟沙星、諾氟沙星、磺胺甲惡唑、心得安、阿替洛爾、布洛芬、雙氯芬酸、咖啡因、氯霉素、三氯生)，建立了10種不同類藥物的SPE-UPLC-MS-MS檢測方法，并應用此方法對自然水體進行了檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀(UPLC-Xevo TQ MS)；固相萃取裝置；氮吹儀；甲醇、乙腈、甲酸等，均為色譜純；實驗室制超純水；標準品：氧氟沙星、諾氟沙星、磺胺甲惡唑、心得安、阿替洛爾、布洛芬、雙氯芬酸、咖啡因、氯霉素、三氯生，均購自德國，純度大于98%。

1.2 溶液配制

標準品儲備液的配制：分別稱取標準品50 mg，用甲醇溶解于50 mL棕色容量瓶中，配制成濃度為1 000 μg/mL的儲存液，(-20) ℃保存。標準品工作溶液的配制：用甲醇將儲備液稀釋成濃度分別為200、50、20、5、1、0.5 μg/L工作溶液，4 ℃下棕色瓶保存。

1.3 SPE柱的富集和凈化

實驗水樣取自較為潔凈的地表水，經(jīng)檢測不含待測目標化合物。水樣經(jīng)過0.45 μm玻璃纖維濾膜過濾，調節(jié)pH后，備用。固相萃取小柱分別用3.0 mL甲醇和3.0 mL超純水依次平衡，開啟真空泵，將500 mL水樣通過特富龍管連接進入固相萃取小柱，控制流速10 mL/min。完成過柱后，于N2保護下干燥1 h。用3.0 mL甲醇洗脫2次，洗脫液收集于10 mL離心管中。50 ℃水浴氮吹至近干，殘留物用甲醇溶解并定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm玻璃纖維濾膜至色譜小瓶中，待測。

1.4 添加回收實驗

用超純水分別配制含各類藥物50 ng/L的混合液，稀硫酸調節(jié)pH，配好的溶液在室溫下平衡1 h后過固相萃取柱提取檢測。通過添加回收實驗，研究不同SPE柱、水樣pH、洗脫溶劑及水樣體積對目標化合物的富集或分離的影響。

1.5 質譜參數(shù)建立和優(yōu)化

用乙腈分別配制目標藥物50 mg/L，使用微量注射器將藥物溶液直接注入質譜儀，先進行全掃描，找出準確的[M+H]+或[M-H]-的分子離子峰，分別對該分子離子進行轟擊，獲得二次碎裂產(chǎn)生的子離子，最后將分子離子和信號強度適宜的子離子組成監(jiān)測離子對，多反應監(jiān)測(MRM)模式進行檢測。在此基礎上優(yōu)化各種質譜參數(shù)，使特征離子的豐度和比例達到最佳，用于后續(xù)的定性和定量分析。

測試過程中采用電噴霧電離源(ESl)、MRM模式進行質譜參數(shù)的優(yōu)化?；衔镌陔x子生成過程中，分子結構中含有較多的強電負性基團時(如氯、溴和烴基的化合物)，易于生成負離子；而含仲胺或叔胺基團時則易于生成正離子。因此，氧氟沙星、諾氟沙星、磺胺甲惡唑、心得安、阿替洛爾、咖啡因采用正離子檢測模式；布洛芬、雙氯芬酸、氯霉素、三氯生采用負離子檢測模式。

源溫為150 ℃，霧化溫度為500 ℃，離子源為ESI，掃描方式為正離子掃描和負離子掃描，檢測方式為MRM，電噴霧電壓為3 500 V，霧化氣為1 000 L/h，各藥物的質譜參數(shù)見表1。

表1 各藥物的質譜參數(shù)表

1.6 超高效液相色譜分離參數(shù)的建立和優(yōu)化

通過等度洗脫確定各目標藥物的大致保留時間和順序，調整梯度洗脫程序，以及流動相的pH來實現(xiàn)最佳液相色譜分離和離子對識別。

色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱溫為30 ℃；正離子模式下流動相：A為甲醇；B為H2O(0.1%甲酸)；梯度洗脫為0～1.0 min時90%～80% B；1.0～2.5 min時80%～20% B；2.5～4.9 min時20% B；4.9～5.0 min時20%～90% B；5.0～10.0 min時90% B；流速為0.2 mL/min；進樣量5.0 μL。負離子模式下流動相：A為乙腈；B為H2O；梯度洗脫為0～1.0 min時90%～80% B；1.0～2.5 min時80%～20% B；2.5～5.9 min時20% B；5.9～6.0 min時20%～90% B；6.0～10.0 min時90% B；流速為0.2 mL/min；進樣量5.0 μL。各藥物的MRM色譜圖見圖1和圖2。

圖1 正離子模式下藥物標準溶液的MRM色譜圖

圖2 負離子模式下藥物標準溶液的MRM色譜圖

1.7 定量方法

外標法定量，0.5、1、5、20、50、200 μg/L的工作液分別進樣，重復3次，繪制定量標準曲線。

2 結果與分析

2.1 2種SPE柱富集、分離效果比較

由于藥物以痕量存在于自然水體中，樣品前處理過程中選擇合適的富集材料是提高準確度和精密度的有效方法。在參考文獻的基礎上，比較了常用的HLB柱和C18柱的富集效果。由于天然水體的pH為7.0～7.5，實驗調節(jié)水樣pH=7.5。超純水添加濃度100 ng/L，水樣體積500 mL。結果見圖3?？傮w來說，HLB柱相對C18柱具有更好的富集效果。

圖3 HLB柱和C18柱對10種藥物的富集分離效果

2.2 pH的影響

根據(jù)2種富集柱富集比較，選擇HLB柱作為富集材料，考察了4種pH(7.5、5.0、3.0、2.0)條件下，10種藥物的添加回收率，添加濃度100 ng/L，水樣體積500 mL，結果見圖4。

圖4 不同pH條件下HLB柱富集10種藥物的添加回收率

由圖4可見，在較低pH時，大部分藥物均有較高的回收率。pH=2.0時，平均回收率為79.2%，pH=3.0時，平均回收率為83%。顯然水樣pH=3.0時，HLB柱對10種藥物的富集更具有優(yōu)勢。水溶液中pH的變化既能影響藥物分子的理化性質，也能改變HLB柱富集顆粒的吸附特性，從而影響藥物分子的富集和解析。

2.3 洗脫溶劑的影響

分別研究了體積分數(shù)為55%、75%、95%甲醇水和100%甲醇4種洗脫液對10種藥物的洗脫效果。添加濃度為50 ng/L，水樣體積500 mL，pH=3.0，結果見圖5。

圖5 不同體積分數(shù)的甲醇洗脫劑對10種藥物添加回收率的影響

隨著甲醇比例的增加，回收率增加，95%甲醇和100%甲醇均具有理想的淋洗效果。95%甲醇作為洗脫劑能夠減少甲醇使用量，減少甲醇揮發(fā)，降低對人體的風險，并節(jié)約成本，因此選擇95%甲醇作為洗脫劑。

2.4 水樣體積的影響

選擇經(jīng)檢測不含上述藥物的自然水進行藥物添加回收實驗，見圖6。

圖6 富集水樣體積對10種藥物添加回收率的影響

由圖6可見，100、200、500 mL 3種水樣體積的添加回收率有差異，但是總體變化較小。除了氧氟沙星，當水樣體積達到1 000 mL時，各藥物添加回收率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。在1 000 mL時，氧氟沙星回收率超過了100%，沒有達到120%。這種現(xiàn)象可能由于水樣過柱體積加大，柱體富集選擇性降低，雜質“假陽性”干擾增大所致。正常情況下，SPE柱填料有限，對水體中的物質吸附表現(xiàn)出一定的承載量，因此，當強行過濾的水樣越多，吸附水體中的其他物質(腐殖酸等)也越多，達到其承載量附近時，吸附效果下降，添加回收率反而降低，影響檢測的準確性和精密度。另外，隨著水樣的增加，HLB小柱透水性變差，導致流速變慢，工作效率降低；另一方面，藥物在自然水體中以痕量存在，富集的水樣體積太少，濃度太小，低于檢測限，則檢測不到。因此在自然水體檢測中，選擇200～500 mL作為樣品體積較為適宜。

2.5 方法的相關參數(shù)

方法的回收率及檢出限列于表2。

表2 方法回收率及檢出限

從表2中可見，在0～200 μg/L范圍內10種藥物的標準曲線線性關系良好(r≥0.999)，方法最低檢出濃度0.5～2.0 ng/L，精密度高(RSD<10%)，加標回收率為64.3%～100.7%。

2.6 實際水樣測定

分別在太湖和某污水排水口取實際水樣，按照優(yōu)化后的方法進行檢測，結果見表3。

表3 實際水樣中10種藥物檢出濃度 ng/L

注：“—”表示未檢測到藥物或低于檢出限。

相對于深圳河[15]和海河[13]，太湖水樣的磺胺類及喹諾酮類藥物檢測量相對較小?？Х纫驓埩袅靠梢宰鳛槌鞘形鬯欧诺闹甘舅幬颷16-17]，僅從北太湖的咖啡因含量看，北太湖仍然受到城市污水排放的威脅。在污水處理廠排水口檢測到7種藥物，這與國外的相關檢出量近似[4,18]，進一步證明污水處理廠并不能完全去除藥物污染物。

3 結論

該方法使用樣品體積為500 mL，調節(jié)水樣pH=3.0，HLB柱富集，用6 mL體積分數(shù)為95%的甲醇洗脫，采用高效液相-串聯(lián)質譜正負離子模式檢測，外標法定量，檢出限0.5～2.0 ng/L，精密度高(RSD<10%)，加標回收率為64.3%～100.7%，并從實際2種水樣中檢測出了大部分的目標藥物，表明該方法適合自然水體藥物檢測要求，同時選擇的10種目標藥物在研究中國水體污染中具有一定的代表性，可以為自然水體的藥物污染檢測及相關的生態(tài)毒理學研究提供參考。

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