康氏木霉HEX1蛋白的原核表達(dá)及純化

唐 俊，陸 娟，許惠芬，陳 捷

(1 阜陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 阜陽 236037；2 上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；3 山東省淄博市桓臺縣林業(yè)局，山東 淄博 256400)

HEX1蛋白是構(gòu)成伏魯寧體(Woronin body)的主要蛋白[1]，伏魯寧體是絲狀真菌特有的細(xì)胞器，是一種特化的過氧化物酶體，位于細(xì)胞邊緣或菌絲隔膜孔附近[2-3]，其功能是在細(xì)胞受損時保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，例如通過封堵菌絲細(xì)胞隔膜孔，防止菌絲細(xì)胞質(zhì)外滲[4-6]。到目前為止，粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)[2]、瑞氏木霉菌(Trichodermareesei)[7]、稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)[8]、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)[5]等真菌的hex1基因均已被分離出來。部分真菌hex1基因的功能研究已較為深入，如粗糙脈孢菌hex1基因的敲除，可以導(dǎo)致細(xì)胞裂解后原生質(zhì)的外泄，表明在脅迫條件下該基因通過封閉隔膜孔，防止細(xì)胞質(zhì)大量損失[2]。Soundararajan等[4]研究表明，稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)缺失hex1基因后，菌絲細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，附著胞侵染能力或定殖寄主植物細(xì)胞的能力下降，稻瘟病菌的致病能力降低。本課題組前期研究表明，敵敵畏脅迫條件下木霉菌HEX1蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)，并據(jù)此推測hex1基因可能通過調(diào)控木霉菌菌絲的隔膜系統(tǒng)，增強(qiáng)其耐受敵敵畏脅迫的能力[9]。Curach等[7]成功克隆出了瑞氏木霉菌(Trichodermareesei)的hex1基因，分析了其基本的分子特性。但有關(guān)hex1基因在木霉中的重要功能研究較少。因此，本研究對康氏木霉(Trichodermaknoningii)的HEX1蛋白進(jìn)行原核表達(dá)及純化，以期為進(jìn)一步研究hex1基因在木霉中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株及質(zhì)粒 康氏木霉菌株T30、E.coliBL21(DE3)菌株、質(zhì)粒pET-28a(+)，均由上海交通大學(xué)環(huán)境微生物實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ、T4DNA連接酶、PCR反應(yīng)相關(guān)試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及TA克隆試劑盒，均購于Takara公司；RNA提取試劑盒購于Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒，購于上海捷瑞生物工程有限公司；抗His標(biāo)簽的兔多克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、鎳柱親和層析試劑盒，均購于上海業(yè)力生物科技有限公司。

1.2 hex1基因的克隆

1.2.1 引物設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank中發(fā)布的康氏木霉hex1序列(登錄號：HM156671)，設(shè)計針對HEX1蛋白基因的特異性引物，上游引物為T30expF：GCGGATCCATGGGTTACTACGAC(下劃線為BamHⅠ酶切位點)，下游引物為T30expR：GAGAAGCTTTTACAGGCGAGAGC(下劃線為Hind Ⅲ酶切位點)。引物由上海博尚生物有限公司合成。

1.2.2 RNA提取 康氏木霉菌絲經(jīng)過濾、水洗抽干后，液氮研磨成粉末，加入Trizol溶液混勻，具體提取方法參照Trizol試劑(Invitrogen公司)說明進(jìn)行。

1.2.3hex1基因的RT-PCR擴(kuò)增 參考RT-PCR試劑盒(Takara公司)進(jìn)行cDNA第1鏈合成。反轉(zhuǎn)錄體系10 μL： 5×PrimeScript Buffer 2 μL，PrimeScriptRTEnzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer(50 μmol/L)0.5 μL，Random 6 mers(100 μmol/L) 0.5 μL，總RNA樣品500 ng，最后加無RNase水補(bǔ)足至10 μL。混勻后于37 ℃水浴15 min，85 ℃熱變性5 s。以合成的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增hex1基因。PCR反應(yīng)體系25 μL：cDNA模板2 μL，premixTaqTM(2×)(Takara公司)12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，最后加滅菌ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增程序為：94 ℃ 4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共28個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.4 pMD19-T-hex1的構(gòu)建及鑒定 將純化的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取pMD19-T-hex1質(zhì)粒并經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定正確后，送上海博尚生物有限公司測序，以進(jìn)一步確認(rèn)序列，從而得到重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-hex1。

1.3 HEX1蛋白的原核表達(dá)及分析

1.3.1 原核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 用BamHⅠ和Hind Ⅲ 對pMD19-T-hex1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，收集酶切產(chǎn)物，并與同樣用BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切的pET28a(+)載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，在含卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板上篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒pET28a-hex1，并經(jīng)酶切和PCR測序驗證，確保hex1原核表達(dá)框完全正確。

1.3.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 1)重組HEX1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析。將重組質(zhì)粒pET28a-hex1轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過菌落PCR進(jìn)行陽性克隆驗證。將含重組質(zhì)粒的BL21(DE3)菌株接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)中，于37 ℃培養(yǎng)過夜。次日按培養(yǎng)基體積1%的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮液體LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600約為0.6，然后加入終濃度分別為0.2,0.6和1.0 mmol/L的IPTG，以未加IPTG為對照。37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)3 和6 h后，分別取1 mL菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定最佳IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時間。同時設(shè)空載體表達(dá)菌為陰性對照(CK)。

IPTG誘導(dǎo)6 h后，6 000 r/min離心10 min收集菌體。將菌體重懸于PBS緩沖液(pH 8.0)，冰上放置30 min，然后加入終濃度為1 mmol/L的PMSF超聲波破碎處理15 min (破碎6 s,間歇10 s，功率300 W)，12 000 r/min冷凍離心10 min。離心后分別收集上清液和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析重組蛋白的可溶性。

2)重組HEX1蛋白的純化及鑒定。轉(zhuǎn)接100 μLE.coliBL21(含重組質(zhì)粒pET28a-hex1)菌液到2個250 mL LB液體選擇培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 過夜培養(yǎng)。第2天，將過夜培養(yǎng)的250 mL菌液等分成2份(即250 mL菌液與等體積培養(yǎng)基均勻混合后再分成2瓶)，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h。用400 mL離心管收集菌體，6 000 r/min離心5 min，棄上清。沉淀用40 mL Lysis buffer(pH 8.0)溶液吹打散開。超聲處理20 s，停20 s，共50次，功率400 W。將超聲后的菌懸液于4 ℃、12 000 r/min離心10 min。棄上清，沉淀用20 mL含8 mol/L尿素的Lysis buffer(pH 8.0)溶液重懸，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。收集上清，采用鎳柱親和層析試劑盒純化重組蛋白。

用Western blot方法鑒定純化的重組蛋白。通過濕轉(zhuǎn)法將SDS-PAGE凝膠上的重組蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶于室溫封閉3 h。封閉結(jié)束后，將膜轉(zhuǎn)移至一抗孵育盒(1∶5 000 稀釋)中，室溫孵育3 h后，用1×TBS緩沖液洗3次，每次5 min。再將膜轉(zhuǎn)移至二抗孵育盒中(1∶3 000稀釋)，室溫孵育1 h后，用1×TBS緩沖液洗3次，每次5 min。最后，將膜放在DAB顯色液中5 min，出現(xiàn)條帶后，放入去離子水中終止反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 hex1基因的擴(kuò)增及pMD19-T-hex1質(zhì)粒的鑒定

通過RT-PCR擴(kuò)增得到大小為660 bp的康氏木霉HEX1蛋白基因特異片段，將目的片段與載體pMD19-T連接，獲得重組表達(dá)載體，經(jīng)雙酶切鑒定，獲得了大小約為2 700 bp和660 bp的2條DNA條帶(圖1)，與預(yù)期大小一致，表明目的基因已經(jīng)成功克隆并連接到載體上。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-hex1的鑒定

用BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切pMD19-T-hex1質(zhì)粒，將酶切產(chǎn)物與同樣用BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切的pET28a(+)載體連接，對酶切檢驗正確的重組質(zhì)粒pET28a-hex1進(jìn)一步測序，發(fā)現(xiàn)hex1原核表達(dá)框完全正確。

圖1 重組質(zhì)粒pMD19-T-hex1的雙酶切鑒定

2.3 重組HEX1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，隨著IPTG誘導(dǎo)時間的延長，目標(biāo)蛋白的表達(dá)量增加(圖2)，而含空載體質(zhì)粒和未經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌均未見目標(biāo)蛋白的表達(dá)。終濃度分別為0.2,0.6和1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的HEX1蛋白量無明顯差異；但隨著誘導(dǎo)時間的延長，重組蛋白表達(dá)量明顯提高。IPTG誘導(dǎo)6 h的蛋白量明顯多于3 h。因此，用 1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h進(jìn)行后續(xù)試驗。

菌體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，超聲波破碎處理后分別收集上清液(含可溶性蛋白)和沉淀(含不溶性蛋白)，SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達(dá)出的蛋白主要在沉淀中，上清液中未見明顯的蛋白表達(dá)(圖3)。

2.4 重組HEX1蛋白的純化及鑒定

將目的蛋白通過IPTG誘導(dǎo)大量表達(dá)，超聲破碎菌體，尿素變性沉淀蛋白再經(jīng)鎳柱親和層析純化。樣品與鎳柱充分混合后，首先用洗脫緩沖液洗去大部分雜質(zhì)蛋白，再用含不同濃度咪唑的洗脫緩沖液洗去非特異性結(jié)合蛋白，最終獲得了純化的HEX1蛋白(圖3)。

含有重組質(zhì)粒pET28a-hex1的E.coliBL21菌株在37 ℃條件下，經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h，再將不同樣品蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，以抗His標(biāo)簽的兔多克隆抗體為一抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，檢測目標(biāo)蛋白。結(jié)果(圖4)顯示，對照樣品沒有出現(xiàn)雜交條帶，而全蛋白和沉淀蛋白中均有明顯的雜交條帶，表明HEX1蛋白成功表達(dá)，并主要在沉淀蛋白中以包涵體的形式呈現(xiàn)。

圖2 經(jīng)不同濃度IPTG誘導(dǎo)3 和6 h HEX1蛋白的表達(dá)

圖3 重組HEX1蛋白在E.coli BL21中的誘導(dǎo)表達(dá)

圖4 重組HEX1蛋白的Western blot分析

3 討 論

對部分真菌HEX1蛋白的氨基酸編碼序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在不同的絲狀真菌中HEX1蛋白具有同源性，暗示伏魯寧體的核心組成成分和功能在進(jìn)化上是保守的[5]。本研究克隆了康氏木霉hex1基因的cDNA序列，并成功地在原核細(xì)胞中表達(dá)和純化了HEX1蛋白，這將為其他種屬木霉的hex1基因表達(dá)和蛋白純化提供借鑒。

在原核細(xì)胞中進(jìn)行蛋白融合表達(dá)時，誘導(dǎo)溫度、時間及IPTG的濃度均會影響蛋白的表達(dá)效果。許多蛋白的高水平表達(dá)往往會形成包涵體[10]。本試驗中融合表達(dá)的蛋白就是以包涵體形式存在的，需要經(jīng)尿素變性溶解。對細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行裂解的方法有很多，包括液氮凍融法[11]、超聲波破碎法[12-13]及SDS裂解[14]等。本試驗用超聲波破碎法提取蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析，表明超聲波破碎法能夠有效裂解細(xì)胞。在后續(xù)研究中，可以進(jìn)一步優(yōu)化重組質(zhì)粒的表達(dá)條件，降低蛋白在細(xì)胞內(nèi)的合成速度和合成量，以使重組蛋白能夠正確折疊，形成正確的構(gòu)象并分泌到胞外。

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