DNMT1與DNA異常甲基化及腫瘤的關(guān)系

王 倩 綜述，唐維平 審校

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科，南昌 330006)

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyctransferace,DNMTs)是表觀遺傳學(xué)中催化并維持DNA甲基化的重要酶家族。在哺乳動(dòng)物中它分為3個(gè)家族：DNMT1、DNMT2、DNMT3[1-2]。DNMT1是DNA進(jìn)行復(fù)制修復(fù)并維持其正常甲基化的關(guān)鍵酶；DNMT2主要是tRNA的甲基轉(zhuǎn)移酶；DNMT3包含有3個(gè)亞基，3a、3b催化CpG島從頭甲基化轉(zhuǎn)移酶而3L是一個(gè)調(diào)節(jié)蛋白[3]。DNMT1是DNMT酶家族中最重要也是目前研究最多的一種酶。眾多研究發(fā)現(xiàn)DNMT1與DNA異常甲基化有關(guān)，并且二者與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也有密切關(guān)系。現(xiàn)就DNMT1、DNA異常甲基化與腫瘤的關(guān)系綜述如下。

1 DNMT1與DNA甲基化

1.1 DNMT1的發(fā)現(xiàn)、基因結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能 DNMT1是1964年Gold和Hurwit等研究人員在大腸桿菌中提取的第1個(gè)DNMT。1988年Bestor等[3]克隆出第1個(gè)真核生物C5胞嘧啶特異的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，命名為DNMT1。DNMT1是由1 616個(gè)氨基酸殘基編碼成的蛋白質(zhì)，其相對(duì)分子質(zhì)量183×103，定位在人染色體19p13.2～13.3，cDNA全長(zhǎng)為5 434 bp[4]。目前的研究結(jié)果認(rèn)為DNMT1包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即C端的催化端、N端的某些蛋白識(shí)別的靶區(qū)域及未知區(qū)域[5]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)DNMT1上調(diào)發(fā)生在DNA甲基化之前，也就是說(shuō)DNMT1的上調(diào)可能是DNA發(fā)生異常甲基化的重要原因。另一方面研究人員利用DNMT1抑制劑作用于腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)能夠一定程度抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，說(shuō)明DNMT1和腫瘤有一定的關(guān)系，同時(shí)說(shuō)明DNMT1作用DNA甲基化至腫瘤發(fā)生是一個(gè)可逆的過(guò)程。蘇玉等[6]總結(jié)出DNMT1不僅與胚胎發(fā)育、細(xì)胞衰老有關(guān)，也與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。DNMT1主要介導(dǎo)甲基化模式的建立與維護(hù)，DNMT1高表達(dá)致甲基化模式發(fā)生異常，抑癌基因沉默、原癌基因激活導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[7]。

1.2 DNA甲基化與CpG島 DNA甲基化是在DNMTs的催化下，將S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到未進(jìn)行甲基化胞苷-磷酸-鳥(niǎo)苷(CpG)二核苷酸中的胞嘧啶5′-C原子上形成5-甲基胞嘧啶的過(guò)程[8]。在正常生理情況下，啟動(dòng)子區(qū)的CpG二核苷酸有兩種狀態(tài)，一種是處于相對(duì)集中的非甲基化狀態(tài)，另一種是相對(duì)分散的甲基化狀態(tài)，把相對(duì)集中成簇存在的非甲基化CpG的一段DNA稱(chēng)為CpG島。CpG島一般位于基因的啟動(dòng)子區(qū)，大小為300～500 bp，此區(qū)域多為管家基因及組織表達(dá)特異基因[9]。CpG島與DNA甲基化有密切關(guān)系。2006年Rollins等[10]研究發(fā)現(xiàn)不易被甲基化的CpG島(邊界400 bp序列)有豐富的鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，而80%的結(jié)合位點(diǎn)在人和鼠中是保守的。Fan等[11]推測(cè)DNA甲基化從甲基化中心結(jié)構(gòu)Alu序列開(kāi)始向外延伸，當(dāng)延伸致CpG島周?chē)芗霓D(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和具有鋅指的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合以后則可以阻止甲基化向CpG島蔓延，阻止和蔓延達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡就形成穩(wěn)定的甲基化模式。當(dāng)環(huán)境發(fā)生改變，CpG島啟動(dòng)子區(qū)某些元件發(fā)生改變，本可以結(jié)合并阻礙DNA甲基化蔓延的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力減弱使阻礙功能變?nèi)跎踔料r(shí)，甲基化穩(wěn)定模式改變。

2 DNMT1、DNA異常甲基化與腫瘤的關(guān)系

2.1 DNMT1與腫瘤的關(guān)系 研究表明，DNMT1在多種腫瘤中呈高表達(dá)。DNMT1是DNA甲基化的關(guān)鍵酶，DNMT1活性增加促進(jìn)DNA異常甲基化。Ang等[12]通過(guò)免疫組化和免疫印跡兩種方法研究DNMT1在胰腺癌組織和相應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)，免疫組化結(jié)果得出78.7%(37/47)的癌組織中DNMT1呈高表達(dá)，而免疫印跡的評(píng)價(jià)結(jié)果得出癌組織中80%(16/20)呈高表達(dá)。提示DNMT1的異常激活可能在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。G?m?ri等[13]用免疫組化及PCR評(píng)價(jià)DNMT1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)也得出陽(yáng)性的結(jié)果。Zhang等[14]找到宮頸癌中有異常甲基化的基因，利用RNA干擾技術(shù)沉默DNMT1基因的表達(dá)，采用qPCR和免疫印跡方法檢測(cè)DNMT1 siRNA干擾對(duì)DNMT1酶活性的影響，結(jié)果表明DNMT1 siRNA能顯著降低宮頸癌中DNMT1的活性，抑制DNMT1在宮頸癌中的表達(dá)。通過(guò)流式細(xì)胞儀和MTT法分別檢測(cè)DNMT1 siDNA干擾對(duì)宮頸癌細(xì)胞的周期變化和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，得出DNMT1 siDNA干擾能使宮頸癌細(xì)胞凋亡率增加。DNMT1在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。Fan等[15]應(yīng)用免疫組化及real-time PCR分別檢測(cè)DNMT1 蛋白和DNMT1 mRNA在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，得出癌組織DNMT1呈高表達(dá)狀態(tài)，二者之間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用DNMT1抑制劑使肝細(xì)胞SMMC-7721凋亡，說(shuō)明DNMT1使肝細(xì)胞中的抑癌基因沉默導(dǎo)致肝癌，同時(shí)研究還得出患有乙型肝炎的患者更容易發(fā)生DNMT1上調(diào)。有人研究在卵巢上皮癌中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b均呈高表達(dá)，三者之間的關(guān)系呈正相關(guān)。Yang等[16]研究DNMT1 基因的多態(tài)性(rs 2114724,rs 2228611,rs 2228612,rs 8101866,rs 16999593)與中國(guó)南方人口胃癌的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)，得出DNMT1的rs16999593基因型是南方人口胃癌發(fā)生的主要基因。DNMT1在喉鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸癌等也有不同程度的表達(dá)。

2.2 DNA異常甲基化與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系 在生理狀態(tài)下，啟動(dòng)子區(qū)的CpG島(CpG二核苷酸聚集區(qū))處于非甲基化狀態(tài)，分散的CpG二核苷酸處于甲基化狀態(tài)。當(dāng)DNA甲基化異常時(shí)這種狀態(tài)被打破，啟動(dòng)子區(qū)的CpG島發(fā)生甲基化，導(dǎo)致調(diào)控基因表達(dá)受到抑制。1988年Feinberg等[17]通過(guò)檢測(cè)基因組中DNA甲基化胞嘧啶的豐度得出腫瘤組織呈現(xiàn)整體的低甲基化現(xiàn)象，1999年Qu等[18]通過(guò)甲基化敏感性酶的重復(fù)序列測(cè)定得出了相同的結(jié)論。研究充分證實(shí)基因組啟動(dòng)子區(qū)的CpG島會(huì)發(fā)生異常甲基化。由此可以推斷，在腫瘤細(xì)胞基因組中呈現(xiàn)整體低甲基化伴隨特定區(qū)域(CpG島)高甲基化狀態(tài)。腫瘤細(xì)胞發(fā)生這種現(xiàn)象有以下幾種解釋[19-20]：(1)低甲基化使轉(zhuǎn)錄抑制作用減弱，增加了部分沉默基因及病毒等有害基因的表達(dá)，如原癌基因激活,轉(zhuǎn)座子成分活化。(2)整體低甲基化水平使染色體不穩(wěn)定基因印記缺失。(3)低甲基化使腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移增加。(4)CpG島高甲基化使轉(zhuǎn)錄抑制增強(qiáng)，抑癌基因沉默或缺失導(dǎo)致癌細(xì)胞過(guò)度增殖。隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，DNA高甲基化被認(rèn)為是繼基因突變、基因缺失之后第3種抑癌基因沉默或缺失的機(jī)制。(5)DNA高甲基化沉默DNA修復(fù)基因，增加基因組不穩(wěn)定性。(6)DNA高甲基化所致的基因沉默是DNA發(fā)生突變的易感因素，腫瘤的發(fā)生機(jī)制從表觀遺傳學(xué)轉(zhuǎn)為遺傳學(xué)。González-Ramírez等[21]研究得出腫瘤基因啟動(dòng)子CpG島甲基化是口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的一個(gè)重要因素。文獻(xiàn)[22]也得出相同的結(jié)論。口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中顯示啟動(dòng)子甲基化的一些主要的基因是細(xì)胞周期調(diào)控基因(P16)、DNA修復(fù)基因(MGMT和hMLH1)及細(xì)胞增殖(c-myc)和細(xì)胞凋亡基因(DAPK和PDCD4)。Supic等[23]對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切除的腫瘤進(jìn)行相關(guān)基因(DAPK等)甲基化檢測(cè)，以判斷口腔鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后。在一些癌旁組織中組織病理結(jié)果并無(wú)異常，但DNA甲基化檢測(cè)存在分子生物學(xué)的改變，研究得出手術(shù)切緣存在DAPK啟動(dòng)子異常甲基化患者的生存率與甲基化水平呈反比(P=0.004)。這類(lèi)患者術(shù)后較易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差。DNA異常甲基化是腫瘤發(fā)生的一個(gè)早期事件。

3 DNMT1抑制劑與腫瘤治療的關(guān)系

3.1 DNMT1抑制劑的研究 DNA甲基化不涉及基因的改變，因此它是一個(gè)可逆的過(guò)程，抑癌基因的啟動(dòng)子在DNMT1的催化下發(fā)生異常甲基化使基因沉默，反過(guò)來(lái)思考，可以通過(guò)抑制DNMT1的活性來(lái)抑制或阻斷抑癌基因沉默，通過(guò)重新激活抑癌基因殺死腫瘤細(xì)胞。DNMT1抑制劑的研究成為治療癌癥的新亮點(diǎn)。目前開(kāi)發(fā)的DNA抑制劑主要有核苷(代表有阿扎胞苷、地西他濱等)及非核苷(氨基苯甲酸類(lèi)、反義寡核苷酸類(lèi)等)兩大類(lèi)[25]。作用機(jī)制主要有4種：(1)在DNA復(fù)制的過(guò)程中加入DNA與DNMT1結(jié)合。5-Aza-CdR是較早研究的DNMT1抑制劑，是在DNA復(fù)制時(shí)競(jìng)爭(zhēng)性的與DNMT1結(jié)合，導(dǎo)致DNMT1維持甲基化的水平降低使DNA基因序列從原來(lái)的高甲基化轉(zhuǎn)為正常甲基化。多項(xiàng)臨床試驗(yàn)證明，它可以激活抑癌基因P16殺死癌細(xì)胞達(dá)到治療腫瘤的目的[26]。(2)非共價(jià)的阻斷DNMT1的活性位點(diǎn)。這類(lèi)主要有RG108(4)和EGCG(5)，目前還處于臨床前研究階段[27-28]。(3)通過(guò)干擾DNMT1與DNA的結(jié)合位點(diǎn)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)抗心律失常藥普魯卡因胺同樣具有抑制DNMT1活性的作用，它可以直接作用于啟動(dòng)區(qū)的CpG島，通過(guò)抑制DNMT1的活性，降低DNMT1對(duì)DNA的甲基化作用[29]。(4)直接抑制DNMT1的基因表達(dá)。通過(guò)應(yīng)用反義寡核苷酸抑制DNMT1的基因表達(dá)，從而減少DNMT1的合成 。MG-9是第2代反義寡核苷酸DNMT1抑制劑。有研究表明，可以減少人體細(xì)胞中DNMT1蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)基因去甲基化。但這類(lèi)化合物在體內(nèi)很容易代謝水解，如何提高其穩(wěn)定性尚需進(jìn)一步探究[17-19]。

3.2 DNMT1抑制劑的展望 隨著表觀遺傳學(xué)的深入研究，DNMT1作為治療腫瘤的表觀基因藥物備受關(guān)注。DNMT1抑制劑作為調(diào)節(jié)高甲基化的重要藥物，已在臨床多種腫瘤治療的研究中得到應(yīng)用。不同類(lèi)別的DNMT1抑制劑根據(jù)自身的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)的不同，其療效、不良反應(yīng)及代謝途徑也有差別。目前，核苷類(lèi)藥物是作用機(jī)制較為明確的DNMT1抑制劑，地西他濱較阿扎胞苷藥物性能更穩(wěn)定，對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶作用更敏感。阿扎胞苷實(shí)驗(yàn)效果更理想，但因具有細(xì)胞毒性，臨床并未取得顯著效果；大量的實(shí)驗(yàn)研究證明氨基苯甲酸類(lèi)抑制劑的有效劑量具有較大的不良反應(yīng)；反義寡核苷酸類(lèi)抑制劑隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過(guò)構(gòu)建DNMT1的特異性結(jié)構(gòu)，特異的阻斷DNA甲基化修飾過(guò)程，為治療腫瘤提供了新思路[17]。隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，對(duì)抑制異常甲基化的藥物以及他調(diào)節(jié)表觀遺傳基因失衡的藥物以及這些藥物之間的相互協(xié)同作用會(huì)有進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 語(yǔ)

DNA異常甲基化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系,是腫瘤發(fā)生的早期事件，DNMT1是催化并維持DNA甲基化的關(guān)鍵酶。大量的研究證明DNMT1在組織中的異常表達(dá)與腫瘤有著密切的關(guān)系，DNMT1高表達(dá)催化相關(guān)抑癌基因啟動(dòng)子CpG島發(fā)生異常甲基化，DNA甲基化水平的改變是腫瘤的一個(gè)特征性變化，往往和惡性腫瘤相關(guān)并隨惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展而不斷變化。因此，DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)對(duì)于腫瘤預(yù)防、診斷預(yù)后意義重大。但DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)目前只能用于科研還不能服務(wù)于臨床。對(duì)DNMT1抑制劑的研究目前已有一定的成果，部分藥物用于臨床腫瘤治療取得一定療效，但隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNMT1及DNA甲基化與腫瘤的關(guān)系尚有一些問(wèn)題需要進(jìn)一步深入研究，例如：哪些腫瘤具有特異的DNA甲基化片段？DNA甲基化片段的檢測(cè)怎樣才能服務(wù)于臨床？怎樣運(yùn)用DNMT1抑制劑更好的服務(wù)于腫瘤？隨著后基因時(shí)代的發(fā)展，對(duì)表觀遺傳學(xué)不斷地深入研究，相信會(huì)把這些問(wèn)題搞清楚并服務(wù)于臨床。

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