Cx43在骨肉瘤組織中的表達(dá)及臨床意義

高 飛，李 偉,于明克

(中國人民解放軍第251醫(yī)院 1急診科， 2病理科，河北 張家口 075000)

細(xì)胞的存活與功能的發(fā)揮是靠細(xì)胞與細(xì)胞之間的間隙連接來實(shí)現(xiàn)的，這種連接通過神經(jīng)、激素等信號構(gòu)成正負(fù)反饋系統(tǒng)，進(jìn)而有序精確地調(diào)控生長發(fā)育、新陳代謝等活動(dòng)。資料顯示，多種惡性腫瘤組織中，細(xì)胞間隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)普遍存在低表達(dá)或不表達(dá)，如胰腺癌、肺癌、胃癌等[1-3]。但Cx43在骨肉瘤組織中的相關(guān)研究未見報(bào)道，本研究采用免疫組織化學(xué)(EnVisionTM)法檢測骨肉瘤組織中Cx43表達(dá)的情況，并探討其發(fā)病機(jī)制及對生物學(xué)行為的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇中國人民解放軍第251醫(yī)院2007年2月至2013年2月收治的骨肉瘤患者70例，并經(jīng)臨床病理診斷為骨肉瘤，且僅收集發(fā)生在長骨的骨肉瘤標(biāo)本，因?yàn)榘l(fā)生在其他部位(如頜骨、骨盆、脊柱等)的腫瘤無法完全切除會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的合理性。骨肉瘤患者中男38例、女32例，年齡10～39(20±2)歲，≥20歲者14例，<20歲者56例；腫瘤直徑≥7 cm者36例，<7 cm者34例；骨肉瘤組織學(xué)類型[4]：成骨型、成軟骨型、成纖維型，分別為55例、10例和5例。分期根據(jù)國際分期標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行：Ⅰ期與Ⅱ期共34例，Ⅲ期與Ⅳ期共36例。肺組織轉(zhuǎn)移者28例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者42例。癌細(xì)胞增值指數(shù)(Ki-67)≥75%者51例，<75%者19例。所有患者均為首次住院治療。同時(shí)隨機(jī)取距骨肉瘤0.3 cm處組織30例作為對照組。

1.2主要試劑與方法 Cx43即用型兔抗人單克隆抗體及其配套試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。免疫組織化學(xué)采用EnVisionTM兩步法：石蠟標(biāo)本制成4 μm切片,60 ℃烤片1 h；常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；微波-枸櫞酸抗原修復(fù)；3% H2O2作用10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶；非免疫動(dòng)物血清封閉液室溫孵育10 min，阻斷非特異性著色；滴加Cx43抗體，室溫下孵育2 h； 室溫下二抗聚合物增強(qiáng)劑孵育30 min；室溫下三抗酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物孵育30 min；DAB顯色；蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性對照為已知陽性切片，陰性對照用PBS代替一抗。

1.3結(jié)果判斷 Cx43以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色、棕褐色或淡黃色染色為陽性。根據(jù)在5個(gè)以上高倍鏡視野下，陽性細(xì)胞所占比例計(jì)數(shù)：1分為5%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%。染色強(qiáng)度：淡黃色為1分，黃或深黃色為2分，褐或棕褐色為3分。兩者計(jì)分相乘>1分為陽性[5]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Cx43在骨肉瘤、骨肉瘤旁組織中的表達(dá) Cx43在骨肉瘤細(xì)胞著色以胞質(zhì)為主，骨肉瘤旁細(xì)胞著色以胞膜為主；骨肉瘤組織和骨肉瘤旁組織的陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=47.75，P<0.01)(表1)。

表1 Cx43在骨肉瘤、骨肉瘤旁組織中表達(dá)的比較

2.2Cx43的表達(dá)與骨肉瘤臨床病理因素的關(guān)系 在骨肉瘤臨床病理因素中，Cx43的表達(dá)與腫瘤大小、臨床分期、肺轉(zhuǎn)移、增殖指數(shù)(Ki-67)有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與年齡、性別、組織學(xué)類型無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 Cx43的表達(dá)與骨肉瘤臨床病理因素的關(guān)系

3 討 論

細(xì)胞之間的連接包括緊密連接、橋粒、間隙連接，而間隙連接由間隙連接蛋白所構(gòu)成[6]，并通過細(xì)胞間隙連接通訊進(jìn)行細(xì)胞間的信息和能量物質(zhì)交換，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、新陳代謝等生理過程。Cx43是Cx家族中重要的間隙連接蛋白，因其編碼相對分子質(zhì)量為43×103的單肽而得名。資料顯示，Cx43在心肌組織、卵巢顆粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種組織表達(dá)[7]，而在惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)表達(dá)缺失或低表達(dá)[2-3,7-8]。本研究結(jié)果顯示，Cx43在骨肉瘤組織中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于骨肉瘤旁組織，可見Cx43的低表達(dá)參與了骨肉瘤的發(fā)生。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Cx43在骨肉瘤組織中的表達(dá)與性別、組織學(xué)類型無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與年齡、腫瘤大小、臨床分期、肺轉(zhuǎn)移及增殖活性(Ki-67)有關(guān)，表明Cx43在骨肉瘤中表達(dá)越低，其轉(zhuǎn)移性越大，臨床分期越高，因而，其可間接反映患者的病情狀態(tài)。增殖指數(shù)Ki-67是衡量細(xì)胞增生活性的重要指標(biāo)，其在正常組織中無表達(dá)或低表達(dá)，而在惡性腫瘤組織中則強(qiáng)表達(dá)，且其表達(dá)越強(qiáng)，瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移的概率越大[9]。本研究顯示，在增殖指數(shù)Ki-67高表達(dá)組中Cx43呈現(xiàn)低表達(dá)，兩者表達(dá)趨勢不一致，因而推測Cx43的高表達(dá)有可能會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性，進(jìn)而影響瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移。資料顯示，轉(zhuǎn)染Cx43基因的腺細(xì)胞通過提高其Cx43基因及蛋白表達(dá)水平，改善細(xì)胞間隙連接通訊功能，進(jìn)而引起其侵襲性及增殖活性降低[10]。孫志華等[11]研究Cx43在卵巢癌中的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細(xì)胞Cx43的表達(dá)量均顯著少于正常卵巢細(xì)胞，且耐藥組顯著少于敏感組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

總之，Cx43在骨肉瘤組織中呈現(xiàn)低或無表達(dá)，其表達(dá)水平在一定程度上影響瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，因而臨床有必要檢測其在組織中的狀態(tài)，以利于綜合判斷病情及指導(dǎo)臨床用藥等。然而，如何提高患者Cx43的表達(dá)水平及其安全性還需進(jìn)一步探討。

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