四川白三葉根瘤菌遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育研究

潘明洪，凌瑤，景文，馬洪平，彭燕＊

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，四川 雅安625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，四川 雅安625014）

生物固氮是指自然界中的一些微生物和藍(lán)綠藻將大氣中的不能被植物利用的氮?dú)膺€原成可利用的氨的過程［1］。根瘤菌與豆科植物形成的共生固氮體系具有固氮能力強(qiáng)、固氮量高和抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是生物固氮中效率最高的體系，所固定的氮素約占生物固氮總量的65%［2］。近來有關(guān)的研究日益增多，馬霞等［3］發(fā)現(xiàn)在適宜氮素水平下接種根瘤菌可以明顯增加紫花苜蓿（Medicagosativa）的固氮百分率、生物固氮量和種子產(chǎn)量，李智燕等［4］研究顯示天藍(lán)苜蓿根瘤菌比紫花苜蓿根瘤菌具有更強(qiáng)的耐酸、耐鋁性，王衛(wèi)棟等［5］報(bào)道接種根瘤菌的紫花苜蓿在NaCl脅迫下具有較強(qiáng)的抗氧化和滲透調(diào)節(jié)能力。因此，了解根瘤菌的生物多樣性，選育高效與抗逆性能優(yōu)良的菌株用于農(nóng)林生產(chǎn)，對于應(yīng)對日趨嚴(yán)重的環(huán)境污染和干旱等逆境問題具有深遠(yuǎn)的意義。

白三葉（Trifoliumrepens）又名白車軸草、荷蘭翹搖等，是三葉草屬的重要豆科牧草，因其產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)良、適應(yīng)性強(qiáng)，在四川地區(qū)分布廣泛，可用作飼料、綠肥、堤岸防護(hù)草種、草坪以及蜜源和藥材等［6－7］。目前，國內(nèi)外有關(guān)白三葉根瘤菌遺傳多樣性及系統(tǒng)分類研究的報(bào)道頗少。1974年《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》［8］第8版以宿主范圍為依據(jù)，將其確定為三葉草根瘤菌（Rhizobiumtrifolii）。到了1984年，Jordan［9］將三葉草根瘤菌劃分到豌豆根瘤菌（R.leguminosarum），定為豌豆根瘤菌三葉草生物型（R.leguminosarumbv.trifolii）。劉曉云和陳文新［10］、呂飛等［11－12］和劉曉云等［13］在采用16SrDNA基因、nodA和nifH共生基因序列測定方法進(jìn)行三葉草根瘤菌的分類研究中也得到了相一致的結(jié)果。

16SrDNA因保守性高、信息量大、普遍性及快速簡便的特點(diǎn)而被稱為分子進(jìn)化種，并被作為系統(tǒng)分類研究中最合適的指標(biāo)［14］。16SrDNA PCR－RFLP指紋圖譜因具有種的特異性而成為根瘤菌系統(tǒng)分類研究的重要方法［15］。此外，持家基因recA、atpD、glnII、gyrB及thrC等［16］也越來越多地被應(yīng)用于根瘤菌新種群系統(tǒng)發(fā)育地位的確定，可應(yīng)用較為廣泛的細(xì)菌分離水平，從種內(nèi)到種間的水平以及更高級別的分析［17－18］。利用不同基因組位點(diǎn)的保守基因來確定細(xì)菌的分類地位，將是細(xì)菌分類發(fā)展的一個方向［19］。

本研究采用16SrDNA PCR－RFLP及16SrDNA基因、持家基因（recA、atpD、glnII）、結(jié)瘤基因（nodC）和固氮基因（nifH）系統(tǒng)發(fā)育分析方法，對分離自我國四川雅安、康定、瀘定、西昌、成都和樂山6個地區(qū)野生白三葉根瘤的69株菌進(jìn)行遺傳多樣性的研究，為進(jìn)一步揭示四川白三葉根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育地位提供可靠的理論依據(jù)，對于豐富根瘤菌資源具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為本實(shí)驗(yàn)室前期分離和保存的白三葉根瘤菌，來源于2011年8－9月在四川6個市縣收集野生白三葉的根瘤。根瘤菌的分離按照Vincent［20］經(jīng)典方法進(jìn)行，挑取單菌落，經(jīng)過多次純化，革蘭氏染色，鏡檢，斜面保藏［21］。共分離得到供試菌株69株，宿主植物均為白三葉，菌株編號及來源見表1。

表1 菌株來源及16SrDNA PCR－RFLP圖譜類型Table 1 The tested strains and the types of 16SrDNA PCR－RFLP fingerprint patterns

1.1.1 主要試劑和儀器 本研究所使用的PCR試劑及瓊脂糖凝膠電泳試劑購于天根生化科技（北京）有限公司，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，限制性內(nèi)切酶來自NEB（New England Biolabs）公司。主要儀器包括超凈工作臺，生化培養(yǎng)箱，恒溫水浴鍋，臺式離心機(jī)，PCR擴(kuò)增儀（Eppendorf，美國），Bio－Rad凝膠成像系統(tǒng)。

1.1.2 供試菌株的培養(yǎng) 供試菌株均用YMA培養(yǎng)基［22］培養(yǎng)，其成分為：甘露醇10.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO40.5g，NaCl 0.1g，酵母粉3.0g，瓊脂18～20g，蒸餾水1000mL，pH 6.8～7.0，培養(yǎng)溫度為28℃。

1.2 根瘤菌DNA的提取

本研究的相關(guān)試驗(yàn)工作從2013年5月開始在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。DNA的提取方法參照文獻(xiàn)［23］，以純根瘤菌為材料進(jìn)行。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品DNA的濃度，所有的DNA樣品于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 16SrDNA PCR擴(kuò)增與RFLP分析

以總DNA為模板，使用來源于大腸桿菌（Escherichiacoli）16SrDNA序列保守區(qū)域的2個引物P1（5′－CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT－3′）和 P6（5′－CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGAC TTCACCCC－3′），分別對應(yīng)于大腸桿菌的第8～37堿基位置和第1479～1506堿基位置［24］。引物P1和P6配制成10μmol/L濃度備用。PCR反應(yīng)體系為50μL，其中P1和P6各1μL，模板DNA 1μL，2×Taq PCR MasterMix 25μL，Taq DNA polymerase（2.5U/μL）0.5μL，加ddH2O至50μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3min；30個循環(huán)（94℃，變性，1min；55℃，退火，1min；72℃，延伸，2min）；72℃，延伸，10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，于－20℃保存。

參照Selenska－Pobell等［25］的方法，用HaeⅢ、MspⅠ、HinfⅠ和HhaⅠ4種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系為20μL，其中PCR產(chǎn)物10μL，10×NEB緩沖液2μL，內(nèi)切酶0.5μL，加ddH2O至20μL，過夜酶切，溫度為37℃。以2.0%瓊脂糖凝膠電泳，100V，2h，用自動凝膠成像系統(tǒng)拍照。對酶切電泳圖譜進(jìn)行分類，電泳圖譜上不同菌株具有相同的電泳條帶被認(rèn)為是同一個遺傳圖譜類型。

1.4 16SrDNA序列分析

根據(jù)16SrDNA PCR－RFLP遺傳圖譜類型，選取每種圖譜類型組合中的代表菌株，將其16SrDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行雙向測序，測序引物同擴(kuò)增引物。將測得的序列經(jīng)拼接后與從GenBank（NCBI）上獲得的根瘤菌相關(guān)種的序列進(jìn)行比對，經(jīng)Clustal X［26］和Treecon W［27］軟件包分析，用軟件MEGA 5.10按照Neighbor－joining［28］法構(gòu)建出以16SrDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹，并使用軟件DNAMAN 6.0計(jì)算各測試菌株16SrDNA序列的相似性。

莊大善人聽有“血光之災(zāi)”，額上的汗就冒了出來。他是想到了當(dāng)漢奸的胞弟莊槐。日本人在中國奸淫燒殺，無惡不作，人人得而誅之。胞弟竟助紂為虐，觸犯眾怒，必然身處險(xiǎn)境。風(fēng)傳新四軍深入敵后除惡鋤奸，莫非胞弟會給莊氏一族招來殺身之禍？

1.5 持家基因（recA、atpD、glnII）與結(jié)瘤基因（nodC）和固氮基因（nifH）的系統(tǒng)發(fā)育分析

持家基因的PCR擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)［29］。反應(yīng)體系為50μL，其中2×Taq PCR MasterMix 25μL，正向引物和反向引物各1μL，DNA模板1μL，Taq DNA polymerase（2.5U/μL）0.5μL，ddH2O 21.5μL。1）recA擴(kuò)增條件：95℃，預(yù)變性，3min；30個循環(huán)（94℃，變性，1min；54℃，退火，1min；72℃，延伸，1min）；72℃，延伸，6 min。2）atpD擴(kuò)增條件：95℃，預(yù)變性，3min；30個循環(huán)（94℃，變性，1min；58℃，退火，1min；72℃，延伸，1 min）；72℃，延伸，6min。3）glnII擴(kuò)增條件：95℃，預(yù)變性，3min；30個循環(huán)（94℃，變性，1min；55℃，退火，1 min；72℃，延伸，1min）；72℃，延伸，6min。

nodC和nifH基因PCR擴(kuò)增所用引物見文獻(xiàn)［30］。反應(yīng)體系為50μL，其中2×Taq PCR MasterMix 25 μL，正向引物和反向引物各1μL，DNA模板1μL，Taq DNA polymerase（2.5U/μL）0.5μL，ddH2O 21.5μL。1）nodC基因擴(kuò)增條件：95℃，預(yù)變性，3min；30個循環(huán)（94℃，變性，30s；55℃，退火，40s；72℃，延伸，1min）；72℃，延伸，6min。2）nifH基因擴(kuò)增條件：95℃，預(yù)變性，4min；30個循環(huán)（94℃，變性，30s；57℃，退火，30s；72℃，延伸，1min）；72℃，延伸，5min。

各基因PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，亦送往北京六合華大基因科技股份有限公司測序。用軟件MEGA 5.10分別對測得的代表菌株的基因序列與相應(yīng)的參比菌株序列進(jìn)行比對，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株16SrDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

以總DNA為模板，P1和P6為引物，供試菌株的16SrDNA PCR產(chǎn)物均能在1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測出條帶，大小約為1.5kb，這說明供試根瘤菌與其他細(xì)菌的16SrDNA片段大小基本一致。

2.2 16SrDNA PCR－RFLP分析

16SrDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物分別采用4種限制性內(nèi)切酶（HaeⅢ、MspⅠ、HinfⅠ和HhaⅠ）進(jìn)行酶切，經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳后拍照成像。供試菌株的HaeⅢ和MspⅠ酶切分別有4種圖譜類型，HinfⅠ和HhaⅠ酶切分別有3種圖譜類型（圖1）。電泳圖譜上不同菌株間遷移率相同的帶被認(rèn)為是同一個性狀，隨機(jī)標(biāo)記為A→D。所有69株供試菌株的16SrDNA的酶切圖譜類型總共有4種不同組合類型（表1），其中有Ⅰ類型（AAAA）66株菌，占據(jù)供試菌株的95.7%，其余Ⅱ（BBBB）、Ⅲ（CACA）、Ⅳ（DCDC）3種類型各有1株菌，僅占4.3%。結(jié)果表明，分離自白三葉草的根瘤菌16SrDNA PCR－RFLP圖譜存在較大差異，既有廣泛分布于各取樣地點(diǎn)的Ⅰ類型，同時又有來源于四川康定的Ⅰ和Ⅳ2種類型及四川樂山的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3種類型，所有供試菌株表現(xiàn)出一定的遺傳變異和地域差異。

圖1 供試菌株16SrDNA PCR－RFLP酶切組合圖譜Fig.1 16SrDNA PCR－RFLP fingerprint patterns

2.3 16SrDNA序列分析

根據(jù)16SrDNA PCR－RFLP分析結(jié)果和來源的不同挑選出9株代表菌株進(jìn)行16SrDNA序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析，并在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對相似序列?？偣策x取12株參比菌株，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。

由圖2可知，9株代表菌株分別歸屬于根瘤菌屬（Rhizobium）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）2個系統(tǒng)分支。圖譜類型為Ⅰ型（AAAA）的XC1110、LD1102、CD1105、KD1104、LS1102、YA1121，Ⅱ型（BBBB）的LS1101，Ⅳ型（DCDC）的KD1107的共8株菌株與根瘤菌屬構(gòu)成一個分支。其中，菌株XC1110和LD1102與R.leguminosarumbv.trifoliiATCC 14480T和R.leguminosarumbv.viciaeUSDA 2370T聚在一起，其相似性為100%。菌株 KD1104、CD1105、KD1107、LS1101、YA1121、LS1102具有相同的序列，與R.leguminosarumbv.trifoliiATCC 14480T和R.leguminosarumbv.viciaeUSDA 2370T序列相似性最高，達(dá)到了99.7%。圖譜類型為Ⅲ型（CACA）的菌株LS1105則與土壤桿菌屬單獨(dú)形成一支，與A.tumefaciensNCPPB 2437T的親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)到了99.5%。代表菌株與已知種的模式菌株的序列相似性，均大于目前界定屬內(nèi)16SrDNA序列相似性95%的標(biāo)準(zhǔn)［31］。以上結(jié)果表明，白三葉根瘤菌因存在的地理環(huán)境的不同而表現(xiàn)出一定的差異性，甚至在同一地理環(huán)境下也有較大程度的變異，與16SrDNA PCR－RFLP酶切圖譜類型分類結(jié)果基本一致。

圖2 代表菌株16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16SrDNA sequences of the representative strains

2.4 持家基因序列分析

根據(jù)16SrDNA序列分析和16SrDNA PCR－RFLP，對所選的9株代表菌株進(jìn)行持家基因（recA、atpD和glnII）部分序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。

2.5 nodC和nifH 基因序列分析

所選取的9株代表菌株，除了LS1105外，PCR均能成功擴(kuò)增出nodC和nifH基因，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4和圖5。

在nodC基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，YA1121、XC1110、LS1102、LS1101具有相同的序列，與R.leguminosarumbv.trifoliiATCC 14480T相似性為97.4%，KD1107、KD1104、CD1105與R.leguminosarumbv.trifoliiATCC 14480T相似性為95.7%，LD1102與R.leguminosarumbv.trifoliiATCC 14480T相似性為95.6%。

在nifH基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株KD1107、KD1104和LD1102與R.leguminosarumbv.trifolii9.2k具有相同的序列，相似性為100%。LS1102、XC1110、LS1101、CD1105和YA1121具有相同的序列，與R.leguminosarumbv.trifoliiR2－1的親緣關(guān)系最近，相似性為97.5%。

圖3 代表菌株持家基因recA、atpD和glnII拼接后的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on concatenated sequences of recA，atpD，and glnII of the representative strains

圖4 代表菌株結(jié)瘤基因nodC構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on nodulation gene nodCof the representative strains

以上結(jié)果表明，除了LS1105以外的8菌株均以R.leguminosarumbv.trifolii親緣關(guān)系最近，可以確定其為三葉草根瘤菌。

3 討論

本研究以分離自我國四川部分地區(qū)野生豆科植物白三葉根瘤的69株菌株為研究對象，充分結(jié)合16SrDNA PCR－RFLP、持家基因（atpD、recA和glnII）及共生基因的系統(tǒng)發(fā)育分析等方法進(jìn)行了遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育研究，初步探討了四川地區(qū)白三葉根瘤菌可能的分類地位，對于進(jìn)一步豐富中國根瘤菌資源的研究具有積極的意義。

圖5 代表菌株固氮基因nifH構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on nitrogen－fixing gene nifHof the representative strains

結(jié)合16SrDNA PCR－RFLP、16SrDNA序列分析結(jié)果，69株供試菌株被鑒定到屬的水平。來自于康定、樂山的菌株具有變異的圖譜類型，而來自雅安、瀘定、西昌和成都的菌株具有單一的圖譜。酶切圖譜類型為Ⅰ型（AAAA）的 KD1104、YA1121、XC1110、CD1105、LD1102、LS1101，Ⅱ型（BBBB）的 LS1101，Ⅳ型（DCDC）的KD1107三種類型的8株菌株歸屬于根瘤菌屬，而Ⅲ型（CACA）的菌株LS1105歸屬于土壤桿菌屬，所有供試菌株共歸為兩個屬，較為單一。這與劉曉云和陳文新［10］分離自三葉草的根瘤菌分別歸屬于快生根瘤菌屬、中華根瘤菌屬（Sinorhizobium）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）和慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）的研究結(jié)果不太一致，顯示出其屬、種在地區(qū)分布的局限性和專一性，可能與四川盆地特殊的地理環(huán)境和氣候條件有關(guān)。因?yàn)閯栽坪完愇男拢?0］分離的根瘤菌主要來自江西、湖北和云南等地的三葉草屬植物，范圍也相對較廣，從而具有較好的多樣性。本研究與眾多現(xiàn)有的研究一致，根瘤菌與豆科植物的共生關(guān)系因區(qū)域地理環(huán)境的差異而具一定的多樣性［32］，而同一采樣地點(diǎn)的根瘤菌在很大程度上受地域、生態(tài)環(huán)境影響而表現(xiàn)為相似的類群，這與Tian等［33］、楊亞珍等［34］、何恒斌等［35］、閻愛民和陳文新［36］的研究結(jié)果吻合。此外，各個采樣點(diǎn)的菌株雖然在酶切圖譜上有一定差異，但在16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹上則處于相同的位置，與冀玉良等［37］的研究結(jié)果相似。在今后的研究中有待擴(kuò)大地理范圍和菌株數(shù)量，以更全面地探索白三葉根瘤菌的種屬分布和系統(tǒng)分類。

持家基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果基本一致。除了LD1102與R.leguminosarumbv.viciaeUSDA 2370T外，代表菌株KD1104、CD1105、KD1107、LS1101、YA1121、LS1102、XC1110共7株與R.leguminosarumbv.trifoliiATCC 14480T的親緣關(guān)系最近，LS1105與A.tumefaciensNCPPB 2437T最近。在關(guān)于三葉草根瘤菌的系統(tǒng)分類研究中，Jordan［9］將三葉草根瘤菌定為豌豆根瘤菌的1個生物型R.leguminosarumbv.trifolii。劉曉云和陳文新［10］、呂飛等［11－12］的研究中供試的三葉草根瘤菌，與三葉草根瘤菌R.trifoliiARPV02、豌豆根瘤菌R.leguminosarumUSDA 2370的序列相似性最高，親緣關(guān)系最為接近。本研究中所供試的白三葉根瘤菌與R.leguminosarumbv.trifoliiATCC 14480T和R.leguminosarumbv.viciaeUSDA 2370T的親緣關(guān)系較近，結(jié)果支持Jordan［9］的觀點(diǎn)，即過去的三葉草根瘤菌、豌豆根瘤菌和菜豆根瘤菌3個種合并為1個種，以R.leguminosarum命名。

16SrDNA和持家基因序列分析與16SrDNA PCR－RFLP分析結(jié)果具有一定的差異。其可能的原因?yàn)椋?）16SrDNA PCR－RFLP廣泛用于大量菌株的快速分群，在數(shù)據(jù)處理過程中可能因人為的判斷而產(chǎn)生誤差。2）同一株菌株中有可能存在16SrDNA基因的不同拷貝，序列有所差異，導(dǎo)致酶切結(jié)果與序列分析結(jié)果不一致。3）16SrDNA序列分析可以鑒定到屬，但基因的橫向轉(zhuǎn)移及重組會影響親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近［38］。4）16SrDNA核糖體基因的高度保守性，只能鑒定到屬及容易鑒別的種，區(qū)分關(guān)系比較接近的種或菌株存在一定的局限［39］。

此外，本研究從白三葉根瘤中分離得到了土壤桿菌LS1105，此結(jié)果與國內(nèi)外學(xué)者在分離根瘤菌的過程中經(jīng)常獲得土壤桿菌的結(jié)果一致［40－41］。Mhamdi等［42］、Wang等［43］分別用gusA和CFP標(biāo)記土壤桿菌進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果表明，土壤桿菌不具備結(jié)瘤能力，但在根瘤菌的存在下可以進(jìn)入根瘤中定殖，與根瘤菌共存于根瘤內(nèi)。此外，菌株LS1105擴(kuò)增不出結(jié)瘤基因nodC和固氮基因nifH，同常佳麗［44］的研究結(jié)果一致，表明其不含共生基因，與其不能單獨(dú)侵染豆科植物結(jié)瘤相吻合。

4 結(jié)論

在本研究所分離自野生白三葉根瘤的69株菌株中，16SrDNA PCR－RFLP有4種圖譜類型，表明白三葉根瘤菌在四川具有較為豐富的多樣性，且表現(xiàn)出一定的地域分布特征。16SrDNA基因、持家基因、結(jié)瘤基因、固氮基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，證實(shí)了所分離菌株有68株為三葉草根瘤菌，且土壤桿菌不能擴(kuò)增出結(jié)瘤基因nodC、固氮基因nifH等共生基因。這對于研究白三葉根瘤菌的分類鑒定及遺傳多樣性提供了理論依據(jù)，為豐富四川地區(qū)白三葉根瘤菌資源及篩選能用于生產(chǎn)上的高效優(yōu)良菌株奠定了基礎(chǔ)，具有重大的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

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