大豆豆莢特異性啟動子的克隆及功能分析

宋 陽，王丕武，張學(xué)明,曲 靜

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 長春130118)

在轉(zhuǎn)基因應(yīng)用中，啟動子對目標(biāo)基因的表達(dá)起著重要的調(diào)控作用。根據(jù)啟動子的作用方式可將其分為組成型、誘導(dǎo)型和組織特異型3類[1]。目前組成型啟動子應(yīng)用最多的是CaMV 35S啟動子，Carlos等[2]從大豆中分離出大豆聚泛素啟動子，用其啟動的GFP基因的表達(dá)量比CaMV 35S高2～5倍。誘導(dǎo)型啟動子的活化受物理或化學(xué)信號刺激的誘導(dǎo)，能夠驅(qū)動外源基因?qū)崿F(xiàn)高效表達(dá)；其中有的誘導(dǎo)型啟動子也有組織特異型啟動子的特性，如已克隆的果實特異性表達(dá)的E8基因的啟動子同時存在乙烯應(yīng)答元件，故也可看作是乙烯誘導(dǎo)型啟動子[3]。組織特異型啟動子能夠驅(qū)動外源基因在特定部位和特定發(fā)育階段表達(dá)，實現(xiàn)外源基因在空間和時間上的調(diào)控；現(xiàn)已分別在根、莖、葉、果實、花等幾乎各種組織中克隆出其相應(yīng)的組織特異型啟動子[4-8]，并廣泛應(yīng)用于水稻、玉米、番茄、甘薯等諸多農(nóng)作物的遺傳轉(zhuǎn)化研究中。目前組織特異型啟動子在大豆中的應(yīng)用較為廣泛，已克隆了伴大豆球蛋白、球蛋白、凝集素等大豆種子特異性啟動子，并在增加轉(zhuǎn)基因植物種子營養(yǎng)含量的研究中得到應(yīng)用[9]。此外，大豆根部和種皮特異性啟動子也都相繼克隆成功[10-11]。豆莢特異性啟動子可以增加外源基因在結(jié)莢期莢中的表達(dá)量，最大程度減少對植物其他器官的不利影響，為提高基因工程育種的精確性和安全性提供了新的元件。

大豆(Glycinemax)是我國重要的糧油兼用作物，有著極高的營養(yǎng)價值，是人們?nèi)粘Ｉ钪斜貍涞氖秤米魑镏?，但大豆又是一種極易受病蟲害侵襲的作物[12]。目前在生產(chǎn)上危害較大的病蟲害有大豆灰斑病、莢枯病、大豆食心蟲、大豆蚜蟲和豆莢螟等[13]，其中大部分為害大豆粒莢，嚴(yán)重影響了大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此，針對豆莢特異性啟動子控制外源基因在莢中高效表達(dá)的研究具有重要的理論和實踐意義。為此,本研究利用PCR技術(shù),根據(jù)在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索到的豆莢特異性表達(dá)的msg基因序列，從大豆基因組DNA中分離其核心啟動子片段，并將該片段與GUS報告基因重組，構(gòu)建報告表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入煙草中進(jìn)行功能驗證，以期為研究抗病蟲基因在大豆莢中的特異表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試大豆品種“吉農(nóng)28”、煙草品種“NC89”、質(zhì)粒pBI121、大腸桿菌DH5α(E.coliDH5α)和農(nóng)桿菌EHA105等，均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物技術(shù)中心提供。

試驗試劑DNA GeL Extraction Kit凝膠回收試劑盒購自V-gene公司，pMD18-T Vector 載體試劑盒、DNA Marker DL2000、PCR Kit購自TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶(Hind Ⅲ、XbaⅠ)、T4DNA Ligase購自Fermentas公司，X-gal、IPTG、X-Gluc、Triton X-100購自北京鼎國生物公司(Sigma分裝)，DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ試劑盒購自Roche公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器設(shè)備有PCR儀、紫外及可見光分光光度儀、電泳儀、凝膠成像儀、低溫離心機(jī)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、智能人工氣候光照培養(yǎng)箱、超凈工作臺、超低溫冰箱和高壓滅菌鍋等。

1.2 豆莢特異性啟動子PSP片段的克隆和序列分析

取大豆品種“吉農(nóng)28”的幼嫩葉片，用CTAB法[14]提取植物基因組DNA。根據(jù)NCBI上發(fā)表的大豆豆莢特異性表達(dá)基因msg(登錄號：AJ239127.1)的啟動子序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計1對特異性引物，PSPs：5′-GGGAAGCTTCTAGATGAACTGCTTTAAGG-3′和PSPas：5′-GGGTCTAGATCTTGAATTCAAATAATTGC-3′，其中劃線部分分別為加入的Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切位點，引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。雙酶切體系為20 μL，其中限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ 2 μL、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ 1 μL、質(zhì)粒5 μL，Buffer 2×Tango 4 μL，ddH2O 8 μL，37 ℃反應(yīng)2 h。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，其中10×buffer 5 μL、MgCl25 μL、dNPT 0.8 μL、50 pmol/L上下游引物各2 μL、模板0.1 μg、Taq酶 0.5 μL、ddH2O 32.7 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性8 min；94 ℃變性50 s，45 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用V-gene凝膠回收試劑盒純化后連入克隆載體pMD18-T Vector；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白斑篩選，挑取白斑提取質(zhì)粒DNA，通過PCR擴(kuò)增和酶切鑒定獲得重組質(zhì)粒，對重組載體測序后進(jìn)行BLAST分析。測序由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司完成。利用生物數(shù)據(jù)庫PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html)對測序結(jié)果正確的PSP序列進(jìn)行啟動子調(diào)控元件分析。

1.3 豆莢特異性報告載體pPSP-GUS的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

分別對重組克隆載體pMD18-T-PSP和植物表達(dá)載體pBI121進(jìn)行Hind Ⅲ、XbaⅠ雙酶切，回收pMD18-T-PSP小片段和pBI121大片段，利用T4DNA連接酶連接，用豆莢特異性啟動子PSP的片段替換pBI121的CaMV 35S啟動子，與GUS報告基因融合，構(gòu)建重組豆莢特異性報告載體pPSP-GUS，具體操作參照王關(guān)林等[14]的方法。然后采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[15]對煙草“NC89”進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

1.4 轉(zhuǎn)化煙草植株的分子生物學(xué)檢測

采用改良的CTAB法，從煙草葉片中提取基因組DNA作為模板，以豆莢特異性報告載體pPSP-GUS為陽性對照，以未轉(zhuǎn)化植株為陰性對照，以PSP基因和GUS基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中PSP基因的引物和PCR擴(kuò)增條件同1.2。GUS基因的引物序列為GUSs：5′-TGTGATATCTACCCGCTTC -3′和GUSas：5′-GGTTTTTCACCGAAGTTCA-3′。PCR擴(kuò)增體系為25 μL，其中10×buffer 2.5 μL、MgCl22.5 μL、dNPT 0.5 μL、50 pmol/L上下游引物各1 μL、模板0.1 μg、Taq酶 0.3 μL、ddH2O 16.2 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸40 s，40個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定。

對PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因植株，采用CTAB法大量提取葉片基因組DNA，然后進(jìn)行Southern雜交檢測。以純化的PSP基因為模板制備探針，采用隨機(jī)引物標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記，雜交及檢測的其他步驟均按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ試劑盒說明書操作。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的GUS活性組織染色

選取轉(zhuǎn)基因植株的根部、葉片、萼片和花莢等部位的組織樣品進(jìn)行GUS組織化學(xué)分析，GUS染色按照J(rèn)efferson[16]的方法進(jìn)行。以轉(zhuǎn)pBI121質(zhì)粒煙草(GUS基因由CaMV 35S啟動子驅(qū)動)和未轉(zhuǎn)化煙草作為對照，觀察轉(zhuǎn)pPSP-GUS質(zhì)粒煙草(GUS基因由豆莢特異性啟動子PSP驅(qū)動)根部、葉片、萼片和花莢等各組織中的GUS表達(dá)活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆豆莢特異性啟動子PSP片段的克隆

以大豆“吉農(nóng)28”植株幼嫩葉片總 DNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增出大小約1 270 bp、特異性強(qiáng)、單一的擴(kuò)增帶(圖1A)，結(jié)果與預(yù)期相符。將PCR產(chǎn)物電泳回收后連入克隆載體獲得pMD18-T-PSP。重組克隆載體pMD18-T-PSP的PCR結(jié)果(圖1B)和Hind Ⅲ、XbaⅠ雙酶切結(jié)果(圖1C)表明，獲得的片段長度與目的片段大小一致，說明擴(kuò)增片段已成功連入克隆載體中。

圖1 大豆豆莢特異性啟動子PSP片段的電泳結(jié)果

2.2 大豆豆莢特異性啟動子PSP片段的序列分析

對重組克隆載體pMD18-T-PSP的插入片段PSP進(jìn)行測序，序列分析結(jié)果表明，該片段長1 270 bp(圖2)，與已發(fā)表的msg基因序列(登錄號為AJ239127.1)的同源性為98%。利用生物數(shù)據(jù)庫PLACE對PSP序列進(jìn)行啟動子調(diào)控元件分析，結(jié)果表明，PSP中含有多種在其他植物啟動子中存在的通用啟動子元件和豆莢特異表達(dá)所必需的調(diào)控元件(表1)。其中包括：4個A/T-rich core、11個CAATBOX、10個TATABOX，這些常見的通用元件參與基因的增強(qiáng)表達(dá)，在決定啟動子轉(zhuǎn)錄效率上有著很強(qiáng)的作用，能夠在相對較低的水平上引發(fā)轉(zhuǎn)錄，決定起始點的位置和核心啟動子中的定位[17]。該序列中還包含了9個組織特異性表達(dá)必需的GATABOX[18]和一些誘導(dǎo)物應(yīng)答元件，包括11個GT1CONSENSUS(GRWAAW)、6個GTGANTG10(GTGA)、5個IBOXCORE(GATAA)和3個POLLEN1LELAT52(AGAAA)等。由此可以推測，克隆的片段具有啟動基因在豆莢中特異性表達(dá)的功能。

圖2 大豆豆莢特異性啟動子PSP片段的核苷酸序列

表1 大豆豆莢特異性啟動子中可能存在的相關(guān)調(diào)控元件

2.3 豆莢特異性報告載體pPSP-GUS的構(gòu)建

植物表達(dá)載體pBI121是含有CaMV 35S-GUS融合基因系統(tǒng)的雙元載體。為了研究豆莢特異性啟動子PSP的功能，利用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、XbaⅠ分別雙酶切pMD18-T-PSP和pBI121，用所克隆的PSP片段取代植物表達(dá)載體pBI121中的CaMV 35S組成型啟動子，構(gòu)建豆莢特異性報告載體pPSP-GUS，所得結(jié)果如圖3所示。

將pMD18-T-PSP小片段和pBI121大片段用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，得到1條約1 270 bp的特異性條帶(圖4)，與預(yù)期片段大小一致，表明已成功構(gòu)建由該啟動子驅(qū)動報告基因GUS的豆莢特異性報告載體pPSP-GUS。

圖3 豆莢特異性報告載體pPSP-GUS的構(gòu)建

2.4 報告載體pPSP-GUS的轉(zhuǎn)化及分子檢測

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對煙草“NC89”進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化植株72株。從再生抗性植株中隨機(jī)選取42株提取葉片基因組DNA，分別用豆莢特異性啟動子PSP的特異性引物和GUS基因的特異性引物進(jìn)行PCR檢測，分別擴(kuò)增出大小為1 270 bp的PSP片段(圖5A)和1 007 bp的GUS片段(圖5B)，結(jié)果得到PCR陽性植株35株，陽性率達(dá)83.3%。

圖5 轉(zhuǎn)入報告載體pPSP-GUS煙草的PCR檢測

隨機(jī)選取4株經(jīng)PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因植株，以未轉(zhuǎn)化煙草植株為對照，進(jìn)行Southern雜交檢測，結(jié)果表明，PCR檢測為陽性的4株轉(zhuǎn)基因煙草均具有明顯的雜交信號，而未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓隉o雜交信號產(chǎn)生(圖6)，進(jìn)一步證明這4株轉(zhuǎn)基因植株是轉(zhuǎn)基因陽性植株，說明外源基因PSP目的片段已經(jīng)整合到煙草的基因組中，整合形式均為單拷貝形式。其中標(biāo)號為4和6的轉(zhuǎn)基因植株外源基因整合位點基本相同，標(biāo)號為3和5的轉(zhuǎn)基因植株與其他2株的外源基因整合位點均不相同。

圖6 轉(zhuǎn)入報告載體pPSP-GUS煙草的Southern雜交檢測

2.5 轉(zhuǎn)基因煙草的GUS活性檢測

對PCR和Southern雜交檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行GUS活性組織化學(xué)染色，結(jié)果(圖7)表明，在未轉(zhuǎn)化煙草植株的根部、葉片、萼片和花莢中均未檢測到GUS活性。在轉(zhuǎn)pBI121質(zhì)粒煙草的根部、葉片、萼片和花莢中均檢測到了GUS活性。在轉(zhuǎn)pPSP-GUS豆莢特異性報告載體的轉(zhuǎn)基因煙草的根和葉片中檢測不到GUS活性，而在其萼片和花莢中檢測到了GUS活性；且在轉(zhuǎn)基因煙草萼片部位的GUS活性表達(dá)效果明顯低于轉(zhuǎn)pBI121表達(dá)載體(GUS基因由CaMV 35S啟動子驅(qū)動)的對照，而在其花莢中的表達(dá)效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)pBI121表達(dá)載體的煙草植株。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草的GUS基因是在豆莢特異性啟動子PSP的調(diào)控下特異性表達(dá)的，證明所克隆的1 270 bp的PSP基因片段具有豆莢特異性啟動子的功能。

圖7 轉(zhuǎn)入報告載體pPSP-GUS煙草的GUS組織化學(xué)染色

3 討 論

本研究通過提取大豆品種“吉農(nóng)28”全基因組DNA，利用PCR方法成功克隆了大豆豆莢特異性啟動子PSP的核心片段，大小為1 270 bp。通過在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，該片段含有典型的啟動子元件和組織特異性表達(dá)啟動子必需的元件，其中包括參與和光響應(yīng)有關(guān)的花莢形成及開花過程的GATABOX[19]，許多光響應(yīng)啟動子都包含GATABOX和與其有關(guān)的核蛋白。有研究表明，啟動子中控制基因組織特異性表達(dá)的序列一般位于TATABOX附近[20]，本研究所得PSP片段的9個GATABOX中有6個位于TATABOX附近。根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點初步推測所克隆得到的片段為大豆豆莢特異性啟動子。

GUS活性檢測結(jié)果顯示，由pPSP-GUS豆莢特異性報告載體啟動的GUS基因在轉(zhuǎn)基因煙草的根和葉片中檢測不到GUS活性，但其可以在花莢和萼片中表達(dá)，且在花莢中的表達(dá)效果明顯高于萼片，結(jié)合PSP片段中啟動子元件和序列位置的特點，推測其參與花莢形成，能夠驅(qū)動外源基因在萼片部位低水平表達(dá)，在花莢中高效表達(dá)，在植物的根和葉片部位基本不表達(dá)，證實PSP片段確有豆莢特異性表達(dá)功能。

本研究克隆得到的豆莢特異性啟動子序列，大小為1 270 bp，與吳書音等[21]分離的Pmsg啟動子片段相比，雖少約1 000 bp，但典型的啟動子元件和組織特異性表達(dá)啟動子必需元件均包含在內(nèi)，且GUS活性在花莢中的表達(dá)效果明顯，并構(gòu)建了豆莢特異性報告表達(dá)載體pPSP-GUS，這為進(jìn)一步研究抗病蟲基因在大豆莢中的特異表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

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