復(fù)方魚腥草對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌體外培養(yǎng)生長(zhǎng)的影響

蔡燕，韓雪梅，葉紅，廖琪，汪聰亞，許媛1，，黃義山1，

(川北醫(yī)學(xué)院 1.附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；2.附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫研究所；3.檢驗(yàn)系，四川 南充 637000)

中國(guó)全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)(Mohnarin)2011年度報(bào)告[1]中顯示鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥率持續(xù)上升，亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別高達(dá)56.8%和58.7%；本院[2]2005年至2010年間分離的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌占79.24%，泛耐藥菌株占17.20%。可見鮑曼不動(dòng)桿菌感染給臨床治療帶來(lái)很大的困難，目前被認(rèn)為是危害全世界尤其是重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)危重患者健康亟待解決的問題[3]。當(dāng)前迫切需要研發(fā)新的抗菌藥物來(lái)治療其引起的重癥感染。我國(guó)中草藥中不少藥物具有抗菌作用[4-6]。復(fù)方魚腥草片含有魚腥草、黃芩、板藍(lán)根、連翹和金銀花等，是一種復(fù)合中藥制劑，在臨床上主要用于感冒、咳嗽等，療效顯著。故本實(shí)驗(yàn)擬運(yùn)用微量肉湯法稀釋法和瓊脂稀釋法探討復(fù)方魚腥草對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌生長(zhǎng)的是否有影響，為臨床上治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染提供潛在新藥。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 溶液配制 培養(yǎng)基：水解酪蛋白培養(yǎng)基即 MH(Mueller-H inton)肉湯，用去離子水稀釋，高壓滅菌備用。藥物：復(fù)方魚腥草片(0.41 g/片，海南海力制藥有限公司生產(chǎn))，去掉藥片表面的糖衣，碾碎后用生理鹽水配制為128 mg/mL備用。

1.1.2 菌株 采用美國(guó)得靈公司生產(chǎn)的NC21鑒定藥敏板及配套試劑和Vitek-32進(jìn)行菌株鑒定和藥敏測(cè)定，從本院檢驗(yàn)科微生物室 2013年11月9日至 2013年 11月19日臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌株中篩選出20株菌株(其中含2株敏感菌株和18株對(duì)三類及以上藥物耐藥的多重耐藥菌株)。并以鮑曼不動(dòng)桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606作為質(zhì)控菌株。各菌株皆保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 儀器 Vitek Special DR100 Colorimeter(美國(guó)HACH COMPANY)調(diào)節(jié)菌懸液，采用美國(guó)恒溫振蕩水浴培養(yǎng)箱和恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)菌。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 復(fù)蘇細(xì)菌：將凍存的各株鮑曼不動(dòng)桿菌接種到MH平板上，35 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。細(xì)菌擴(kuò)增：挑取單菌落至1 mL肉湯中，35 ℃振蕩培養(yǎng)12 h左右(根據(jù)既往經(jīng)驗(yàn)，此時(shí)鮑曼不動(dòng)桿菌可進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期)收集細(xì)菌。配制菌懸液：用生理鹽水稀釋各株鮑曼不動(dòng)桿菌，采用Vitek Special DR100 Colorimeter調(diào)整各株細(xì)菌濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?大約1×108cfu/mL)，并用MH肉湯按1∶1000稀釋備用。

1.2.2 藥物稀釋 實(shí)驗(yàn)時(shí)各組藥物的終濃度分別為：6 400 μg/mL、3 200 μg/mL、1 600 μg/mL、800 μg/mL、400 μg/mL、200 μg/mL。(1)微量肉湯稀釋法：將128 mg/mL的復(fù)方魚腥草素稀釋10倍，各取100 μL加至96孔微量板相應(yīng)孔中備用。(2)瓊脂稀釋法：將128 mg/mL的復(fù)方魚腥草素稀釋1倍為64 mg/mL，再依次倍比稀釋為終濃度的10倍，各取1 000μL加至6 mm培養(yǎng)皿中，然后取9 mL經(jīng)高壓滅菌的MH瓊脂分別加至相應(yīng)的平板中，輕微搖勻，待凝固后放4 ℃冰箱中備用。

1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng) (1)微量肉湯稀釋法：各取100 μL已稀釋好的菌懸液接種到96孔微量板的相應(yīng)孔中，同時(shí)設(shè)定不加藥物和不加細(xì)菌的空白孔(只加MH肉湯)、不加藥物的陽(yáng)性細(xì)菌對(duì)照孔和不加細(xì)菌的陰性對(duì)照孔，每孔總量為200 μL， 不足者以 MH 培養(yǎng)基補(bǔ)入。每一藥物濃度均做3個(gè)復(fù)孔。加樣完畢后，將96孔板置恒溫(35 ℃)水浴振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)瓊脂稀釋法：將稀釋好的菌液各取2 μL接種至含復(fù)方魚腥草的平板，每株細(xì)菌、每一藥物濃度各做 3個(gè)重復(fù)點(diǎn)，同時(shí)設(shè)定以細(xì)菌接種無(wú)藥物的 MH平板作為細(xì)菌陽(yáng)性對(duì)照和未接種細(xì)菌的陰性對(duì)照板。將平板置于 35 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 結(jié)果檢測(cè) (1)微量稀釋法：結(jié)果判定：培養(yǎng)>18 h后，將肉眼觀察無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)(培養(yǎng)孔中上清清澈，沉淀中僅見藥物沉渣)的培養(yǎng)孔中的藥物濃度作為相應(yīng)菌株的最低抑菌濃度。(2)瓊脂稀釋法：培養(yǎng)18 h后，肉眼觀察平板上細(xì)菌生長(zhǎng)情況，記錄各株細(xì)菌在不同濃度的藥物平板上的生長(zhǎng)情況。以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為該菌對(duì)應(yīng)的MIC值。

2 結(jié)果

2.1 微量肉湯稀釋法

培養(yǎng)18 h后觀察：各株鮑曼不動(dòng)桿菌的陽(yáng)性對(duì)照孔皆有細(xì)菌生長(zhǎng)，空白對(duì)照孔和不加細(xì)菌的陰性對(duì)照孔均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，提示該實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可信。每株細(xì)菌在含有不同濃度藥物的MH肉湯中生長(zhǎng)均受到影響，隨復(fù)方魚腥草濃度的增加，細(xì)菌生長(zhǎng)形成的濁度逐漸降低，所有菌株的最高藥物濃度孔(6 400 μg/mL)中上清清澈，沉淀中僅見藥物沉渣，部分菌株的3 200 μg/mL孔也未見細(xì)菌生長(zhǎng)，即微量肉湯稀釋法的MIC值為3 200～6 400 μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606的MIC值為3 200 μg/mL。

2.2 瓊脂稀釋法檢測(cè)

肉眼觀察見未加藥物的陽(yáng)性板上皆有菌落形成，而未接種細(xì)菌的陰性板上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。6 400 μg/mL藥物平板上皆無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。3 200～800 μg/mL的藥物平板上有部分菌株生長(zhǎng)，余各濃度的藥物平板上皆有細(xì)菌生長(zhǎng)。即MIC值為3 200～800 μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606的MIC值亦為3 200 μg/mL。

3 討論

多重耐藥菌(包括鮑曼不動(dòng)桿菌)已經(jīng)嚴(yán)重影響患者的安全和醫(yī)院質(zhì)量管理。《中國(guó)鮑曼部分桿菌感染診治與防控專家共識(shí)》[7]中指出由于鮑曼不動(dòng)桿菌具有快速獲得和傳播耐藥性的能力，多重耐藥、廣泛耐藥、全耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌已呈世界性流行，不僅是我國(guó)最重要的“超級(jí)細(xì)菌”，更是全球抗感染領(lǐng)域的挑戰(zhàn)。許多國(guó)家均采取一定的措施來(lái)抗耐藥菌感染[8]。新藥的研發(fā)遠(yuǎn)遠(yuǎn)趕不上細(xì)菌耐藥的步伐，而中藥抗感染的歷史悠久，不易產(chǎn)生耐藥性，而且不少中藥還具有逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥等優(yōu)點(diǎn)[9-10]，從現(xiàn)有的中藥中尋找藥物可能為臨床上抗抗鮑曼不動(dòng)桿菌感染的提供新的思路。

復(fù)方魚腥草片含有魚腥草、黃芩、板藍(lán)根、連翹和金銀花等，均為中草藥中常見的抗感染治療藥物。劉如玉等[11]采用煮沸法分別對(duì)幾味中藥進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)這幾味中藥對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、陰溝腸桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌等均有不同程度的抑制作用。葉冠龍等[12]采用黃芩、連翹等的水煎劑也能體外抑制鮑曼不動(dòng)桿菌的生長(zhǎng)。復(fù)方魚腥草片對(duì)急性咽炎、扁桃體炎等療效顯著，可能與其中的藥物具有抗菌作用有關(guān)。本研究通過(guò)在21株鮑曼不動(dòng)桿菌(包括標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606)中重復(fù) 3次后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：復(fù)方魚腥草片對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的生長(zhǎng)具有抑制作用；選取的20株鮑曼不動(dòng)桿菌中含2株敏感株，18株多重耐藥株，敏感株和耐藥株的生長(zhǎng)皆受到復(fù)方魚腥草的影響，耐藥株和敏感株的MIC值間無(wú)差別。蘇顯中等[13]分析了鮑曼不桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606的耐藥性和耐藥基因，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)鏈霉素、諾氟沙星、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素和氨芐西林等均有很高的耐藥性，有多種耐藥機(jī)制參與其耐藥。復(fù)方魚腥草對(duì)ATCC19606也有一定的抗菌作用。鮑曼不動(dòng)桿菌可通過(guò)產(chǎn)生抗菌藥物滅活酶、改變藥物作用靶位、減少到作用靶位的藥物量等方式對(duì)現(xiàn)有的抗生素產(chǎn)生耐藥性，而本實(shí)驗(yàn)中所有耐藥菌株的生長(zhǎng)被復(fù)方魚腥草抑制，說(shuō)明鮑曼不動(dòng)桿菌的這些耐藥機(jī)制對(duì)復(fù)方魚腥草無(wú)影響。提示復(fù)方魚腥草可作為抗鮑曼不動(dòng)桿菌(即使是多重耐藥菌株)感染的潛在藥物。但其具體作用機(jī)制及其與現(xiàn)有抗生素之間的協(xié)同作用尚待進(jìn)一步研究。

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