鹽脅迫下豌豆幼苗對內(nèi)外源NO的生理生化響應(yīng)

時(shí)振振，李勝＊，楊柯，馬紹英，劉會(huì)杰，張品南，楊曉明

（1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，甘肅 蘭州730070）

土壤鹽漬化也稱鹽堿化，是指土壤底層或地下水的鹽分隨毛管水上升到地表，當(dāng)水分蒸發(fā)后，鹽分就積累在表層土壤中，對植物的生長發(fā)育造成脅迫。土壤鹽漬化已成為世界性的環(huán)境問題，嚴(yán)重威脅農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的生產(chǎn)。全球?qū)⒔?0%的耕地以及近半數(shù)的灌溉地都受到不同程度的鹽漬化影響［1－2］。中國鹽漬土面積約2億hm2，主要分布在東北濱海地區(qū)以及西北干旱半干旱地區(qū)［3－6］。鹽脅迫是影響植物生長的重要因子，也是影響作物產(chǎn)量的主要因素［7］。在鹽堿脅迫作用下，植物生長會(huì)受到抑制［8－10］，植物的光合過程受阻，產(chǎn)生過量活性氧，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)損傷，甚至死亡［11－13］。豌豆（Pisumsativum）屬豆科、豌豆屬，英文名Pea或Garden Field Pea，中文又名寒豆、畢豆、國豆、荷蘭豆等，是重要的豆科小雜糧作物［14］，中國是世界上第三大干豌豆生產(chǎn)國和第二大青豌豆生產(chǎn)國。近年來，豌豆因其適應(yīng)性強(qiáng)、用途廣泛、營養(yǎng)價(jià)值高、經(jīng)濟(jì)效益和種植效益好等優(yōu)點(diǎn)被生產(chǎn)者和消費(fèi)者越來越關(guān)注，種植面積也不斷擴(kuò)大，主要分布在江蘇、浙江、湖北、甘肅、青海、內(nèi)蒙古等20多個(gè)?。▍^(qū)、市）［15］。然而，我國西北地區(qū)淡水資源缺乏，土壤鹽漬化嚴(yán)重［16］，嚴(yán)重影響著豌豆產(chǎn)量和品質(zhì)，所以探尋減緩?fù)愣股a(chǎn)中鹽脅迫的途徑是非常必要的。

一氧化氮（nitricoxide，NO）是一種最新發(fā)現(xiàn)且廣泛存在于植物細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的信號分子，參與調(diào)節(jié)許多生理過程［17－18］。適量濃度的NO可以減輕鹽脅迫下植物幼苗生長的抑制作用［19］、維持鹽脅迫下細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性以及緩解植物葉片葉綠素的降解和氧化損傷［20－21］，還維持細(xì)胞滲透平衡和誘導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)多種抗氧化酶的活性［22］，從而提高植物的抗逆能力。王芳等［23］研究表明，外源NO對Cd脅迫下玉米（Zeamays）生長有一定的緩解作用，可以增強(qiáng)玉米幼苗對Cd毒害的抗性。張艷艷等［24］指出NO對鹽脅迫下玉米幼苗生長所受到的抑制具有緩解作用。張宋智等［25］研究表明，黃金樹（Catalpaspeciosa）種子在外源NO供體亞硝基鐵氰化鈉（SNP）浸種后萌發(fā)得到的幼苗耐鹽性較優(yōu)。趙瀅等［26］研究表明，外源NO能顯著提升鹽脅迫下山葡萄（Vitis amurensis）葉片SOD和APX活性，減少 MDA的產(chǎn)生和積累，保護(hù)光合機(jī)構(gòu)免受活性氧傷害，從而提高葉片葉綠素含量。謝英贊等［27］發(fā)現(xiàn)，在一定程度上緩解鹽脅迫對決明（Cassiaspectabilis）幼苗造成的傷害。劉建新等［28］研究表明，NO參與鹽脅迫下Pro積累的調(diào)控。雖然前人對NO已做較多的研究，但有關(guān)內(nèi)外源NO對鹽脅迫下豌豆生長的調(diào)節(jié)效應(yīng)及機(jī)理還鮮有報(bào)道。因此，本文以豌豆為試驗(yàn)材料，研究內(nèi)外源NO對鹽脅迫下豌豆生長的影響，以期揭示NO提高豌豆耐鹽的生理機(jī)制，為開展豌豆種質(zhì)資源研究和確立豌豆鹽漬地優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

試驗(yàn)于2013年3－6月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試豌豆品種為耐鹽性較弱的“隴豌一號”，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所提供。選取大小一致且無病蟲害、顆粒飽滿的豌豆種子，流水沖洗20min，1%的84消毒液消毒10min，無菌水沖洗4次，吸水紙吸干后播種于盛有滅過菌的蛭石培養(yǎng)缽中（直徑15cm），移至光照培養(yǎng)箱［光照12h/d，溫度（23±1）℃，空氣相對濕度80%，光通量密度400μmol/m2·s］進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)，每2 d澆灌一次1/2Hoagland營養(yǎng)液。待4、5片真葉展開后，挑選長勢一致的幼苗，開始以下澆灌處理（處理液的pH 均為7）：1）CK （1/2Hoagland 營養(yǎng)液）；2）NO （100μmol/L SNP）；3）NaCl（100mmol/L NaCl）；4）NaCl＋NO （100mmol/L NaCl＋100μmol/L SNP）；5）NaCl＋SF（100mmol/L NaCl＋100μmol/L亞鐵氰化鈉）；6）NaCl＋c－PTIO（100mmol/L NaCl＋100μmol/L 2－4－羧苯基四甲基咪唑烷－1－氧－3－氧化物）；7）NaCl＋c－PTIO＋NO （100mmol/L NaCl＋100μmol/L c－PTIO＋100μmol/L SNP）。每次每盆澆50mL，連續(xù)處理8d后取豌豆幼苗植株進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)測定。

1.2 測定指標(biāo)與方法

處理結(jié)束后，每處理隨機(jī)選取30株幼苗，分別測量胚根長和胚芽長（胚根、胚芽長采用精度0.1mm的游標(biāo)卡尺直接測量），測定地上部和地下部干重（95℃殺青10min，65℃下烘至恒重并稱重），求平均值，根冠比通過根系干重/地上部干重計(jì)算。葉綠素含量測定采用丙酮乙醇混合法［29］；可溶性蛋白測定采用考馬斯亮藍(lán)G－250法［29］；可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法［29］；超氧化物歧化酶（SOD）測定采用氮藍(lán)四唑（NBT）法［30］；過氧化物酶（POD）測定采用愈創(chuàng)木酚法［30］；過氧化氫酶（CAT）測定采用紫外分光光度法［30］。葉片質(zhì)膜相對透性的測定采用電導(dǎo)儀法［30］。相對電導(dǎo)率＝R1/R2×100%，R1為處理后測得的電導(dǎo)率；R2為處理并煮沸后測得的總電導(dǎo)率；丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法［31］；脯氨酸（Pro）含量測定采用茚三酮顯色法［31］，每處理重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖，SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下豌豆幼苗生長對NO的響應(yīng)

在幼苗生長過程中，胚根長和胚芽長是反映幼苗生長的關(guān)鍵指標(biāo)。由表1可知，與對照CK相比，外源NO對豌豆幼苗胚芽和胚根生長無顯著影響，而鹽脅迫則顯著抑制了胚根和胚芽的生長。與NaCl處理相比，添加外源NO能顯著提高胚根長和胚芽長，NaCl＋NO處理使胚芽長增加25.34%，胚根長增加38.26%（P＜0.05），而NaCl＋c－PTIO＋NO處理較NaCl＋NO抑制了胚芽及胚根的伸長，說明外源NO能緩解鹽脅迫對二者的抑制作用。此外，鹽脅迫下用NO清除劑c－PTIO處理胚芽長顯著低于NaCl處理，這表明內(nèi)源NO可能也參與鹽脅迫的緩解作用。

鹽脅迫和NO處理對豌豆幼苗的干重和根冠比也有顯著影響。與CK相比，添加外源NO對豌豆幼苗的干重和根冠比無明顯效應(yīng)。NO能顯著增加鹽脅迫下豌豆地上部和地下部干重以及根冠比。NaCl處理明顯降低了豌豆幼苗的干重（P＜0.05），而NaCl＋c－PTIO＋NO處理使地上部干重高于NaCl處理但低于NaCl＋NO處理，但其地下部干重?zé)o明顯差異。說明外源NO能緩解鹽脅迫阻礙豌豆幼苗干重的增加。NaCl＋c－PTIO處理使干重顯著低于NaCl處理（P＜0.05），表明內(nèi)源NO也參與了該緩解過程。同時(shí)，與NaCl處理相比，添加NO顯著增加了鹽脅迫下的根冠比。

表1 NO對鹽脅迫下豌豆幼苗胚芽和胚根長的影響Table 1 Effects of NO on length of germ and radical of pea seedling under salt stress

2.2 NO對鹽脅迫下豌豆幼苗葉綠素含量的影響

由圖1可以看出，與CK相比，添加外源NO對豌豆幼苗葉片的葉綠素含量沒有影響。NaCl處理顯著降低了葉綠素含量，添加外源NO能顯著提高鹽脅迫下豌豆幼苗葉片的葉綠素含量，NaCl＋c－PTIO＋NO處理下葉綠素含量顯著低于NaCl＋NO處理，NaCl＋NO處理較NaCl處理和NaCl＋c－PTIO＋NO處理下葉綠素含量分別增加了44.23%和19.68%（P＜0.05）。這說明外源 NO能緩解鹽脅迫對豌豆植株光合的抑制作用。NaCl處理與NaCl＋c－PTIO處理葉綠素含量無顯著差異，表明內(nèi)源NO對豌豆植株光合作用無明顯調(diào)節(jié)作用。

圖1 NO對鹽脅迫下豌豆幼苗葉綠素含量的影響Fig.1 Effects of NO on chlorophyll content of pea seedling under salt stress

2.3 NO對鹽脅迫下豌豆幼苗可溶性蛋白含量、可溶性糖含量和Pro含量的影響

由圖2可以看出，非鹽脅迫下，添加NO對豌豆幼苗葉片中可溶性蛋白含量無明顯影響。NaCl處理使豌豆葉片中可溶性蛋白含量降低22.43%，鹽脅迫下添加外源NO可使豌豆幼苗葉片可溶性蛋白含量顯著增加。NaCl＋c－PTIO＋NO處理較NaCl脅迫對可溶性蛋白含量無明顯影響，說明外源NO參與可溶性蛋白合成的調(diào)節(jié)。而NaCl＋c－PTIO處理與NaCl處理下可溶性蛋白含量無顯著差異，表明內(nèi)源NO對可溶性蛋白合成無明顯調(diào)節(jié)作用。

與CK相比，添加NO對豌豆幼苗葉片中可溶性糖含量無明顯影響。NaCl脅迫下可溶性糖含量降低25.43%（P＜0.05），添加外源NO可使鹽脅迫下豌豆幼苗葉片中可溶性糖含量顯著增加（P＜0.05）。NaCl＋c－PTIO＋NO處理較NaCl脅迫對可溶性糖含量無明顯影響，說明外源NO參與可溶性糖合成的調(diào)節(jié)。NaCl＋c－PTIO處理時(shí)可溶性糖的含量急劇下降，與NaCl處理差異顯著且添加NO能逆轉(zhuǎn)鹽脅迫下c－PTIO對豌豆葉片可溶性糖含量的影響，表明內(nèi)源NO參與可溶性糖含量的調(diào)節(jié)。

外源NO處理與CK相比，豌豆幼苗葉片脯氨酸含量無顯著變化。NaCl處理明顯提高了豌豆葉片的脯氨酸含量（P＜0.05），NaCl＋NO處理也明顯提高了鹽脅迫時(shí)豌豆葉片的脯氨酸含量（P＜0.05），且比NaCl處理高23.63%，而NaCl＋c－PTIO＋NO處理下脯氨酸含量顯著低于NaCl＋NO處理。由此說明外源NO促進(jìn)了鹽脅迫下豌豆葉片脯氨酸的合成。NaCl＋c－PTIO處理下脯氨酸含量與NaCl處理無顯著差異，表明內(nèi)源NO對脯氨酸的合成無明顯調(diào)控作用。

圖2 NO對鹽脅迫下豌豆幼苗可溶性蛋白（A）含量、可溶性糖（B）含量和Pro（C）含量的影響Fig.2 Effects of NO on soluble protein（A）content，soluble sugar（B）content and Pro（C）content of pea seedling under salt stress

2.4 NO對鹽脅迫下豌豆幼苗SOD、POD、CAT活性的影響

由表2可看出，與CK相比，NO處理下豌豆葉片中SOD活性無明顯變化。NaCl處理下，豌豆幼苗葉片中SOD活性明顯低于對照CK（P＜0.05），NaCl＋NO處理則明顯增加了鹽脅迫下豌豆幼苗葉片SOD活性（P＜0.05），而NaCl＋c－PTIO＋NO處理下SOD活性則顯著低于NaCl＋NO，說明外源NO提高了鹽脅迫下豌豆幼苗葉片SOD的活性。NaCl＋c－PTIO處理加劇了鹽脅迫對SOD活性的抑制，說明內(nèi)源NO也參與SOD活性的調(diào)節(jié)。NO處理和NaCl脅迫均使豌豆幼苗POD活性低于CK。與NaCl處理相比，NaCl＋NO處理使得POD活性顯著增加，而NaCl＋c－PTIO＋NO處理下POD活性與NaCl處理無顯著差異，表明外源NO提高了鹽脅迫下豌豆幼苗葉片中POD的活性。NaCl＋c－PTIO處理與NaCl處理下POD活性無顯著差異，表明內(nèi)源NO對豌豆幼苗葉片中POD活性無明顯調(diào)節(jié)作用。NO處理對豌豆幼苗葉片中CAT活性較CK無明顯效應(yīng)。在NaCl處理下，豌豆幼苗葉片CAT的活性明顯降低（P＜0.05），NaCl＋NO處理使CAT活性明顯增高。NaCl＋c－PTIO＋NO處理下CAT活性顯著低于NaCl＋NO處理，說明外源NO增加了鹽脅迫下豌豆幼苗葉片的CAT活性。NaCl＋c－PTIO處理下CAT活性顯著低于NaCl處理，表明內(nèi)源NO也參與了鹽脅迫下豌豆幼苗葉片中CAT活性的調(diào)控。

表2 NO對鹽脅迫下豌豆幼苗SOD、POD、CAT活性的影響Table 2 Effects of NO on the activity of SOD，POD and CAT of pea seedling under salt stress

2.5 外源NO對鹽脅迫下豌豆幼苗葉片質(zhì)膜相對透性和丙二醛含量的影響

由圖3A可知，NO處理下豌豆幼苗葉片質(zhì)膜相對透性與CK無顯著差異。NaCl脅迫使質(zhì)膜相對透性增大，且明顯高于CK（P＜0.05），NaCl＋NO處理較NaCl脅迫使豌豆葉片的質(zhì)膜相對透性降低，降低了32.62%（P＜0.05），NaCl＋c－PTIO＋NO處理下質(zhì)膜相對透性顯著低于NaCl＋NO處理，說明外源NO能緩解鹽脅迫下豌豆幼苗葉片質(zhì)膜的相對透性。而NaCl處理與NaCl＋c－PTIO相比，質(zhì)膜相對透性無顯著差異，表明內(nèi)源NO對豌豆幼苗葉片質(zhì)膜相對透性無明顯調(diào)控作用。從圖3B可以看出，NO處理下豌豆葉片MDA含量與CK差異不顯著。NaCl處理下，豌豆幼苗葉片的MDA含量顯著高于CK（P＜0.05）。而NaCl＋NO處理可以明顯降低鹽脅迫下豌豆葉片MDA的含量（P＜0.05），并且NaCl＋NO處理下MDA含量顯著低于NaCl＋c－PTIO＋NO，說明外源NO可以緩解鹽脅迫造成的豌豆幼苗葉片中MDA含量的增加。NaCl＋c－PTIO處理促進(jìn)了鹽脅迫下MDA含量的增加，表明內(nèi)源NO也參與鹽脅迫下豌豆葉片中MDA合成的調(diào)控。

圖3 不同處理下豌豆幼苗葉片質(zhì)膜相對透性（A）和MDA（B）含量的變化Fig.3 The membrane relative permeability and MDA content of pea seedlings leaves with different treatments

3 討論

鹽脅迫能對幼苗生長產(chǎn)生一定抑制作用，破壞細(xì)胞膜的完整性、影響有關(guān)物質(zhì)的積累，改變某些酶的功能［32］。而外源NO能作為一種信號分子促進(jìn)胚芽和胚根生長，增加生物量，減少非生物脅迫下植物體內(nèi)ROS的積累，緩解各種脅迫造成的氧化損傷，從而增強(qiáng)植物的適應(yīng)能力［33］。

1）鹽脅迫下，植物的生長及生理指標(biāo)會(huì)受到一定的影響。實(shí)驗(yàn)表明，外源NO供體SNP能顯著促進(jìn)鹽脅迫下豌豆種子胚根和胚芽生長，增加幼苗干物質(zhì)積累以及根冠比，并且顯著增加了豌豆葉片葉綠素含量，表明外源NO有助于維持豌豆葉片的葉綠素含量，提高了葉片細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力和耐鹽能力，蔣明義等［34］證實(shí)滲透脅迫下葉綠素的降解主要由活性氧的氧化損傷引起，所以NO消除了大量的活性氧，從而緩解了鹽脅迫帶來的氧化損傷，促進(jìn)了葉綠素的合成。

2）植物通過可溶性蛋白和可溶性糖的積累來維持細(xì)胞的滲透平衡，從而緩解鹽離子的毒害作用［35］。本試驗(yàn)中，鹽脅迫顯著降低了豌豆幼苗葉片中可溶性蛋白和可溶性糖含量，添加外源NO能使可溶性蛋白和可溶性糖含量顯著升高。脯氨酸積累是植物對逆境脅迫的一種重要的防護(hù)機(jī)制，脯氨酸不僅作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，還包括在清除ROS，提高抗氧化能力，穩(wěn)定大分子結(jié)構(gòu)，降低細(xì)胞酸性以及解除氨毒等方面起重要作用［36］。本研究表明，NO處理可明顯提高NaCl脅迫下豌豆幼苗葉片的脯氨酸含量，這和吳雪霞等［37］的結(jié)論一致。這表明外源NO緩解了鹽脅迫對豌豆幼苗的抑制作用。

3）逆境脅迫下，植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），對植物造成傷害，SOD是清除生物體內(nèi)O2－·的唯一酶類，POD和CAT是植物體內(nèi)H2O2的清除酶。SOD、POD、CAT等保護(hù)酶類在植物體內(nèi)協(xié)同作用，在逆境脅迫中清除過量的ROS，維持ROS的代謝平衡，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，從而使植物在一定程度上忍耐、減緩或抵御逆境脅迫傷害［38］。最近研究發(fā)現(xiàn)，NO作為一種信號分子對植物逆境生理起重要作用，主要與其對ROS代謝的調(diào)節(jié)有關(guān)，外源NO可以誘導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)多種抗氧化酶類的活性，從而提高植物的抗逆能力［39］。本研究發(fā)現(xiàn)，0.1mmol/L SNP可不同程度地提高鹽脅迫下豌豆葉片SOD、POD、CAT的活性，這與焦娟等［40］和郁繼華等［41］報(bào)道結(jié)論一致。但NO對鹽脅迫下豌豆葉片3種保護(hù)酶的誘導(dǎo)效果并不相同，這可能與鹽脅迫下SOD、POD和CAT在膜脂過氧化途徑中產(chǎn)生的位置以及NO對3種保護(hù)酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制不完全相同有關(guān)［42－43］。

4）細(xì)胞膜是受逆境脅迫最敏感的部位之一，鹽脅迫會(huì)對細(xì)胞膜造成膜脂過氧化傷害，并使膜的透性增大，導(dǎo)致膜內(nèi)物質(zhì)向外滲漏，并最終引起細(xì)胞死亡，而MDA是膜脂過氧化的指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，外源NO供體SNP處理明顯降低了NaCl脅迫下豌豆幼苗葉片的質(zhì)膜相對透性，同時(shí)明顯降低葉片中MDA的含量，這與肖強(qiáng)和鄭海雷［44］的結(jié)論一致。從而證實(shí)了外源NO可以緩解鹽脅迫造成的豌豆幼苗葉片的膜脂過氧化，對細(xì)胞膜具有保護(hù)和修復(fù)作用，可減輕或防止膜系統(tǒng)的過氧化傷害，這與蘆翔等［45］的研究結(jié)果一致。

5）亞鐵氰化鈉是SNP的類似物，在生物體中分解后除不產(chǎn)生NO外，其他產(chǎn)物與SNP相同，結(jié)果表明：鹽脅迫下用亞鐵氰化鈉處理豌豆幼苗對胚芽和胚根生長、干物質(zhì)積累、葉綠素含量、可溶性蛋白和可溶性糖含量、抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT）與NaCl脅迫均無明顯差異，說明緩解鹽脅迫對植物生長抑制發(fā)揮作用的是NO，這與郁繼華等［41］、周萬海等［46］、樊懷福等［47］的研究結(jié)果相同。用NO清除劑c－PTIO處理加劇了鹽脅迫對豌豆幼苗生長的抑制，如胚芽干重、SOD活性、CAT活性、可溶性糖含量均降低，MDA含量增高。

4 結(jié)論

內(nèi)外源NO均能緩解鹽脅迫對豌豆幼苗生長的抑制。非鹽脅迫下，外源NO對豌豆胚芽和胚根生長、幼苗干重以及葉片中葉綠素含量、可溶性蛋白和可溶性糖含量、MDA和Pro含量、SOD和CAT的活性及質(zhì)膜相對透性均無顯著影響。NaCl脅迫下，施加外源NO促進(jìn)了胚芽、胚根的生長并增加了幼苗干重、根冠比和葉綠素的含量；顯著降低了豌豆幼苗葉片中膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的含量，維持鹽脅迫下細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，增加了豌豆幼苗葉片中Pro含量以提高細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量和組織持水能力，來緩解鹽脅迫對豌豆幼苗的傷害。此外外源NO通過可溶性蛋白和可溶性糖的累積來協(xié)調(diào)細(xì)胞與外界的滲透平衡，從而緩解鹽離子的毒害。內(nèi)源NO對鹽脅迫下豌豆幼苗生長也有一定的調(diào)控作用，如胚芽生長和干重的調(diào)節(jié)，可溶性糖、膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量的調(diào)節(jié)以及SOD、CAT活性的調(diào)節(jié)。

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