原子力顯微鏡在環(huán)境微生物成像中的條件研究

李冬梅，張金娜，劉俊峰，施雪華

(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 市政環(huán)境工程學(xué)院,城市水資源和水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150090)

原子力顯微鏡是近年來較為重要的表面成像技術(shù)的進(jìn)展之一，其原理[1-2]是利用激光束的偏轉(zhuǎn)法，將針尖制作在一個(gè)對(duì)微弱力極為敏感的V形的微懸臂上，微懸臂的另一端固定，使針尖趨近樣品表面并與表面輕輕接觸，由于針尖尖端原子與樣品表面原子之間存在著微弱的排斥力，當(dāng)針尖進(jìn)行掃描時(shí)，可通過反饋系統(tǒng)控制壓電陶瓷管伸縮來保持原子間的作用力恒定，帶有針尖的微懸臂將隨著樣品表面的起伏而顫動(dòng)，利用光學(xué)監(jiān)測(cè)方法得到樣品表面形貌的信息。

原子力顯微鏡已經(jīng)在許多科研領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，包括微生物細(xì)胞的形態(tài)觀察[3-5]、生物大分子的結(jié)構(gòu)觀察及生理生化過程分析[6-9]、化學(xué)材料的表面特征分析[10-11]。目前針對(duì)原子力顯微鏡系統(tǒng)成像的儀器參數(shù)優(yōu)化獲得高質(zhì)量圖像的研究相對(duì)較少，本文通過比較研究細(xì)菌的成像條件，優(yōu)化AFM系統(tǒng)的儀器操作參數(shù)，以期為原子力顯微鏡在環(huán)境微生物樣品的觀察過程中提供一定的參考依據(jù)。

1 材料方法

1.1 材料和儀器

目標(biāo)菌株：本試驗(yàn)采用的細(xì)菌菌株是從污泥中分離獲得的具有反硝化功能的菌株S。

實(shí)驗(yàn)儀器：美國(guó)維易科公司Bioscope型號(hào)原子力顯微鏡(AFM)系統(tǒng)，探針型號(hào)為RTESP，彈性系數(shù)40 N/m；日本Olympus公司BX51型號(hào)光學(xué)顯微鏡。

1.2 樣品預(yù)處理

(1) 樣品收集：取液體培養(yǎng)中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株S 1mL放于1.5 mL離心管中，5 000 r/min離心10 min，并棄去上清。

(2) 樣品純化：利用1×PBS 將樣品離心沖洗3 次。

(3) 樣品固定：加入200 μL、2.5%的戊二醛溶液，混勻后固定3 h。

(4) 載玻片清洗：將載玻片放入重鉻酸鉀洗液中浸泡過夜后，用蒸餾水沖洗3次，再用超純水沖洗3次，放置架上，于無菌操作臺(tái)中自然風(fēng)干后備用。

(5) 上樣：在無菌操作臺(tái)中用微量移液器取10 μL固定后的菌液滴于載玻片中央，用接種環(huán)均勻涂布后自然風(fēng)干。

(6) 光學(xué)顯微鏡觀察：將上樣風(fēng)干后的載玻片放于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，確定待觀察菌株的相對(duì)位置。

(7) 原子力顯微鏡觀察：調(diào)整原子力顯微鏡的成像條件進(jìn)行菌株的形態(tài)觀察。

1.3 成像條件確定

利用原子力顯微鏡進(jìn)行菌株的形態(tài)學(xué)表征，需要對(duì)原子力顯微鏡的成像條件進(jìn)行優(yōu)化。細(xì)菌形態(tài)觀察的主要影響條件包括掃描頻率、掃描力及信號(hào)反饋信號(hào)的積分常數(shù)。本文采用輕敲模式，比較研究上述3個(gè)條件對(duì)細(xì)菌成像的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同掃描頻率對(duì)成像結(jié)果的影響

原子力顯微鏡系統(tǒng)中的掃描頻率決定圖像的掃描速度，頻率越高，探針在樣品表面的移動(dòng)速度越快，對(duì)于表面結(jié)構(gòu)復(fù)雜的細(xì)菌樣品來說，其表面的細(xì)微結(jié)構(gòu)就很容易被忽略，得到的圖像信息相對(duì)較少而且也不夠清晰；頻率越慢，則探針在樣品表面的移動(dòng)速度越慢，得到的圖像越清晰且圖像信息也相對(duì)完整，但耗時(shí)較長(zhǎng)，增加了探針的磨損程度。因此，對(duì)于不同的樣品，應(yīng)該采取不同的掃描頻率。

以菌株S為例，分別以0.2、0.5、1、1.5、2 Hz 5種掃描頻率進(jìn)行細(xì)菌成像，并且固定其電壓輸出值為1 mv左右，積分常數(shù)/比例常數(shù)為0.6/0.8，得到細(xì)菌圖像見圖1。從成像結(jié)果可知，當(dāng)頻率為1.5 Hz和2 Hz時(shí)，細(xì)菌圖像邊緣模糊變形，不能清晰顯示細(xì)菌圖像；而當(dāng)頻率為0.2、0.5、1 Hz時(shí)，可以從圖片有半部分的相位像進(jìn)行觀察分析，可以看出頻率為1 Hz時(shí)，其相位像表面較為粗糙；考慮到掃描時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)加快探針的磨損程度，應(yīng)該選擇0.5 Hz作為菌株S的掃描速度。

圖1 5種掃描頻率的細(xì)菌圖像

2.2 不同掃描力對(duì)成像結(jié)果的影響

在原子力顯微鏡系統(tǒng)中掃描力的表現(xiàn)形式為輸出的電壓值，電壓值越大，探針對(duì)樣品的作用力越小。反之，電壓值越小，探針對(duì)樣品的作用力越大，探針跟蹤樣品越好，但需要注意，探針對(duì)樣品的力越大，越容易損傷樣品。在圖像觀察過程中，輸出的電壓是一個(gè)即時(shí)變化參數(shù)，需要根據(jù)兩條曲線是否相同進(jìn)行不斷調(diào)整，以保證圖像宏觀的完整性且不易發(fā)生變形.

以菌株S為例，在2 Hz的掃描頻率積分常數(shù)/比例常數(shù)為0.6/0.8的條件下，固定其電壓輸出值為1.002 V時(shí)的效果如圖5所示，可以看出圖像發(fā)生變形，而及時(shí)調(diào)整電壓輸出值使trace、retrace曲線相趨近，此時(shí)的電壓輸出值為1.106 mV，效果見圖2，雖然相位像的效果較輸出電壓為1.002 mV 較為粗糙，但是菌體的效果圖并不發(fā)生變形，宏觀上圖像的信息較為完整。

圖2 掃描力為1.106 mV的細(xì)菌圖像

2.3 不同積分常數(shù)對(duì)成像結(jié)果的影響

原子力顯微鏡系統(tǒng)中的積分常數(shù)對(duì)探針探測(cè)的反饋信號(hào)進(jìn)行數(shù)字到圖像轉(zhuǎn)換的效果有影響，如圖3所示。選擇合適的積分常數(shù)才能將圖像的三維結(jié)構(gòu)顯示出來，積分常數(shù)越小，其圖像的立體結(jié)構(gòu)較差，體現(xiàn)為平面圖像變形，如圖3(a)所示；積分常數(shù)越大，圖像的立體結(jié)構(gòu)較強(qiáng)，但同時(shí)也會(huì)增加干擾信號(hào)，干擾信號(hào)在相位像中會(huì)體現(xiàn)出來，如圖3(d)所示；當(dāng)控制積分常數(shù)/比例常數(shù)為0.4/0.6時(shí)，菌株S的邊緣效果與積分常數(shù)/比例常數(shù)為0.6/0.8時(shí)相比較為模糊。因此，獲得菌株S的最佳成像效果的積分常數(shù)/比例常數(shù)應(yīng)為0.6/0.8。

圖3 不同的積分常數(shù)的細(xì)菌圖像

3 結(jié)論

原子力顯微鏡在環(huán)境微生物樣品的形態(tài)學(xué)鑒定及觀察中的應(yīng)用越來越廣泛，本文針對(duì)原子力圖像觀察菌株樣品過程中的儀器參數(shù)調(diào)控進(jìn)行了比較研究，具有一定的參考價(jià)值。結(jié)果表明：控制掃描頻率為0.5 Hz時(shí)獲得的圖像清晰度高；控制積分常數(shù)/比例常數(shù)為0.6/0.8時(shí)，原子力顯微鏡系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)從數(shù)字到圖像最佳轉(zhuǎn)換，圖像的三維效果好，且背景的干擾信號(hào)較??；掃描力的控制體現(xiàn)在系統(tǒng)的電壓輸出值，該值的最佳數(shù)值應(yīng)根據(jù)trace曲線和retrace曲線的變化即時(shí)調(diào)節(jié)，使二者趨于重合的電壓值即為最適掃描力。

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