甘薯多糖提取條件及抗氧化性的研究

全桂靜，宋文婷

(沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽 110142)

多糖是一類由單糖組成的天然高分子化合物，廣泛存在于植物、動物和微生物細(xì)胞內(nèi).植物多糖種類較多，具有特殊的生物活性，如協(xié)助消化、抗疲勞、抗病毒、抗菌消炎、抗衰老、抗輻射、抗腫瘤、降血糖、降血脂及免疫調(diào)節(jié)等[1-3].多糖在食品工業(yè)中具有廣泛應(yīng)用，常被用作增稠劑、穩(wěn)定劑、成膜劑、持水劑等[4].植物多糖的提取方法主要有溶劑浸提法、酶法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法等[5].

甘薯營養(yǎng)豐富，成分均衡，價格低廉，具有很高的藥用價值，甘薯多糖具有抗氧化作用[6-7].目前已經(jīng)展開對甘薯多糖的研究，主要集中在提取工藝方面.本實驗主要對甘薯多糖提取工藝進行優(yōu)化，但以粗多糖得率和多糖含量兩項作為優(yōu)化指標(biāo)，可以全面衡量提取工藝的優(yōu)劣.同時對獲得的多糖物質(zhì)進行抗氧化劑研究.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

甘薯：市售鮮甘薯.

1.2 實驗方法

1.2.1 甘薯多糖的提取工藝

甘薯→去皮、切片→烘干→粉碎→無水乙醇回流脫脂→熱水浸提→離心過濾→減壓濃縮→乙醇沉淀→離心→水溶→脫蛋白→脫色→乙醇沉淀→抽濾→真空干燥→粗多糖[6，8]

1.2.2 操作要點

甘薯去皮，切成薄片，55 ℃烘干，粉碎成甘薯粉.取2.0 g甘薯粉，加入12 mL無水乙醇，77 ℃回流脫脂，回流2次，每次30 min.加入15倍體積的蒸餾水，調(diào)pH=7.0，70 ℃攪拌提取2 h，7 800 r/min離心30 min，減壓濃縮至原體積的1/3～1/2.加入3倍體積分?jǐn)?shù)85 %的乙醇，使溶液形成均勻的絮狀沉淀，室溫靜置后離心，10 000 r/min離心30 min，收集沉淀.加入20倍體積的蒸餾水，攪拌溶解沉淀，并緩慢加入等體積的質(zhì)量濃度30 g/L的三氯乙酸溶液，放入4 ℃冰箱，靜置過夜，使蛋白完全沉淀，10 000 r/min離心30 min，留上清液.加入總體積2 %的硅藻土脫色30 min，并用真空泵裝置進行抽濾，取濾液.加入3倍體積分?jǐn)?shù)85 %的乙醇，使樣液形成均勻的絮狀沉淀，用真空泵抽濾裝置抽濾，真空干燥，最終得粗多糖膏體[10-11].

1.2.3 單因素實驗

以甘薯粉為原料，分別以浸提溫度(50、60、70、80、90 ℃)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、浸提時間(1、2、3、4 h)和提取液pH值(5.0、6.0、7.0、8.0)作為因素，分析不同提取條件對甘薯多糖提取效果的影響，檢測指標(biāo)為粗多糖得率.

1.2.4 正交試驗

以粗多糖得率為考察指標(biāo)，根據(jù)單因素實驗結(jié)果設(shè)計正交試驗，以優(yōu)化甘薯多糖的提取條件.

1.2.5 多糖含量的測定——苯酚硫酸法

(1) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取50.0 mg無水葡萄糖，溶解定容至50 mL，得1 g/L葡萄糖儲備液.精確吸取儲備液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL移入試管中加水稀釋至1.0 mL，加入質(zhì)量濃度50 g/L的苯酚溶液1 mL混勻，再迅速滴加5 mL濃硫酸，振蕩混勻，放置30 min.再將上述各溶液稀釋10倍，測A490，得回歸方程為：y=0.639 5x+0.017，R2=0.999 3.

(2) 待測樣品中多糖含量的測定

稱取50.0 mg多糖樣品，溶解定容至50 mL.準(zhǔn)確量取1.0 mL，按照(1)中方法測定樣品.按公式

多糖含量/%=

計算多糖含量.

1.2.6 多糖的抗氧化性研究

(1) 對羥自由基(·OH)清除作用的測定——鄰二氮菲-Fe2+氧化法[9]

取10 mL具塞試管，按順序加入5 mmol/L 鄰二氮菲1.5 mL，0.5 mol/L、pH=7.4的磷酸緩沖液3 mL，1 mL、7.5 mmol/L的FeSO4，不同濃度多糖溶液3 mL，1 mL體積分?jǐn)?shù)0.1 %的H2O2，用重蒸水稀釋到10 mL，37 ℃保溫60 min，測A510.空白管(A510(空白)) 不加H2O2及抗氧化藥物，對照管(A510(對照)) 只加H2O2不加抗氧化藥物.

羥自由基清除率/%=

取10 mL具塞試管，加入0.05 mol/L、pH=8.2的Tris-HCl緩沖溶液6 mL，25 ℃水浴中預(yù)熱20 min，加入不同濃度甘薯多糖溶液1 mL，立即加入在25 ℃水浴中預(yù)熱的鄰苯三酚1 mL，于30 s內(nèi)定容至刻度，最后在25 ℃的水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)4 min，立即用8 mol/L鹽酸2滴終止反應(yīng)，測A320.

超氧自由基清除率/%=

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯多糖提取

2.1.1 浸提溫度對甘薯多糖提取的影響

實驗考察了浸提溫度對甘薯多糖提取的影響，結(jié)果如圖1所示.由圖1可知：浸提溫度對甘薯多糖提取有影響，最佳浸提溫度為70 ℃，粗多糖得率為29.53 %，粗提物中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到55.29 %.結(jié)果顯示，浸提溫度升高后提取物的多糖含量大幅下降，說明高溫對多糖的影響較大.

圖1 浸提溫度對多糖提取的影響

2.1.2 浸提料液比對甘薯多糖提取的影響

實驗考察了料液比對甘薯多糖提取的影響，結(jié)果見圖2.由圖2可知：甘薯多糖提取時的最佳料液比為1∶20，粗多糖得率為29.56 %，粗提物多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為54.97 %.結(jié)果顯示料液比對粗提物中多糖含量影響較小.

圖2 料液比對甘薯多糖提取的影響

2.1.3 時間對甘薯多糖提取的影響

實驗考察了提取時間對甘薯多糖得率和多糖含量的影響，結(jié)果見圖3.由圖3可知：浸提3 h時粗多糖得率最高，但粗提物多糖的含量卻比浸提2 h時少，從節(jié)能角度分析，確定浸提時間為2 h.

圖3 浸提時間對甘薯多糖提取的影響

2.1.4 pH值對甘薯多糖提取的影響

實驗考察了提取液pH值對甘薯多糖得率和多糖含量的影響，結(jié)果見圖4.由圖4可知：在不同pH值條件下，粗多糖的得率和甘薯多糖的含量存在差異.中性條件下粗多糖的得率和多糖的含量最高，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為53.97 %.結(jié)果表明多糖的穩(wěn)定性受到環(huán)境pH值的影響.

`

圖4 pH值對甘薯多糖提取的影響

Fig.4 Effect of pH value on the extraction of polysaccharides

2.1.5 提取條件優(yōu)化

采用L9( 34)正交試驗(見表1)優(yōu)化甘薯多糖提取條件，結(jié)果見表2.由表2可知：4個因素對甘薯多糖提取率的影響大小順序為提取溫度>浸提液pH>浸提時間>料液比.綜合分析正交試驗結(jié)果，確定甘薯多糖最佳提取工藝條件為A2B2C2D2，即浸提溫度65 ℃、料液比1∶20，浸提時間2.5 h，浸提液pH=6.5.

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果

以最優(yōu)組合進行5次重復(fù)性實驗，粗多糖得率分別為31.26 %、31.69 %、30.98 %、31.97 %、30.82 %，平均得率為31.34 %，說明此為甘薯多糖的最佳提取條件.該條件下提取的粗多糖中多糖平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為56.32 %.

2.2 甘薯多糖的抗氧化性

2.2.1 對羥自由基(·OH)的清除作用

實驗中研究了甘薯多糖對羥自由基的清除作用，結(jié)果見圖5.由圖5可知：甘薯多糖對羥自由基具有清除作用，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)清除效果隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為300 mg/L時，羥自由基清除率為62.3 %.說明提取的甘薯多糖具有清除羥自由基的能力，但比Vc的清除能力小.

圖5 甘薯多糖及Vc對羥自由基的清除作用

實驗中研究了甘薯多糖對超氧自由基的清除作用，結(jié)果見圖6.

圖6 甘薯多糖對超氧自由基的清除作用

由圖6可知:甘薯多糖具有很強的去除超氧自由基的能力，去除效果隨著多糖質(zhì)量濃度增加而不斷加強，且質(zhì)量濃度超過250 mg/L時對超氧自由基的清除效果明顯增強.多糖質(zhì)量濃度為300 mg/L時，對超氧自由基的清除率為59.2 %，低于對羥自由基的清除率.

3 結(jié) 論

采用熱水浸提的方法從甘薯中提取多糖，通過單因素試驗和正交試驗對提取工藝進行優(yōu)化，確定最佳提取條件為：浸提溫度65 ℃，料液比1∶20，浸提時間2.5 h，浸提液pH=6.5，在此工藝條件下甘薯多糖得率為31.34 %.提取溫度對多糖提取的得率影響最大，其次分別為：浸提液pH值、料液比、浸提時間.

通過測試對羥自由基和超氧自由基的清除作用來檢測甘薯多糖的抗氧化能力，結(jié)果表明其具有很強的抗氧化作用，且抗氧化能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強.在50～300 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，甘薯多糖對羥自由基的清除作用優(yōu)于對超氧自由基的清除作用.

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