楊從戎, 苗 亮, 李明云
(寧波大學 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室, 浙江 寧波 315211)
黑鯛(Sparusmacrocephalus)屬鱸形目(Perciformes)、鯛科(Sparidae)、鯛屬(Sparus),俗稱黑加吉、黑鰍、黑立,多棲息于泥沙底質(zhì)或巖礁聚集的淺海岸邊,屬暖水性底層魚,分布于中國、日本沿海及朝鮮半島。黑鯛食性雜、生長迅速、抗病力和適應(yīng)性強,適合沿海網(wǎng)箱和池塘養(yǎng)殖,加上其肉質(zhì)與口感極佳、營養(yǎng)豐富、適宜垂釣,深受廣大消費者的喜愛,因此具有很高的經(jīng)濟價值。20世紀末,由于黑鯛育苗試驗的成功,在中國沿海各地,黑鯛養(yǎng)殖得到了快速發(fā)展,逐漸成為國內(nèi)一種重要的海水養(yǎng)殖品種[1]。目前,有關(guān)黑鯛的研究主要集中在繁育和養(yǎng)殖等方面[2-5],而有關(guān)黑鯛同工酶方面的研究僅見王可玲等[6]對黑鯛等5種海水魚同工酶表達的簡單分析,但未對黑鯛同工酶的組織表達差異做詳盡描述。
同工酶(isozyme)是指由一個或多個基因座位編碼、催化同一生化反應(yīng)、在電場中的運動存在多種可分離形式的酶[7],同工酶分析是研究生物生化遺傳特征的主要方法之一。目前已對多種魚類進行了同工酶分析[8],研究的同工酶種類也較多,其中在生理學和組織特異性研究方面,多使用乳酸脫氫酶(LDH)、醇脫氫酶(ADH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、蘋果酸酶(ME)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、酯酶(EST)、半乳糖脫氫酶(GAD)、甲酸脫氫酶(FDH)等同工酶進行分析和比較[9, 10]。
筆者分析了上述9種同工酶在黑鯛不同組織中的表達情況,以期為黑鯛的生化遺傳分析、種質(zhì)資源保護等研究提供基礎(chǔ)資料。
實驗用黑鯛購自浙江省寧波市路林水產(chǎn)市場,共10尾,平均體重482 g,斷尾放血后立即在冰上解剖,取眼睛、鰓、腦、心、腎、脾、肝、腸和肌肉等9種組織,按1∶ 3的比例(W/V)加入pH值7.0,0.1 mol/L的PBS,冰浴條件下充分勻漿后以15 000 r/min低溫(4℃)離心30 min(部分組織須多次離心至酶液澄清)。吸取上清酶液,加入等體積的40%甘油及1/10體積的0.1%溴酚藍電泳指示劑后電泳分析。
實驗采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳法,其中濃縮膠pH值為6.8,濃度為3.6%;分離膠pH值為8.8,濃度為8.2%。電極緩沖液為pH值8.3的Tris-甘氨酸緩沖溶液。電泳在冰浴中進行,起始電壓為150 V。當溴酚藍指示帶進入分離膠后,將電壓升高至350 V。約2 h后,待指示帶至玻璃板底部2~3 cm處,結(jié)束電泳,立即進行染色。染色參考王中仁[11]的方法進行,略加修改,之后用7.5%冰醋酸溶液終止染色并固定,掃描儀掃描、記錄。
染色后的凝膠經(jīng)7.5%冰乙酸溶液脫色固定后凝膠成像,記錄酶帶的遷移距離和顏色深度。同工酶的縮寫、命名采用胡能書等[12]的方法,從陰極到陽極依次命名為1,2,3…。
由圖1可見,黑鯛的9種組織中均有LDH表達,共檢測到15條酶帶。其中眼和腦條帶復雜,有多條特異表達的條帶;肌肉有3條帶,其余組織均為1條帶;心臟中LDH活性最高,肝臟中活性最低(圖1)。
圖1 黑鯛不同組織LDH圖譜
ADH是一種催化醇脫氫形成醛或酮的酶,一般為二聚體酶,在黑鯛各組織中共表現(xiàn)出4個條帶。Adh-1在各組織中均有檢出,為基礎(chǔ)性表達;Adh-2,Adh-3在眼、鰓、腎、脾、肝和腸道6個組織中表達,表現(xiàn)出二聚體特性;Adh-4只在眼睛中特異表達(圖2)。
在黑鯛組織中可以檢測到上清液型(s-MDH)和線粒體型(m-MDH)兩種類型的蘋果酸脫氫酶。m-MDH更靠近陰極,主要在鰓、腦、心、腎和肝中表達,但活性較弱。s-MDH靠近陽極,其中 s-Mdh-1在9個組織中都有表達,肝和腸中活性最強;s-Mdh-2只在肌肉和心臟中表達。9種組織中, s-MDh的活性高于m-MDh(圖3)。
圖2 黑鯛不同組織ADH圖譜
圖3 黑鯛不同組織MDH圖譜
ME在黑鯛9種組織中共檢測到4個條帶。其中Me-1和Me-2只在腎、肝、腸中特異性表達,活性較弱;而Me-3和Me-4在各組織中都有表達,肝臟中活性最強,眼中活性最弱(圖4)。
圖4 黑鯛不同組織ME圖譜
黑鯛的9個組織中SOD均有4條酶帶,分為上清液型(s-SOD)和線粒體型(m-SOD)兩種。 m-SOD為一條酶帶;s-SOD為二聚體酶,由3個基因座位編碼,表現(xiàn)為3條靠得很近的酶帶(圖5)。
黑鯛眼、腦、肌肉和腸中均未檢測到POD條帶。其余5個組織中共出現(xiàn)5個條帶,為單體或二聚體;其中Pod-1—Pod-4在這5個組織中都有表達,但活性差異較大;脾中活性最強,肝中活性最低;而Pod-5只在心臟中表達(圖6)。
圖6 黑鯛不同組織POD圖譜
黑鯛的EST表型較復雜:心臟和肌肉組織中未檢測到條帶;在眼、鰓、腦中出現(xiàn)2~3個微弱條帶;在腎、脾、肝、腸4個組織各有5~10個條帶,其中腎和腸中條帶最多;活性也是腎和腸中明顯強于其他組織。(圖7)。
圖7 黑鯛不同組織EST圖譜
黑鯛9種組織中均有GAD表達,共出現(xiàn)4條酶帶。其中Gad-1、Gad-3、Gad-4在各組織中都有表達;Gad-2條帶僅在肝臟中表達;肌肉中GAD活力明顯弱于其他組織(圖8)。
黑鯛的FDH為二聚體酶,9個組織共有6條酶帶,其中僅Fdh-2為基礎(chǔ)表達,在9個組織中都有條帶且活性差異不大;其余均為組織特異表達:Fdh-1僅在肝中表達,F(xiàn)dh-3在腎和腸中表達,F(xiàn)dh-4僅在腎中表達;Fdh-5、Fdh-6僅在眼中表達(圖9)。
圖8 黑鯛不同組織GAD圖譜
圖9 黑鯛不同組織FDH圖譜
本文研究結(jié)果顯示黑鯛具有較為完善的同工酶系統(tǒng),這使得黑鯛對各種生存條件具有較好的適應(yīng)性。機體在發(fā)育過程中各組織分化,導致了不同組織同工酶的特異性表達,從而能滿足不同組織特定的生理功能。9種同工酶在不同組織中的表達差異詳見表1。由表1可見9種同工酶按其生理功能在不同組織中表達活性和條帶數(shù)量各有所不同。
LDH是一種糖酵解酶,主要與乳酸的產(chǎn)生和利用有關(guān)。肌肉是機體無氧代謝較為旺盛的組織,黑鯛肌肉中LDH表現(xiàn)出3條酶活較強的條帶,主要作用是催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸,參與無氧代謝;心臟中LDH酶活最高,這是因為LDH還能催化乳酸氧化形成丙酮酸,參與有氧代謝。LDH在肌肉和心臟中大量表達的情況與金春華等[13]對大彈涂魚LDH研究結(jié)果相一致。一般認為C基因控制的LDH表型在部分魚類的眼和肝臟中表達[9],而這與黑鯛眼組織中特異的Ldh-15條帶對應(yīng)。同時在黑鯛腦組織中,存在數(shù)量較多且活性較弱的大量條帶,可能是由于有副帶或?qū)嶒炚`差的原因,需要進一步實驗進行驗證。ADH也是種無氧代謝相關(guān)的酶,在缺氧的情況下可將體內(nèi)多余的丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙醇,從而避免機體因丙酮酸積累而中毒死亡。在黑鯛各組織中,心臟ADH酶活最強,這與黑鯛較強的耐低氧能力相一致。
表1 黑鯛9種組織9種同工酶活力與條帶數(shù)量比較
注:“+++”:活性強;“++”:活性較強;“+”:有活性條帶不清晰;“***”:條帶數(shù)量多;“**”:條帶數(shù)量較多;“*”:較少或一個條帶;“-”:無條帶或無活性。
MDH和ME是生物氧化的重要酶類,分別負責草酰乙酸和蘋果酸的相互轉(zhuǎn)化以及蘋果酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸過程。黑鯛的MDH為二聚體,分為上清液型和線粒體型,兩種類型的酶分別由兩種基因座位編碼,在臟和腸組織中活性最高。ME是四聚體酶,由4個基因座位編碼,同樣也在肝和腸組織中活力最強。
SOD、POD、EST這3種酶與機體的免疫解毒功能密切相關(guān)。黑鯛SOD同工酶表型特征為在各組織中皆有表達,且酶活較強。李明云等[14]在香魚的研究中發(fā)現(xiàn)SOD在脾臟和肝臟的活性較強,而肌肉等組織中未見表達,這種表達差異可能和兩者生存環(huán)境以及生物學特性有關(guān)。POD能利用過氧化氫氧化嘌呤、酚類和胺類等有毒物質(zhì),以減輕這類物質(zhì)對機體的毒害作用[15],黑鯛的POD在脾中有大量表達,預示著脾組織中存在著較強的和過氧化氫氧化相關(guān)的免疫代謝。EST是一種水解酶,主要作用催化脂類水解。黑鯛的腎臟和腸道中存在大量EST的表達,與酯酶主要參與解毒與消化功能相關(guān)。GAD與FDH在黑鯛各組織中表現(xiàn)出各組織中皆有表達且活性較弱的特性,這可能與這2種同工酶所控制的甲酸代謝和半乳糖代謝在黑鯛體內(nèi)代謝水平較低有關(guān)。
眼是魚類視覺的感覺器官,雖然不參與體內(nèi)其他生命活動,但對生物體意義重大;在同工酶表達上,也存在一定的特異表達,例如在大部分魚的眼組織中存在特異的C基因控制的LDH表型[9]。黑鯛眼組織同工酶表達特征是同一種同工酶具有多種表達,但活性不高,例如ADH和LDH圖譜中,眼都是條帶數(shù)量最多的組織,但酶活不是最強。分析其原因,可能因為眼是暴露在體表的器官,增加了外界病原體侵襲和環(huán)境刺激的機會,且眼組織比較敏感,因此這種同工酶表達特性,有助于眼組織及時處理各種應(yīng)激,確保眼功能的穩(wěn)定。
硬骨魚類腸組織主要負責消化功能,但由于本身沒有腸腺,只有依靠腸本身的上皮細胞分泌酶類參與消化,因此腸道中自身分泌著大量消化酶參與食物的消化和吸收。此外,腸組織還具有免疫功能,例如免疫屏障(免疫活性細胞、抗體系統(tǒng)等)、生物屏障(正常菌群共生)、化學屏障(胃酸及糖蛋白等)、物理屏障(粘液、吸附、再生、運動),因此實際上腸組織是硬骨魚類最大最復雜的免疫器官[16]。在同工酶研究中,一般以眼睛、肌肉、鰓、心臟、肝臟、腎臟和脾等組織作為研究對象[6,13],對腸組織的同工酶研究鮮有報道。管丹東[17]和董旭輝[18]對大黃魚和鬼鮋進行同工酶研究時對腸組織進行過取樣檢測,但未系統(tǒng)分析腸組織同工酶表達特性。本實驗對黑鯛腸組織的同工酶表達模式作了較為詳細的研究。結(jié)果顯示在所詳細研究的9種同工酶中,除了POD外,其他8種同工酶在腸組織中都有表達,且活性很強。腸組織相比其他組織,具有更為完善的同工酶系統(tǒng),這正和腸組織消化吸收以及免疫等重要的生理功能相適應(yīng),說明腸組織中存在著較為旺盛的代謝活動。該研究結(jié)果可為黑鯛等魚類腸組織功能及其相關(guān)的研究提供參考。
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