腎小球電荷屏障研究的新進(jìn)展

潘錫正(綜述)，林 芳(審校)

(1.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林541001； 2.桂林市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西 桂林541001)

腎小球濾過是腎臟完成各種代謝產(chǎn)物排泄的主要形式，腎小球濾過膜損傷被普遍認(rèn)為是導(dǎo)致腎病綜合征，甚至是終末期腎衰竭的重要原因。美國2012年度腎臟病數(shù)據(jù)系統(tǒng)報告，終末期腎衰竭患者達(dá)594 374例，醫(yī)療費用占總醫(yī)療保險支出的6.3%[1]；中國的終末期腎衰竭登記尚不完整，Zhang等[2]根據(jù)相關(guān)參數(shù)推測，在未來的10年中國終末期腎衰竭患者將達(dá)到650例/百萬人口，腎臟替代治療花費將占國家醫(yī)藥費用的10%。腎小球濾過屏障進(jìn)展機制的了解對于解決腎臟疾病相關(guān)問題很有必要。

1 腎小球濾過膜屏障模型構(gòu)成

經(jīng)典的腎小球濾過屏障模型從里向外由三層構(gòu)成。內(nèi)層是毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞上有許多直徑為60～100 nm的小孔，是白蛋白分子直徑(3.6 nm)的15倍以上，稱為窗孔[3]。中層是非細(xì)胞性的基膜，呈微纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)?；ど嫌兄睆綖?～8 nm的多角形網(wǎng)孔，是腎小球防止大分子蛋白質(zhì)濾過的主要屏障。外層是腎小球的上皮細(xì)胞。上皮細(xì)胞具有足突，相互交錯的足突之間形成裂隙。裂隙上有一層濾過裂隙隔膜，膜上有直徑為4～14 nm的孔，是濾過的最后一道屏障[4]。濾過膜的電荷可由其表面的化學(xué)基團(tuán)的解離、化學(xué)鍵、電解質(zhì)溶液中物理吸附的離子所決定。腎小球濾過膜上的孔徑大小決定了其分子屏障，一般來說，分子有效半徑<2.0 nm的中性物質(zhì)可自由濾過，有效半徑>4.2 nm的物質(zhì)則不能濾過，有效半徑在2.0～4.2 nm之間的各種物質(zhì)隨有效半徑的增加，其濾過量逐漸減少。Bohrer等[5]用不同帶電荷的右旋糖酐進(jìn)行實驗觀察到，即使有效半徑相同，由于其帶不同電荷導(dǎo)致右旋糖酐的清除率呈現(xiàn)指數(shù)級的升降變化，表明濾過膜電荷屏障在決定濾過物質(zhì)通透性方面具有重要作用。

2 流動電位理論

2.1流動電位理論的提出 Hausmann等[6]提出了流動電位影響腎小球濾過屏障的通透性，他們用顯微穿刺術(shù)，在兩棲動物斑泥螈腎臟內(nèi)直接測量到濾液穿過腎小球濾過膜時產(chǎn)生的電場，這個電場在腎小囊內(nèi)為負(fù)，在腎臟毛細(xì)血管腔內(nèi)為正，且與腎小球濾過壓成正比，其測量的平均值為每-0.045 mV/10 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)有效濾過壓，在正常人體，靠近入球小動脈端有效濾過壓約為10 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，出球小動脈端有效濾過壓接近0 mm Hg，平均有效濾過壓約為5 mm Hg，則推測其電位差的范圍為0.1～0.5 mV，假如腎小球濾過膜厚度為600 nm，那么跨過腎小球濾過膜的場強可達(dá)到800 V/m。Hausmann等[6]提出了濾過壓相關(guān)的電場產(chǎn)生的機制，即流動電位。因此，推測小的陰離子(如Cl-、HCO3-等)相對于陽離子(如Na+、K+等)更多地聚集在腎小囊內(nèi)，從而產(chǎn)生了一個在腎小球囊內(nèi)為負(fù)的電場。

2.2流動電位的產(chǎn)生機制 流動電位是液體沿著帶電的微血管或者孔徑切線運動時，帶電荷粒子由于受到滑面電位(zeta電位)的影響，導(dǎo)致下游電荷積累，在上下游之間產(chǎn)生電位差，即產(chǎn)生流動電位[7]。結(jié)合斯特恩雙電層的理論模型(如圖1A)來進(jìn)一步闡述這一機制：腎小球濾過膜主要含有負(fù)電荷，當(dāng)在濾過壓作用時流體穿過狹窄的濾過通道，由于摩擦作用，在液層中部流速最大，而濾過膜孔壁處流速為0，因此存在一個固定液相與流動液相之間的分界面，稱為滑移面；滑移面以內(nèi)是濾過膜靜電引力作用下緊緊吸附的陽離子構(gòu)成的斯特恩層(即固定層)，實質(zhì)上是一個位移界面，該界面上的電位稱為界面動電位，或者稱zeta電位，其導(dǎo)致擴(kuò)散層(即可移動層)中特定區(qū)域內(nèi)(如圖A中a區(qū))帶電離子的分布不均一，主要表現(xiàn)為正電荷的離子多于負(fù)電荷離子，其電位的影響隨著離濾過膜表面的距離增加而減弱，在電位為0的部位正負(fù)離子的濃度相同，液體流動時靠近濾過膜表面的雙電層中的擴(kuò)散層將帶著更多的正電荷離子一起向濾過膜的另一端流動，這樣就出現(xiàn)了電流，這種因流體流動而引發(fā)的電流稱為流動電流,其在濾過膜孔隙兩端產(chǎn)生的電位差則稱為流動電位[8-10]。

上述雙電層理論模型預(yù)測的濾過膜產(chǎn)生了動電效應(yīng)，在離子流的末端即腎小囊內(nèi)為正電荷離子聚集，與Hausmann等[6]實驗觀察到的動電效應(yīng)模型相反。

Delgado等[7]認(rèn)為，任何帶電濾過膜的具體電性質(zhì)均由其周圍的離子空間分布所決定，且將斯特恩層中被吸附離子分成普通離子和特定吸附離子。普通離子僅通過靜電引力吸附，特定吸附的離子(通常是二價離子)具有除了靜電引力之外附加的化學(xué)的或者特有的表面吸附力。這種特定吸附的離子可能導(dǎo)致濾過膜過分充電而表現(xiàn)為帶正電荷的效應(yīng)，這將會改變滑動面電位，顛倒zeta電位的極性，從而改變腎小球濾過膜上擴(kuò)散層電荷分布(如圖1B)。結(jié)果使更多的陰離子在濾過膜孔隙另一端為聚集，即形成腎小球囊內(nèi)為負(fù)，在腎臟毛細(xì)血管腔內(nèi)為正的電場?？梢?，在上述斑泥螈的腎小球濾過膜過度吸附而顛倒zeta電位發(fā)揮了重要作用。

圖1 斯特恩雙電層理論模型[11]

2.3腎小球流動電位的功能 最接近腎小球濾過膜的是持續(xù)靜-靜脈血液濾過，且已被廣泛用于終末腎病患者的替代治療。任何持續(xù)靜-靜脈血液濾過最終會被堵塞，但是腎小球濾過膜在生理情況下從沒有顯示出任何堵塞的跡象。在持續(xù)靜-靜脈血液濾過系統(tǒng)，僅考慮了對流和擴(kuò)散兩種力量的影響[12]。

Akilesh等[13]的實驗觀察到腎小球足細(xì)胞是內(nèi)吞活躍細(xì)胞，具有清除濾過膜功能。人類的腎臟每日從血漿中濾過180 L的原尿，假設(shè)腎小球濾過面積是1 m2，約10 kg/m2的蛋白被從腎小球濾過膜移走。阻塞在濾過膜中的分子會迅速被足細(xì)胞，甚至是內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞所吞噬。研究表明內(nèi)皮細(xì)胞層厚度為200～400 nm，然而假設(shè)細(xì)胞層(內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞，不包括腎小球基膜) 總共厚約600 nm，濾過膜面積1 m2，約600 mg/m2細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞)，假如它們每日最多能處理其自身容積的蛋白，總量仍少于總共濾過負(fù)荷的0.006%[14]。這對于清除血漿蛋白的溶液是不足夠的。許多研究中將濾過膜看成是一個凝膠，產(chǎn)生一個跨越類似凝膠的濾過膜的電場對于避免濾過膜堵塞是一個簡單且有效的解決方案[15-16]。因為血漿中大分子往往產(chǎn)生固定的負(fù)電荷,近中性、正電荷的大分子生理情況下在血漿中很少存在，因此大分子陰離子穿過濾過膜時受電場影響回到血液中。

Ciarimboli等[17]用含白蛋白的灌注液在離體小鼠腎臟的實驗，從三個不同方面證明動電效應(yīng)在腎小球濾過中的重要性，其一，用不同pH(4.0、5.3、7.4、8.75)的灌注液進(jìn)行實驗時，觀察到白蛋白的濾過系數(shù)隨著灌注液的pH增加而減少，其原因是白蛋白在其等電點(isoelectric point PI 4-5)附近，即pH=4.0時，所帶凈電荷趨于0，呈電中性，因此白蛋白受跨過濾過膜的電場影響最小，白蛋白的濾過系數(shù)最大，當(dāng)其升高灌注液的pH時，白蛋白所帶負(fù)電荷不斷增加，受跨過濾過膜的電場影響逐漸增加，則白蛋白的濾過系數(shù)逐漸減?。黄涠敏~精蛋白去中和腎小球濾過膜上的負(fù)電荷觀察到白蛋白的通透性增加；其三，用陽離子化的方法使白蛋白帶正電荷，觀察到白蛋白的通透性亦增加。

Rennke等[18]用追蹤法在離體灌注的小鼠腎臟中電鏡下觀察帶有不同電荷的鐵蛋白(等電點為6～8)被阻止情況，當(dāng)用帶負(fù)電荷的鐵蛋白時，觀察到其大部分被阻止在腎小球濾過膜的內(nèi)皮細(xì)胞和基膜層；當(dāng)用帶中性電的鐵蛋白時，較多的鐵蛋白進(jìn)入濾過膜，被阻止在腎小球基膜和裂隙膈膜層；當(dāng)用帶正電荷的鐵蛋白時(等電點>8.8)，鐵蛋白被吸附到帶負(fù)電荷的內(nèi)皮多糖上，此外相對最多的帶正電荷的鐵蛋白阻止在濾液中。從以上實驗中可以得出三個結(jié)論：①內(nèi)皮細(xì)胞和它的多糖不太可能起到主要的機械屏障作用，因為內(nèi)皮細(xì)胞窗孔為白蛋白分子直徑的15倍以上，最可能的阻止負(fù)電荷鐵蛋白進(jìn)入濾過膜的是電場[1]；②當(dāng)電荷效應(yīng)不存在時，腎小球基膜和裂隙膈膜相當(dāng)于一個被動的濾過膜的大小選擇器(從中性鐵蛋白中可以觀察到)；③阻止和聚集在濾液中最多的是帶正電荷的鐵蛋白，其原因是：帶正電鐵蛋白改變了電泳方向，與對流和擴(kuò)散起到了協(xié)同作用，從而使正電鐵蛋白更容易通過濾過液，更少被阻止，反而導(dǎo)致鐵蛋白堵塞了濾過膜，大量的鐵蛋白被阻止進(jìn)入到濾過膜。這些發(fā)現(xiàn)再次證明了跨過濾過膜電場的重要性。

2.4腎小球靜電作用力與流動電位的區(qū)別與聯(lián)系 腎小球靜電作用力描述的是濾過膜的固定電荷對具有通透性的帶電顆粒之間的影響，腎小球靜電作用力是一個靜止的因素。流動電位描述的是液體沿著帶電的濾過膜運動時，帶電荷粒子在上下游之間產(chǎn)生電位差。從上述流動電位雙電層模型中可見，腎小球靜電作用力是其流動電位產(chǎn)生的必要條件。因此很難將兩者的效應(yīng)區(qū)分開，兩者共同構(gòu)成腎小球濾過的電荷屏障，當(dāng)疾病損傷濾過膜上的固定電荷時，流動電位的產(chǎn)生亦受影響。

3 腎小球電荷屏障損傷與蛋白尿

研究證實，內(nèi)皮細(xì)胞窗孔和窗孔之間存在一層多糖包被，稱為“糖萼”，由蛋白多糖、糖蛋白、糖胺多糖和血漿蛋白等物質(zhì)構(gòu)成，是參與維持腎小球濾過膜電荷選擇屏障的物質(zhì)基礎(chǔ)[19]。糖尿病腎病患者內(nèi)皮細(xì)胞糖萼減少，其程度與蛋白尿的形成相關(guān)[20]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，降解或破壞內(nèi)皮細(xì)胞糖萼，雖然基膜結(jié)構(gòu)正常，但腎小球?qū)ρ椎鞍椎耐ㄍ感燥@著增加[19]。內(nèi)皮細(xì)胞和它的多糖不太可能起到主要的機械屏障作用[3]。因此,內(nèi)皮細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu)糖萼是阻止血漿白蛋白濾過起到重要電荷屏障作用，其減少和結(jié)構(gòu)破壞將導(dǎo)致蛋白尿。腎小球基膜為凝膠狀的細(xì)胞外基質(zhì)，主要由Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、巢蛋白以及硫酸類肝素(heparan sulfate，HS)等構(gòu)成帶負(fù)電荷的電荷屏障[21]。研究發(fā)現(xiàn)，選擇性敲除層粘連蛋白β2基因的小鼠腎小球基膜超微結(jié)構(gòu)似乎完整，但層粘連蛋白陰電荷分布異常，出生后早期即產(chǎn)生白蛋白尿，而后出現(xiàn)足突融合和裂孔膜缺失，表現(xiàn)為先天性腎病綜合征伴視網(wǎng)膜、神經(jīng)肌肉接頭病變[22]。HS作為腎小球基膜中的主要帶負(fù)電荷物質(zhì)，在糖尿病腎病中的含量減少導(dǎo)致腎小球基膜對白蛋白的通透性增加，進(jìn)而發(fā)生蛋白尿[23]。

足細(xì)胞表面覆蓋有一層帶負(fù)電荷的唾液酸糖蛋白，是參與維持腎小球濾過膜電荷選擇屏障的物質(zhì)基礎(chǔ)[24]。文獻(xiàn)證實，無論1型還是2型糖尿病腎病，均存在腎小球足細(xì)胞數(shù)目減少[ 25-27]。在糖尿病的微量白蛋白尿期，足細(xì)胞的密度已經(jīng)減少，到中大量蛋白尿期足細(xì)胞密度下降更加明顯，這與足細(xì)胞數(shù)目丟失情況的研究相一致。可見，糖尿病腎病患者腎小球足細(xì)胞損傷、脫落和數(shù)目減少將導(dǎo)致電荷屏障和分子屏障均受損，而產(chǎn)生蛋白尿。

4 肝素治療腎小球疾病的研究

近年來，肝素因其帶有大量負(fù)電荷，有利于保護(hù)腎小球基膜負(fù)電荷屏障，防止白蛋白漏出，在臨床上用于腎臟疾病的治療，已經(jīng)得到普遍認(rèn)同。Rops等[28]在狼瘡性腎炎患者及小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，腎小球基膜上HS的表達(dá)下降，導(dǎo)致固定負(fù)電荷丟失，應(yīng)用肝素治療后，腎小球基膜上HS恢復(fù)正常，且有助于阻止免疫球蛋白在腎小球沉積。電荷屏障的改變在腎病綜合征的致病過程中起著非常重要的作用，使用肝素后，能促進(jìn)蛋白尿轉(zhuǎn)陰，減低蛋白尿排出，有利于血漿白蛋白恢復(fù)，減少長期蛋白尿?qū)δI臟的損害[29]。在糖尿病腎病臨床蛋白尿期，應(yīng)用肝素后，患者尿白蛋白明顯減少，提示肝素針對糖尿病腎病的濾過膜有類似改善電荷屏障損害的現(xiàn)象[30]。

5 小 結(jié)

從實驗動物斑泥螈研究中提出的腎小球流動電位模型，完善了腎臟濾過膜電荷屏障的理論，其產(chǎn)生機制同樣適用于人類，這對于正確理解腎小球濾過膜在生理情況下是如何阻止血漿蛋白進(jìn)入濾過膜及避免濾過膜堵塞的，以及在病理情況下的蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展方面具有重要作用。腎小球疾病發(fā)病率逐年上升，已成為嚴(yán)重危害人們健康的世界衛(wèi)生問題，該病在臨床上涉及多個學(xué)科，如腎內(nèi)科、內(nèi)分泌科(如糖尿病腎病)、心內(nèi)科(如高血壓腎病)等。腎臟濾過膜電荷屏障新理論的提出，或能為腎小球疾病的早期診斷、有效治療等提供新的靶點及研究方向。

[1] Collins AJ,Foley RN,Herzog C,etal.US Renal Data System 2012 Annual Data Report[J].Am J Kidney Dis,2013,61(1 Suppl 1):A7,e1-e476.

[2] Zhang L,Wang H.Chronic kidney disease epidemic:cost and health care implications in China[J].Semin Nephrol,2009,29(5):483-486.

[3] Satchell SC,Braet F.Glomerular endothelial cell fenestrations:an integral component of the glomerular filtration barrier[J].Am J Physiol Renal Physiol,2009,296(5):F947-F956.

[4] Rodewald R,Karnovsky MJ.Porous substructure of the glomerular slit diaphragm in the rat and mouse[J].J Cell Biol,1974,60(2):423-433.

[5] Bohrer MP,Baylis C,Humes HD,etal.Permselectivity of the glomerular capillary wall.Facilitated filtration of circulating polycations[J].J Clin Invest,1978,61(1):72-78.

[6] Hausmann R,Kuppe C,Egger H,etal.Electrical forces determine glomerular permeability[J].J Am Soc Nephrol,2010,21(12):2053-2058.

[7] Delgado AV,González-Caballero F,Hunter RJ,etal.Measurement and interpretation of electrokinetic phenomena[J].J Colloid Interface Sci,2007,309(2):194-224.

[8] Haraldsson B,Nystr?m J,Deen WM.Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria[J].Physiol Rev,2008,88(2):451-487.

[9] Jarad G,Miner JH.Update on the glomerular filtration barrier[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2009,18(3):226-232.

[10] Moeller MJ.Streaming potentials as novel driving force for capillary permeability[J].Biophys J,2013,104(7):1395-1396.

[13] Akilesh S,Huber TB,Wu H,etal.Podocytes use FcRn to clear IgG from the glomerular basement membrane[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(3):967-972.

[14] Hjalmarsson C,Johansson BR,Haraldsson B.Electron microscopic evaluation of the endothelial surface layer of glomerular capillaries[J].Microvasc Research,2004,67(1):9-17.

[15] Menzel S,Moeller MJ.Role of the podocyte in proteinuria[J].Pediatr Nephrol,2011,26(10):1775-1780.

[16] Deen WM,Lazzara MJ,Myers BD.Structural determinants of glomerular permeability[J].Am J Physiol Renal Physiol,2001,281(4):F579-F596.

[17] Ciarimboli G,Schurek HJ,Zeh M,etal.Role of albumin and glomerular capillary wall charge distribution on glomerular permselectivity:studies on the perfused-fixed rat kidney model[J].Pflugers Arch,1999,438(6):883-891.

[18] Rennke HG,Cotran RS,Venkatachalam MA.Role of molecular charge in glomerular permeability.Tracer studies with cationized ferritins[J].J Cell Biol,1975,67(3):638-646.

[19] Jeansson M,Haraldsson B.Morphological and functional evidence for an important role of the endothelial cell glycocalyx in the glomerular barrier[J].Am J Physiol Renal Physiol,2006,290(1):F111-F116.

[20] Singh A,Satchell SC,Neal CR,etal.Glomerular endothelial glycocalyx constitutes a barrier to protein permeability[J].J Am Soci Nephrol,2007,18(11):2885-2893.

[21] Miner JH.Developmental biology of glomerular basement membrane components[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,1998,7(1):13-19.

[22] Jeansson M,Haraldsson B.Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes[J].J Am Soc Nephrol,2003,14(7):1756-1765.

[23] van den Hoven MJ,Rops AL,Bakker MA,etal.Increased expression of heparanase in overt diabetic nephropathy[J].Kidney Int,2006,70(12):2100-2108.

[24] Koop K,Eikmans M,Baelde HJ,etal.Expression of podocyte-associated molecules in acquired human kidney diseases[J].J Am Soc Nephrol,2003,14(8):2063-2071.

[25] Steffes MW,Schmidt D,Mccrery R,etal.Glomerular cell number in normal subjects and in type 1 diabetic patients[J].Kidney Int,2001,59(6):2104-2113.

[26] White KE,Bilous RW,Marshall SM,etal.Podocyte number in normotensive type 1 diabetic patients with albuminuria[J].Diabetes,2002,51(10):3083-3089.

[27] Meyer TW,Bennett PH,Nelson RG.Podocyte number predicts long-term urinary albumin excretion in Pima Indians with type II diabetes and microalbuminuria[J].Diabetologia,1999,42(11):1341-1344.

[28] Rops AL,van den Hoven MJ,Bakker MA,etal.Expression of glomerular heparan sulphate domains in murine and human lupus nephritis[J].Nephrol Dial Transplant,2007,22(7):1891-1902.

[29] Guasch A,Deen WM,Myers BD.Charge selectivity of the glomerular filtration barrier in healthy and nephrotic humans[J].J Clin Invest,1993,92(5):2274-2282.

[30] Benck U,Haeckel S,Clorius JH,etal.Proteinuria-lowering effect of heparin therapy in diabetic nephropathy without affecting the renin-angiotensin-aldosterone system[J].Clin J Am Soc Nephrol,2007,2(1):58-67.