二倍體馬鈴薯葉肉細胞原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究

袁華玲, 金黎平, 黃三文, 李 穎, 屈冬玉

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院 蔬菜花卉研究所，北京 100081; 2.合肥師范學院 生命科學系，合肥 230601)

植物原生質(zhì)體是開展遺傳理論研究良好的試驗材料，以原生質(zhì)體為材料可以從遺傳學、分子生物學、細胞生物學、植物生理學角度對細胞起源、細胞壁的生物合成、細胞膜的結(jié)構(gòu)與功能、細胞核質(zhì)關(guān)系以及植物激素作用機理等方面進行研究。原生質(zhì)體還是遺傳轉(zhuǎn)化研究的理想受體，沒有細胞壁的原生質(zhì)體比較容易攝取外源的DNA、細胞器、病毒、質(zhì)粒等，可以有目的地轉(zhuǎn)入特定基因，改良作物的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性等。原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株過程中，往往會產(chǎn)生無性系變異，同時原生質(zhì)體也可以通過理化因素誘變得到突變體，經(jīng)適當篩選可選出有利用價值的變異體。利用原生質(zhì)體融合技術(shù)能夠克服雜交不親和，進行遠緣的體細胞雜交，創(chuàng)造新種質(zhì)，因此植物原生質(zhì)體在改變植物遺傳性、改良作物品種的應用研究以及生物學的基礎(chǔ)理論研究中有著廣泛的用途[1, 2]。

馬鈴薯是原生質(zhì)體培養(yǎng)研究較多的物種，有不少成功的報道[3-6]，涉及的材料有四倍體栽培種、雙單倍體品系和野生種，供體材料有葉片、塊莖、芽、實生苗子葉及下胚軸游離細胞，其中以葉片游離細胞來源的居多，但是馬鈴薯原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)的程序多樣，多數(shù)只是經(jīng)驗的總結(jié)，未能使技術(shù)達到系統(tǒng)化、程序化，存在著重復性和通用性較差的問題，有待于進一步研究。

中國馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)起步晚，培養(yǎng)成功的二倍體和雙單倍體的基因型較少，本研究選用抗青枯病二倍體材料、炸片顏色好的二倍體材料以及具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的雙單倍體，對馬鈴薯葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)進行研究，以期為利用體細胞雜交技術(shù)選育馬鈴薯新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以馬鈴薯抗青枯病二倍體材料ED13和CE171、炸片顏色好的二倍體材料HS66以及優(yōu)良性狀雙單體材料DH401和DH405為供體材料。其中ED13和CE171來源于馬鈴薯ED和CE分離群體，ED分離群體的親本為E(772102.37)、D(USW7859)、C(USW5337)，其中E來源于二倍體抗青枯病原始栽培種S.phureja.和S.vernei, 其遺傳背景見文獻[7]。HS66引自美國，DH401和DH405引自加拿大。供體材料培養(yǎng)在含2% 蔗糖和1 mg/L STS 固體MS培養(yǎng)基上，試管苗培養(yǎng)在25℃±1℃的培養(yǎng)室中, 光照強度54～60 μmol/ m2/s，每天16 h光照。

1.2 方法

1.2.1 預處理方法

葉片懸浮黑暗預培養(yǎng)是在無菌條件下剪取試管苗上部葉片約1 g，按Haberlach等人方法[3]進行。植株黑暗處理是將苗齡3周的試管苗連同三角瓶置于25℃黑暗中48 h。

1.2.2 原生質(zhì)體分離、純化和培養(yǎng)

原生質(zhì)體分離純化程序參照按周宇波方法[8]略修改，酶解液基本組成為CPW，附加PVP、甘露醇、BSA、MES、纖維素酶和離析酶，酶解后純化，用血球計數(shù)板計算原生質(zhì)體產(chǎn)量，F(xiàn)DA染色后熒光顯微鏡下觀察生活原生質(zhì)體數(shù)，計算原生質(zhì)體活力。純化后的原生質(zhì)體密度調(diào)整為5×105個/mL，取600 μL加6 mL培養(yǎng)基培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中。25℃黑暗培養(yǎng)1周后，逐漸轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，在15 d左右用稀釋培養(yǎng)基稀釋8～10倍，繼續(xù)光下培養(yǎng)。培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)條件為，溫度25℃ ± 1℃, 光照強度54～60 μmol/ m2/s，每天16 h光照。

原生質(zhì)體在液體培養(yǎng)基中生長成1 mm大小的愈傷組織時，將其轉(zhuǎn)移到愈傷組織生長培養(yǎng)基中。2周后，將生長到3～4 mm的愈傷組織轉(zhuǎn)移到芽誘導培養(yǎng)基中，當誘導出的芽生長到1 cm長時，將芽切下接種到固體MS培養(yǎng)基中，植株生長并生根。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預處理對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

植物細胞的生理狀態(tài)以及細胞是否耐受損傷具有較強的修復能力影響原生質(zhì)體培養(yǎng)。預處理是在酶解前通過對材料的處理，改變細胞和細胞壁的生理狀態(tài)，增加細胞膜的耐受度，減少原生質(zhì)體損傷，提高酶解效率。以ED13為材料，用葉片懸浮黑暗預處理和試管苗黑暗預處理兩種不同的方法對供體材料進行預處理，預處理后取約1 g葉片進行酶解分離，酶解液CPW附加2%PVP、0.5 mol/L甘露醇、0.2%BSA、3 mmol/L MES、0.3%纖維素酶和0.1%離析酶，酶解12 h。結(jié)果見表1。由表1可以看出，兩種預處理方式對原生質(zhì)體活力無顯著影響。從減少操作環(huán)節(jié)、降低污染的可能性的角度來說，試管苗黑暗預處理方式要優(yōu)于葉片懸浮黑暗預處理方式。

表1 預處理方式對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

注：表中英文字母相同的數(shù)值間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 酶解液組成及酶解時間對原生質(zhì)體分離的影響

2.2.1 酶解液中滲透壓對原生質(zhì)體膜穩(wěn)定性的影響

圖1 酶解液中不同濃度甘露醇對電導率的影響

由于原生質(zhì)體本身穩(wěn)定性差，很容易破碎，為保持釋放出的原生質(zhì)體具高活力，酶解液中常加入滲透劑以維持一定的滲透壓，應用最廣泛的是甘露醇和山梨醇。當細胞膜受到傷害時，細胞的通透性增大，細胞膜內(nèi)的電解質(zhì)外滲，細胞浸提液的電導率增大，因此電導率可反映細胞膜傷害的強度。以ED13為材料，甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑，探討滲透壓對原生質(zhì)體膜穩(wěn)定性的影響。酶解液CPW，附加2%PVP、0.2%BSA、3 mmol/L MES、0.3%纖維素酶、0.1%離析酶和不同濃度甘露醇，酶解12 h。結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，葉片25℃酶解12 h時，電導率隨著甘露醇濃度的提高先降后升，在甘露醇濃度為0.5 mol/L時，電導率最低，表明細胞內(nèi)電解質(zhì)滲漏最少，細胞受到的傷害最小。

2.2.2 酶解時間對原生質(zhì)體膜穩(wěn)定性的影響

以ED13為材料，酶解液CPW，附加2%PVP、0.2%BSA、3 mmol/L MES、0.3%纖維素酶和0.1%離析酶，研究酶解時間對電導率的影響。結(jié)果表明，與完整葉片相比，葉片切割后溶液中電導率增加，表明細胞破碎或受到傷害，電解質(zhì)外滲。隨著酶解時間的增加，電導率逐漸提高，表明酶解時間越長，細胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲的越多，細胞受到的傷害越大。因此在能獲得足夠數(shù)量的原生質(zhì)體前提下，酶解的時間越短越好。

CK1：完整葉片；CK2：葉片切條；1: 4 h；2: 8 h；3:12 h；4: 16 h；5: 20 h

2.2.3 基因型、酶濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

酶的種類和濃度是影響原生質(zhì)體活力和產(chǎn)量的最主要因素。以ED13為材料，酶解液CPW，附加2%PVP、0.2%BSA、3 mmol/L MES以及不同濃度纖維素酶和離析酶，酶解葉片12 h，研究酶濃度對原生質(zhì)體分離的影響，結(jié)果見表2。由表2可知，纖維素酶濃度過低(0.1%)，游離的單細胞少，且呈不規(guī)則形狀，表現(xiàn)為細胞壁不完全降解的特征；隨著纖維素酶濃度的提高，游離的單細胞增多，細胞呈圓球形；纖維素酶的濃度過高(1%)，細胞破碎現(xiàn)象較為嚴重，細胞碎片多。離析酶濃度低(0.01%)，葉片組織不能充分解離；隨著離析酶濃度的增加，葉片組織解離，游離的單細胞增多；離析酶濃度過高(0.5%)，葉肉細胞破碎，單細胞減少。

由于不同基因型葉片結(jié)構(gòu)存在差異，不同基因型酶解時所需的最佳酶濃度略有差異，分別設(shè)纖維素酶濃度為0.3%和0.4%，離析酶濃度0.05%和0.1%，觀察不同酶組合對不同基因型分離的效果，結(jié)果見表3。由表3可知，在不同的酶組合中不同基因型的分離效果有差異，ED13、HS66和DH405分離時所需的酶濃度較低，在0.3% Cellulase + 0.1% Macerozyme的酶組合中分離的效果較好；CE171和DH401分離所需的酶濃度較高，在0.4% Cellulase + 0.1% Macerozyme的酶組合中分離的效果較好。

表2 不同酶組合對葉肉原生質(zhì)體分離的影響

表3 不同基因型分離的效果

注：“+”表示原生質(zhì)體產(chǎn)量或活力低；“++”表示原生質(zhì)體產(chǎn)量或活力中等；“+++”表示原生質(zhì)體產(chǎn)量或活力高。

2.2.4 原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生

分離純化的原生質(zhì)體調(diào)整密度5×105個/mL后，取600 μL加入到有6 mL VKM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，25℃黑暗條件下培養(yǎng)，第2 d細胞開始膨大，逐漸變?yōu)闄E圓形，細胞第1次分裂發(fā)生在培養(yǎng)后的3～5 d，第7 d將培養(yǎng)皿置于弱光下，并逐漸增加光強，培養(yǎng)7～10 d左右形成多細胞團，2周后要及時用稀釋培養(yǎng)基進行8～10倍的稀釋，否則細胞褐化死亡，可能由于細胞生長過快引起營養(yǎng)枯竭或毒副產(chǎn)物積累所致。培養(yǎng)物稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)3～4周，原生質(zhì)體形成大量肉眼可見的愈傷組織。將小愈傷轉(zhuǎn)移到愈傷組織生長培養(yǎng)基上，這些小愈傷在愈傷組織生長培養(yǎng)基上生長很快，約2周長成直徑約3～4 mm大小的愈傷組織，再將愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，誘導芽的生成。由于馬鈴薯愈傷組織芽誘導所需時間較長，愈傷組織在分化培養(yǎng)基上每隔2周轉(zhuǎn)移1次。第1個芽發(fā)生在愈傷組織在分化培養(yǎng)基上誘導2個月左右，當芽長到0.5 cm以上時，可以將其切下，轉(zhuǎn)移到無激素固體MS培養(yǎng)基上生長，無根苗在無激素固體MS培養(yǎng)基上可以自行生根 。

不同基因型在培養(yǎng)中的反應不同，存在著基因型差異(表4)。在VKM 培養(yǎng)基上培養(yǎng)6～8周，ED13和DH401原生質(zhì)體能夠形成3～4 mm愈傷組織，轉(zhuǎn)移到誘導芽的培養(yǎng)基上，8周后分化出具有芽和根的完整植株，但是分化率較低，183塊ED13愈傷組織只有39塊分化出芽，分化率只有21.3%，157塊DH401 愈傷組織只有27塊分化出芽，分化率只有17.2%；HS66和CE171原生質(zhì)體培養(yǎng)6～8周也能形成3～4 mm愈傷組織，但沒有分化出芽；DH405的原生質(zhì)體不分裂。

表4 不同基因型對原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響

注：“+”表示有；“-”表示無。

A—葉片漂浮預處理；B—界面法純化原生質(zhì)體；C—純化的原生質(zhì)體；D—FDA檢測原生質(zhì)體活力。

3 討論

原生質(zhì)體培養(yǎng)及再生體系的建立是原生質(zhì)體技術(shù)應用于育種實踐的前提。馬鈴薯原生質(zhì)培養(yǎng)中首先要保證分離的原生質(zhì)體有持續(xù)分裂的能力，其影響因素除培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)方法外，供體的基因型、供體的生理狀況、原生質(zhì)體活力等均可影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的成敗。

基因型是原生質(zhì)體培養(yǎng)的關(guān)鍵因子。曾有文獻報道油菜的再生能力以AABB 染色體組品種最強，AACC 次之，AA最差[9]。此外在苜蓿、生姜、葡萄、馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)時也發(fā)現(xiàn)在愈傷組織形成或再生上存在著基因型差異[10-12]。本試驗中，馬鈴薯原生質(zhì)培養(yǎng)中也是有些基因型獲得了再生植株，DH405只分離到了活力強的原生質(zhì)體，但不能持續(xù)分裂，雖然CE171和HS66獲得了多細胞團的小愈傷，但失去了再分化的能力。

A—原生質(zhì)體膨大；B—原生質(zhì)體第一次分裂；C—形成的多細胞團；D—形成的小愈傷；E—愈傷組織分化出芽；F—原生質(zhì)體再生出完整植株。

酶解時間和酶解溫度對原生質(zhì)體活力有決定性的影響，研究表明隨著酶解時間增加，原生質(zhì)體破裂，原生質(zhì)體活力下降[13， 14]。我們的研究表明，總的趨勢是酶解時間短，原生質(zhì)體產(chǎn)量低；酶解時間長原生質(zhì)體破裂較多，原生質(zhì)體膜不穩(wěn)定，膜的滲透性增加，原生質(zhì)體活力降低甚至死亡，但是不同基因型最適酶濃度不同，需要在實踐中反復摸索。推測可能與供體植株生長環(huán)境、生理狀態(tài)以及葉片結(jié)構(gòu)組成差異有關(guān)。

酶解液和純化溶液中的滲透壓也影響原生質(zhì)體的活力。由于原生質(zhì)體本身穩(wěn)定性差的特性，很容易導致其破碎。因此原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)過程中，必須加入適當濃度的滲透劑以維持一定的滲透壓，滲透壓過高或過低都會影響原生質(zhì)體膜的穩(wěn)定性，造成原生質(zhì)體凋亡或破裂。前人在分離馬鈴薯原生質(zhì)體時所用的酶液，使用0.4～0.6 mol/L的甘露醇維持滲透壓[15， 16]。我們研究結(jié)果表明，酶解液中滲透壓的過高或過低會造成電導率增加，當酶解液含有0.5 mol/L甘露醇時，電導率最低，表明原生質(zhì)體膜的滲透性最小，受到的傷害最少。

本研究通過原生質(zhì)體分離純化條件的摸索，已獲得高產(chǎn)量、高活力原生質(zhì)體，并培養(yǎng)成試管苗，已建立馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)體系，為馬鈴薯體細胞雜交奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻:

[1]許智宏，衛(wèi)志明. 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和遺傳操作[M]. 上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1997.

[2]朱至清. 植物細胞工程[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2003.

[3]Haberlach G T, Cohen B A, Reichert N A, et al. Isolation, culture and regeneration of protoplasts from potato and several relatedSolanumspecies[J]. Plant Science, 1985, 39: 67-74.

[4]Hunt G J, Helgeson J P. A medium and simplified procedure for rowing single cells fromSolanumspecies[J]. Plant Science, 1989, 60: 251-257.

[5]Xu Y S, Pehu E, R.Malone, et al. Plant regeneration from protoplast ofSolanumspecies with potential agricultural value (S.hiertingii,S.polyadenium,S.capsicibaccatum) [J]. Plant Cell Reports, 1991, 9: 520-522.

[6]Szczerbakowa A, Maciejewska U, Pawlowski P, et al. Electrofusion of protoplast fromSolanumtuberosum,S.nigrumandS.bulbocastanum[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2001, 23: 169-179.

[7]Qu D Y. Use of unreduced gametes of potato for TPS production through 4X-2X crosses: (dissertation)[D]. Wageningen: Wageningen Agricultural University, 1996.

[8]周宇波，柳 俊, 謝從華,等. 馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)體系改良[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學學報，2001，20：469-473.

[9]劉選明，官春云. 油菜原生質(zhì)體培養(yǎng)與融合技術(shù)的研究進展[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學學報，1997，35：832-492.

[10]黃百渠. 植物體細胞遺傳學簡明教程[M]. 長春：東北師范大學出版社，1991.

[11]Coleman M, Davie P, Vessey J, et al. Intraclonal genetic variation for protoplast regeneration ability withinSolanumtuberosumcv. record[J]. Annals of Botany, 1991, 67: 459-461.

[12]Orczyk W, Przetakie-wicz J, Nadolska-orczyk A, et al. Somatic hybrids ofSolanumtuberosumapplication to genetics and breeding[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2003, 74: 1-13.

[13]吳旺澤，王 蒂, 王 清,等. 馬鈴薯原生質(zhì)體游離與培養(yǎng)體系的研究[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2004，39：146-149.

[14]趙維峰， 孫光明. 毛葉棗與冬棗原生質(zhì)體分離體系的建立[J]. 熱帶作物學報，2006，27：51-55.

[15]Orczyk W, Przetakiewicz J, Nadolska-Orczyk A, et al. Somatic hybrids ofSolanumtuberosum- application to genetics and breeding [J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2003, 74: 1-13.

[16]Oberwalder B, Schilde-Rentschler L, Loffelhardt-Ruo B, et al. Differences between hybrids ofSolanumtuberosumandSolanumcircaeifoliumBitt. Obtained from symmetric and asymmetric fusion experiments[J]. Potato Research, 2000, 43: 71-82.