兩種方法在二斑葉螨電壓門控鈉離子通道基因突變檢測中的應用

楊順義，岳秀利，王進軍，沈慧敏＊，郭金梅，沈一凡，周興隆

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)省部共建教育部重點實驗室 中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展中心，甘肅 蘭州730070；2.西南大學植物保護學院 昆蟲學及害蟲控制工程重點實驗室，重慶400716）

二斑葉螨（Tetranychusurticae）是一種世界性害螨，可危害1100多種寄主植物，除了糧食作物、果樹、花卉、蔬菜等以外，還可以危害城市綠地植物和牧草，且隨著全球變暖，該葉螨在部分寄主植物上的危害有逐漸加重的趨勢［1－3］。二斑葉螨由于體型較小、世代周期短、抗逆性強等特點，抗性發(fā)展迅速［4］，對多種農(nóng)藥尤其是甲氰菊酯已產(chǎn)生嚴重的抗藥性。甲氰菊酯屬擬除蟲菊酯類殺蟲殺螨劑，作用靶標為電壓門控鈉離子通道（voltage－gated sodium channels，VGSCs），VGSCs是一種較大的跨膜蛋白，包括4個同源結構域（I－IV），每個結構域由6個跨膜螺旋（S1－S6）組成。VGSCs的不敏感性主要由跨膜螺旋或連接處的點突變引起，主要發(fā)生在ⅡS4－ⅡS6和ⅢS6上［5］，并且有的突變與擊倒抗性和超擊倒抗性有著密切聯(lián)系。至今，在蛛形綱蜱螨類以及其他昆蟲抗擬除蟲菊酯種群靶標基因VGSCs的點突變已有很多報道。在二斑葉螨抗性種群VGSCs基因中只發(fā)現(xiàn)3個突變，即L1022V、A1215D和F1538I，并且L1022V和F1538I突變對擊倒抗性起著主要作用［6－7］。在朱砂葉螨（T.cinnabarinus）抗甲氰菊酯種群中同樣發(fā)現(xiàn)存在F1538I突變［8］；在蜂螨（Varroadestructor）中，VGSCs上也有4個突變F758L，L826P，I982V和M1055I［9］，而電生理的研究表明L826P突變對氯氟胺氰戊菊酯敏感性降低起著重要的功能作用［10］。在家蠅（Muscadomestica）的VGSCs中，最常見的L1014F/H/S突變在擊倒抗性和超擊倒抗性種群中都存在，而M918T突變只存在于超擊倒抗性種群中［11－13］。靶標VGSCs基因突變是害螨及昆蟲對擬除蟲菊酯類藥劑產(chǎn)生抗性的主要機制。

目前，基因突變檢測的方法很多，主要有焦磷酸直接測序（direct pyrosequencing，DS），單鏈構象多態(tài)性分析（single stranded conformation polymorphism，SSCP），限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism，PCR－RFLP）以及實時熒光定量PCR（real－time quantitive PCR，RT－qPCR）和毛細管電泳法（capillary electrophoresis，CE）［14］等。高明等［15］通過克隆測序發(fā)現(xiàn)甜菜夜蛾（Spodopteraexigua）抗性種群鈉離子通道基因ⅡS6上存在L1014F突變。各種檢測方法優(yōu)缺點不一，有必要尋找一種經(jīng)濟、靈敏且有效的突變檢測方法。本研究采用PCR產(chǎn)物直接測序法與PCR－RFLP兩種不同的方法對田間采集的二斑葉螨種群VGSCs基因進行突變位點的檢測，旨在建立二斑葉螨對菊酯類農(nóng)藥抗性的分子檢測方法，為二斑葉螨的抗藥性治理提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試二斑葉螨

二斑葉螨相對敏感種群（susceptible strain，SS）：2007年6月底采自甘肅省蘭州市興隆山國家級森林公園金花忍冬（Lonicerachrysantha）上。在室內(nèi)采用葉碟法（培養(yǎng)皿底部墊有浸水和表面鋪一黑布的海綿，黑布上放用脫脂棉包圍的豇豆葉片）進行單對（挑一雌一雄在葉碟上飼養(yǎng)，不接觸任何藥劑）繁殖，待種群擴大后轉移到盆栽豇豆（Vignaunguiculata）苗上擴繁。田間抗性種群：LZ－R和WW－R種群于2012年8月分別采集于甘肅省蘭州市和武威市田間種植的茄子（Solanummelongena）和南瓜（Cucurbitamoschata）上，待種群在室內(nèi)擴繁定殖后，測定其對甲氰菊酯的抗性分別達到27.4和23.1倍。以上二斑葉螨SS、WW－R和LZ－R種群飼養(yǎng)在養(yǎng)蟲室盆栽的豇豆苗上?？刂茥l件：溫度（26±1）℃，相對濕度（75±5）%，光照14h，黑暗10h。

1.2 主要藥劑及儀器

20%甲氰菊酯乳油（紅太陽農(nóng)藥集團有限公司），RNA提取試劑盒RNeasy?Plus Micro Kit（Qiagen公司），反轉錄試劑盒PrimerScript?RT Reagent Kit，rTaq酶等PCR相關試劑（TaKaRa公司），限制性核酸內(nèi)切酶Sau3AI和BclI（Thermo公司），S1000TMThermal Cycling PCR儀（Bio－Rad公司），PowerPac Basic電泳儀（Bio－Rad公司），Universal Hood II凝膠成像儀（Bio－Rad公司），Nanovue核酸濃度測定儀（GE Healthcare公司）。

1.3 二斑葉螨總RNA提取

于2012年9月分別挑取SS、WW－R和LZ－R種群的二斑葉螨雌成螨約500頭，按照Qiagen公司RNA提取試劑盒RNeasy?Plus Micro Kit使用說明書提取總RNA，具體操作步驟如下：

1）預先將研缽用液氮進行多次冷凍，之后加入待研磨樣品，反復研磨，再加入350μL Buffer RLT plus繼續(xù)研磨均勻，轉移至2mL離心管；

2）將離心管置離心機中13000r/min離心3min，吸取上清液，記住大致體積V，轉移到gDNA Eliminator spin column離心管，10000r/min離心30s，丟掉柱子保存液體；

3）在上述液體中加入V體積的70%酒精，混勻；

4）轉移上述液體至RNeasy MinElute spin column離心管中，蓋嚴蓋子，10000r/min離心15s；

5）在RNeasy MinElute spin column離心管中加入700μL Buffer W1，蓋嚴蓋子，10000r/min離心15s；

6）在RNeasy MinElute spin column離心管中加入500μL Buffer RPE，蓋嚴蓋子，10000r/min離心15s；

7）在RNeasy MinElute spin column離心管中加入500μL的80%酒精，蓋嚴蓋子，10000r/min離心2min；

8）空離。將柱子放入一新的2mL離心管里，開蓋，13000r/min離心5min。

9）洗脫RNA。將柱子放入一新的1.5mL的收集管中。在柱子膜中央加入20μL RNase－free water，輕輕蓋上蓋子，13000r/min離心1min，棄柱子，得到的即所需RNA。

對提取得到的總RNA經(jīng)Nanovue核酸濃度測定儀測定其濃度時，依照A260/280和A260/230的值確定RNA純度；RNA純度確定后進行瓊脂糖電泳膠電泳，根據(jù)條帶的數(shù)目及亮度檢測RNA的完整性。最終，選取A260/280在1.8～2.2之間，A260/230在2.0～2.4之間的RNA樣品保存于－80℃冰箱，備用。

1.4 反轉錄合成第一鏈cDNA

將提取得到的二斑葉螨SS、WW－R和LZ－R總RNA分別反轉錄合成第一鏈cDNA，方法參照Takara公司反轉錄試劑盒PrimerScript?RT Reagent Kit Perfect Real time試劑盒說明書進行。反應體系10μL：5×Prime－Script?Buffer（for Real Time），2μL；PrimeScript?RT Enzyme Mix I，0.5μL；Oligo dT Primer（50μmol/L），0.5μL；Random 6mers（100μmol/L），0.5μL；總RNA不超過0.5μg；最后補充RNase Free dH2O至10μL。待所有樣品加完后，將其放入PCR儀中37℃反轉錄反應15min，85℃反轉錄酶失活反應5s。反應完畢后，測定cDNA濃度，將反轉錄產(chǎn)物保存于－20℃冰箱，備用。

1.5 引物設計

根據(jù)二斑葉螨在線基因組數(shù)據(jù)庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/bogas/overview/Tetur）中VGSCs基因（基因登錄號：Tetur34g00970）全長序列以及該基因序列上報道存在的F1022V、A1215D和F1538I突變等信息，用Primer 5.0軟件分別設計用于靶標位點VGSCs上F1022、A1215和F1538基因片段擴增的特異性引物以及PCR－RFLP反應的引物，引物名稱、片段長度及用途見表1。

表1 用于PCR擴增的特異性引物及其用途Table 1 Specific and quantitative primers and their use in the experiment

1.6 PCR反應及產(chǎn)物的測序

用于擴增二斑葉螨鈉通道相關突變基因的PCR反應體系為25μL，其中10×PCR buffer 2.5μL，MgCl2（25 mmol/L）2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，ddH2O 14.8μL，rTaq酶（5U/μL）0.2μL，上下游引物（10 μmol/L）各1μL，cDNA模板（二斑葉螨不同種群的cDNA）1μL。擴增條件：95℃預變性3min；95℃變性30s，55℃復性30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR反應產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，若檢測到目的條帶，且條帶單一、明亮，則可以直接進行測序。試驗重復3次。

1.7 突變位點的PCR－RFLP法檢測

A1215D突變位點的檢測：采用PCR－RFLP法擴增目的片段，擴增產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶消化成不同大小的片段，直接在瓊脂糖凝膠電泳上分辨。應用Primer 5.0軟件進行酶切位點的尋找，不同種群的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶Sau3AI酶切處理，識別位點為↓GATC。WW－R和LZ－R種群若發(fā)生GCT→GAT突變，就會產(chǎn)生一個酶切位點↓GATC，能被Sau3AI酶切消化產(chǎn)生498和99bp兩條帶，而SS種群由于是正常堿基，不存在相應的識別位點，不能被內(nèi)切酶消化，只有597bp的條帶。酶切后產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上電泳，根據(jù)片段的位置、大小即可鑒定出A1215D突變存在與否。試驗重復3次。

F1538I突變的檢測：由于F1538I突變位點附近沒有合適的酶切位點，根據(jù)創(chuàng)造酶切位點原理［16－17］，將引物3′端最后一個堿基錯配引入一個酶切位點T↓GATCA，即將突變堿基前一個堿基T人為的更改為G，并在此處設計引物（表1）。WW－R和LZ－R種群若發(fā)生TTC→ATC突變，就會產(chǎn)生一個酶切位點T↓GATCA，能被BclI酶切消化產(chǎn)生277和20bp兩條帶，而SS只有297bp一條帶，酶切后在2%的瓊脂糖凝膠上電泳，根據(jù)片段的大小、位置即可鑒定出F1538I突變的存在與否。試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 二斑葉螨VGSCs基因片段擴增及測序

2.1.1 突變位點區(qū)域片段擴增 二斑葉螨SS、WW－R和LZ－R種群VGSCs基因L1022、A1215和F1538位點片段擴增序列經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳如圖1，3種群擴增產(chǎn)物條帶單一、明亮，均為目的片段，符合PCR產(chǎn)物直接測序的基本要求。

圖1 二斑葉螨不同種群突變位點擴增電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of mutation sites in different strains of T.urticae

2.1.2 VGSCs基因PCR產(chǎn)物測序結果 根據(jù)二斑葉螨SS、WW－R和LZ－R種群A1215和F1538位點部分基因片段測序結果表明，與二斑葉螨SS種群VGSCs基因核苷酸相比對，WW－R和LZ－R種群均存在點突變，第一個突變位點在結構域ⅡS6和ⅢS1連接處，GCT（丙氨酸）被GAT（天冬氨酸）取代，即存在A1215D突變；第二個突變發(fā)生在結構域ⅢS6處，TTC（苯丙氨酸）被ATC（異亮氨酸）取代，即存在F1538I突變，其中 WW－R種群中F1538I為純合突變，而LZ－R中為雜合突變。然而，L1022V突變在二斑葉螨WW－R和LZ－R種群均未檢測到。

2.2 二斑葉螨VGSCs基因突變PCR－RFLP檢測

2.2.1 A1215D突變位點的PCR－RFLP檢測 采用PCR－RFLP的方法進行酶切鑒定二斑葉螨 WW－R和LZ－R種群A1215D突變。通過Sau3AI酶切處理SS、WW－R和LZ－R種群后，發(fā)現(xiàn) WW－R和LZ－R種群均能被內(nèi)切酶切開，產(chǎn)生498和99bp兩條帶，而SS種群只有一個597bp的條帶（圖2）。酶切前后根據(jù)條帶的位置、數(shù)目可以明顯的區(qū)分突變種群，但由于99bp的條帶太暗凝膠成像顯示不清晰，而498和597bp兩條帶區(qū)分明顯，并不影響突變位點的鑒定，說明二斑葉螨WW－R和LZ－R種群中都存在A1215D氨基酸突變，而根據(jù)酶切結果電泳圖沒有發(fā)現(xiàn)WW－R和LZ－R種群中存在雜合現(xiàn)象。

2.2.2 F1538I突變位點的檢測 采用錯配堿基引入酶切位點改進的PCR－RFLP方法進行F1538I的突變檢測，結果表明酶切前后WW－R和LZ－R種群條帶大小、位置沒有發(fā)生變化，與SS種群沒有明顯差異（圖3），即沒有被BclI內(nèi)切酶消化。為了排除是由于酶切前后電泳條帶在2%濃度瓊脂糖凝膠電泳條件下不易區(qū)分引起的，通過增加瓊脂糖凝膠電泳的濃度試驗結果相同；最后通過PCR產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn)，錯配堿基的引入會導致下游片段引物延伸時突變堿基處產(chǎn)生差異，從而不能形成BclI識別的酶切位點，即PCR－RFLP法不能有效地檢測出WW－R和LZ－R種群的F1538I突變。

圖2 二斑葉螨不同種群A1215D突變酶切電泳圖Fig.2 Electrophoretogram results of the A1215Dmutation in different T.urticae strains with enzyme digestion

圖3 二斑葉螨不同種群F1538I突變酶切電泳圖Fig.3 Electrophoretogram results of the F1538Imutation in different T.urticae strains with enzyme digestion

3 討論

目前，在二斑葉螨抗性種群VGSCs基因上發(fā)現(xiàn)存在L1022V、A1215D和F1538I共3個氨基酸突變。通過功能分析表明L1022V和F1538I突變在二斑葉螨對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的不敏感性起重要作用［6，18］，并且F1538I突變被認為是對擬除蟲菊酯具有最高效的抗性位點之一［19－20］，是家蠅鈉通道ⅢS6螺旋處的芳香族氨基酸殘基，同時也是擬除蟲菊酯的疏水性結合位點［21－22］；而A1215D突變的功能尚不明確，還需要進一步的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，田間采集的二斑葉螨WW－R和LZ－R種群對甲氰菊酯抗藥性的產(chǎn)生與F1538I突變有關，F(xiàn)1538I突變是二斑葉螨對甲氰菊酯產(chǎn)生高抗性的重要原因；這與前期本實驗室研究室內(nèi)飼養(yǎng)的二斑葉螨經(jīng)甲氰菊酯抗性培育45代后，同樣會產(chǎn)生F1538I突變的結果一致［23］。說明田間和室內(nèi)的二斑葉螨在甲氰菊酯藥劑的脅迫作用下，其靶標VGSCs基因均會產(chǎn)生同樣的突變，從而對其高抗性的產(chǎn)生起著重要作用。隨著二斑葉螨全基因組的發(fā)布，突變的檢測將更有利于對其抗性分子機理以及抗藥性檢測的研究［24］，其中與代謝相關的二斑葉螨水平基因轉移［25］以及二斑葉螨對寄主植物的適應性與抗藥性的關系［26］最近已有報道。因此，從分子水平上檢測擬除蟲菊酯類農(nóng)藥靶標VGSCs突變，對相關的抗性機理研究具有重要意義。

通過比較兩種突變檢測方法，PCR－RFLP法雖然較快速方便，不需要測序，但是由于酶切位點以及內(nèi)切酶價格的限制，并且只能在已知突變的情況下才能采用，這在一定程度上限制了該技術的使用，并且錯配堿基創(chuàng)造酶切位點的方法在堿基錯配后，有時可能會導致下游1～2個堿基不能正常擴增配對，降低了酶切鑒定的敏感度，本研究采用此方法則不能有效地檢測出F1538I突變。相對于PCR－RFLP法，通過PCR產(chǎn)物正反雙向直接測序，可以檢測出二斑葉螨突變位點A1215D和F1538I，并能明確突變堿基類型，重復性更好，結果更準確，但操作相對繁瑣，測序較耗時；而其他方法如高通量融解曲線法［27］等由于儀器昂貴，成本較高，也不適合一般實驗室采用。熊亮等［28］通過比較PCR產(chǎn)物直接測序法和高通量溶解曲線分析技術檢測膠質(zhì)瘤表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變類型發(fā)現(xiàn)，這兩種方法在檢測EGFR外顯子19突變率具有較高的一致性。因此，伴隨著新一代高通量分子測序技術的不斷進步和發(fā)展，測序周期將大大縮短，PCR產(chǎn)物直接測序法將更有利于害螨及昆蟲抗藥性的突變檢測。

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