從水通道蛋白3介導(dǎo)的結(jié)腸水液代謝思考治療慢性便秘的藥物研究

占煜，陳泰宇，唐詩宇，劉芳，孔鵬飛，覃勤，唐學(xué)貴

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610072；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肛腸科，四川 南充 637000；3.川北醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，四川 南充 637000)

1 慢性便秘

1.1 慢性便秘的分類

便秘是常見的腸道癥狀，表現(xiàn)為排便次數(shù)減少，糞便干硬和(或)排便困難，病程在6個(gè)月以上稱為慢性便秘(chronic constipation，CC)。CC的病因包括功能性、器質(zhì)性疾病和藥物等。功能性便秘(functional constipation，F(xiàn)C)病理生理機(jī)制未完全闡明，可能與結(jié)腸傳輸和排便障礙有關(guān)，目前主張將其分為慢傳輸型、排便障礙型(出口梗阻型)、混合型、正常傳輸型，其中混合型兼見慢傳輸型和排便障礙型的證據(jù)，正常傳輸型便秘多見于便秘型腸易激綜合征(constipation-predominant irritable bowel syndrome，IBS-C)[1]。

1.2 慢性便秘治療現(xiàn)狀

CC尚無特異療法，在調(diào)整生活方式的基礎(chǔ)上，結(jié)合藥物通便、生物反饋、外科手術(shù)等治療手段緩解癥狀，恢復(fù)正常腸道動力以及排便功能為主要治療目的。生物反饋對以排便障礙為主的CC患者療效較好，可持續(xù)改善便秘癥狀、心理狀況和生活質(zhì)量[2-3]，但目前在國內(nèi)應(yīng)用有限。需外科手術(shù)的CC患者僅占少數(shù)，其他療法如順行灌洗、骶神經(jīng)(電)刺激等還有待進(jìn)一步研究。

藥物治療常作為主要或唯一治療措施出現(xiàn)，具有重要地位。治療便秘的藥物很多，但多數(shù)不適于CC患者，亦不適宜長期應(yīng)用，加之濫用瀉藥的現(xiàn)象普遍存在而造成不少醫(yī)源性便秘，使得安全和長期有效對于藥物治療CC顯得尤為重要。

治療CC的藥物分為：容積性瀉藥、刺激性瀉藥、滲透性瀉藥、潤滑緩瀉藥、促動力藥等。Lindberg等[3]認(rèn)為，選用通便藥應(yīng)根據(jù)循證醫(yī)學(xué)證據(jù)、安全性和藥物依賴性等。鹽類瀉藥大量使用可引起電解質(zhì)紊亂，不適于老年人和腎功能減退者久用；長期使用刺激性瀉藥可能導(dǎo)致不可逆的腸神經(jīng)損害[4]，且容易產(chǎn)生依賴性，加重便秘癥狀，甚至引起結(jié)腸黑變?。?-HT4受體激動劑作為胃腸促動力藥的一大類別，部分制劑如替加色羅和西沙必利選擇性較低，可導(dǎo)致嚴(yán)重心血管事件，國內(nèi)外已停止用于治療便秘。多項(xiàng)調(diào)查顯示CC患者不滿意現(xiàn)有的藥物治療，因排便費(fèi)力等伴隨癥狀未能改善[5-6]?？梢?，亟需研發(fā)新型通便藥以補(bǔ)充現(xiàn)有藥物治療。

2 結(jié)腸水液代謝與慢性便秘

CC發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能與腸神經(jīng)或腸神經(jīng)遞質(zhì)異常、Cajal間質(zhì)細(xì)胞異常、盆底功能障礙等有關(guān)。近年來，隨著對消化道黏膜通道蛋白的研究深入，從腸道生理功能到各種病理改變均有了新的認(rèn)識。

大多學(xué)者認(rèn)為，腸道對水分的轉(zhuǎn)運(yùn)，包括吸收和分泌兩方面，吸收功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)主要是腸上皮絨毛，與其毗鄰的腸隱窩則負(fù)責(zé)分泌[7]；小腸是吸收和分泌的主要場所，結(jié)腸正常狀態(tài)下不參與分泌，主要是吸收水分并向直腸推進(jìn)脫水后的糞便，一般每日約有1.5 L的液體從小腸進(jìn)入結(jié)腸，而最終排出的糞便含水0.2～0.4 L，若水分被過度吸收，可導(dǎo)致大便干結(jié)。結(jié)腸的分泌功能是由結(jié)腸隱窩細(xì)胞上Cl-通道調(diào)控，Cl-通道處于靜息狀態(tài)以保證對水和電解質(zhì)的凈吸收，而該類通道的異?？梢鸨忝鼗蛘吒篂a[8-9]?；贑l-通道對腸道分泌的調(diào)控作用，已出現(xiàn)以該類通道為靶點(diǎn)的藥物，可刺激腸液分泌而促進(jìn)排便，代表藥物有魯比前列酮(Lubiprostone)和利那洛肽(Linaclotide)，均在治療CC患者的臨床試驗(yàn)中顯示出良好療效及安全性，且在恢復(fù)自主排便和提高生活質(zhì)量等方面具有優(yōu)勢[10-11]。此類腸道促分泌劑通過直接或間接激活細(xì)胞膜上的Cl-通道，使腸上皮細(xì)胞分泌Cl-，水和電解質(zhì)伴隨進(jìn)入腸腔。據(jù)此，筆者及課題組成員思考是否能直接調(diào)節(jié)結(jié)腸水傳輸進(jìn)而對CC產(chǎn)生治療作用。

在胃腸道黏膜上皮細(xì)胞中，還存在另一類非常重要的通道蛋白——水通道蛋白(aquaporin，AQP)。研究證實(shí)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞質(zhì)膜上存在大量AQPs，并對水跨細(xì)胞運(yùn)輸起著不可忽視的作用，在腸道吸收和分泌、藥物通便等水液代謝中扮演樞紐角色[12]。

3 水通道蛋白

3.1 水通道蛋白介導(dǎo)水運(yùn)輸

AQPs是一類具有特異孔道結(jié)構(gòu)的跨膜蛋白，也稱水孔蛋白，主要介導(dǎo)水分子和甘油分子的通透。迄今哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的AQP家族有13個(gè)亞型(AQP0-AQP12)，人體中主要分布于腎、腦、眼、消化道、腺體等組織和器官。

AQPs對水分子具有高度選擇性，大部分AQPs嚴(yán)格排斥除水分子以外的其他物質(zhì)通過，尤其是質(zhì)子和離子，這一特性對膜電位平衡以及細(xì)胞內(nèi)PH穩(wěn)定十分關(guān)鍵。Kosinska等[13]采用超高分辨率技術(shù)揭示了水分子跨膜的整個(gè)運(yùn)輸過程，氫鍵形成、天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(Asn-Pro-Ala，NPA)-標(biāo)記序列以及由水分子形成的選擇性過濾器可阻止質(zhì)子隨水分子通過細(xì)胞膜。

AQPs的發(fā)現(xiàn)為研究水跨膜運(yùn)輸?shù)姆肿訖C(jī)制提供了新視角。研究表明許多生理病理過程均有AQPs參與，而干預(yù)AQPs功能與表達(dá)的制劑無疑對相關(guān)疾病具有潛在應(yīng)用前景。位于腎集合管的AQP2受血管加壓素(arginine vasopressin，AVP)影響而參與調(diào)節(jié)尿液濃縮，并與腎性尿崩癥的發(fā)生有關(guān)[14]；AQP4大量分布于腦星形膠質(zhì)細(xì)胞上，是調(diào)節(jié)大腦水平衡的重要蛋白，在腦水腫形成及消退中扮演關(guān)鍵角色[15]。某些其他疾病，如白內(nèi)障、原發(fā)性干燥綜合征、充血性心力衰竭等亦可見AQPs所介導(dǎo)水液代謝的異常。AQP3主要在腸道、腎臟和皮膚中表達(dá)，涉及一系列生理功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。最近，多項(xiàng)研究提示AQP3在結(jié)腸水液代謝中的關(guān)鍵作用。

3.2 水通道蛋白3參與結(jié)腸吸收、分泌功能

通常認(rèn)為腸道內(nèi)水分吸收屬于被動運(yùn)輸，以NaCl為主的各種溶質(zhì)主動吸收所產(chǎn)生的滲透壓梯度是吸收水的動力，且主要通過細(xì)胞間連接實(shí)現(xiàn)。腸上皮水運(yùn)輸有兩種途徑：細(xì)胞旁路和跨細(xì)胞通路，跨細(xì)胞通路又包括自由擴(kuò)散、共同轉(zhuǎn)運(yùn)和AQPs通道三種方式，而結(jié)腸黏膜的電阻明顯高于小腸，細(xì)胞旁路透水性較差，故跨細(xì)胞通路尤其是AQPs通道的重要性被越來越多的學(xué)者關(guān)注和認(rèn)可。

研究顯示，正常大鼠結(jié)腸中的AQPs主要是AQP3，大量分布于結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的頂部和底側(cè)部質(zhì)膜上，其次為AQP1和AQP4，AQP1位于淋巴和血管周圍，AQP4見于黏膜下層，AQP2和AQP8則很少[16-18]。另外，大鼠結(jié)腸AQP3的這一分布情況與人十分相似[19]。從AQPs分布情況可推測，AQP3與上皮細(xì)胞吸收、分泌功能密切相關(guān)。汞(Hg)是AQPs的特異性阻斷劑(除AQP4外)，可能有兩種機(jī)制阻止水的通透：一是單純堵塞孔道[20]，二是使ar/R區(qū)域構(gòu)象改變導(dǎo)致孔道坍塌[21]。生理情況下，腸腔內(nèi)滲透壓遠(yuǎn)低于血管內(nèi)滲透壓，水由腸腔進(jìn)入血管即形成腸道對內(nèi)容物的脫水作用。1.5 mM(1.5×10-3mol/L)HgCl2不改變大鼠腸腔滲透壓、AQP3表達(dá)水平及分布等因素，而使糞便含水量上升約3倍，提示Hg2+通過阻斷AQP3使水分留于腸腔而導(dǎo)致腹瀉[16]，從側(cè)面說明AQP3對結(jié)腸吸收水分的影響。敲除AQP3的Caco-2細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞旁路的透水性增強(qiáng)，這可能是跨細(xì)胞通路水運(yùn)輸減少的緣故[22]。

如前文所述，結(jié)腸分泌主要由Cl-通道調(diào)控，如囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)。雖然尚無直接證據(jù)闡釋AQP3或其他AQPs在Cl-通道介導(dǎo)結(jié)腸分泌中的作用，但有研究顯示CFTR與AQP3可能存在某種合作機(jī)制[23]，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 水通道蛋白3在藥物通便中的作用

AQPs通道介導(dǎo)的運(yùn)輸同離子通道均屬于被動運(yùn)輸，其運(yùn)輸方向由膜兩側(cè)的電化學(xué)梯度所決定。對于不帶電的水分子來說，滲透壓是決定其運(yùn)輸方向的唯一因素，另一方面，高滲刺激也可上調(diào)AQPs的mRNA表達(dá)和蛋白水平[24]，故一般認(rèn)為滲透壓是掌控水分子通透 AQPs的主要因素，亦是藥物調(diào)節(jié)水液代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來，隨著多種離子和激素對結(jié)腸AQP3的調(diào)控得到證實(shí)，許多通便藥的分子機(jī)制有了新的闡釋。

鹽類瀉藥MgSO4通過升高腸腔內(nèi)滲透壓，阻止結(jié)腸對水分的吸收，使腸內(nèi)容物增大而刺激腸蠕動，產(chǎn)生迅速且劇烈的導(dǎo)瀉作用。研究顯示，給予大鼠MgSO4溶液2 h時(shí)結(jié)腸內(nèi)滲透壓達(dá)到最高，但此時(shí)腹瀉并不明顯，至4～8 h期間才觀察到嚴(yán)重腹瀉。AQP3蛋白水平的變化曲線能很好解釋這一現(xiàn)象：2 h滲透壓最高時(shí)，AQP3表達(dá)較少，不能滿足水運(yùn)輸?shù)男枨螅?～8 h滲透壓較2 h下降，但由于AQP3表達(dá)增加使大量的水從血管運(yùn)輸至腸腔[17]。所以MgSO4致瀉的關(guān)鍵環(huán)節(jié)可能不是升高滲透壓，而是上調(diào)AQP3表達(dá)。近期研究發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度升高可激活A(yù)C-cAMP-PKA通路，觸發(fā)反應(yīng)元件(CREB)磷酸化，導(dǎo)致AQP3基因表達(dá)長期上調(diào)，為MgSO4導(dǎo)瀉機(jī)制之一[25]。然而MgSO4所產(chǎn)生的高滲狀態(tài)本身亦能刺激 AQP3上調(diào)，故滲透壓是否仍對后期水運(yùn)輸起了決定性作用？另一項(xiàng)研究似乎能夠說明問題。給予大鼠比沙可啶(促動力藥)5 h時(shí)腹瀉最強(qiáng)烈，此時(shí)滲透壓未發(fā)生顯著改變，AQP3蛋白水平約為空白對照組的20%；聯(lián)合MgSO4+比沙可啶5 h時(shí)可使腸腔內(nèi)滲透壓顯著升高， AQP3與單用比沙可啶相比無差異，其腹瀉程度幾乎等于單用比沙可啶[26]。上述結(jié)果提示：結(jié)腸內(nèi)水傳輸?shù)男矢Q于AQP3蛋白水平，而非滲透壓。另外，傳統(tǒng)認(rèn)為比沙可啶(bisacodyl)的通便機(jī)制是產(chǎn)生PGE2抑制Na-K-ATP酶活性，腸腔Na+和K+濃度上升使?jié)B透壓升高，導(dǎo)致水分進(jìn)入腸腔，但研究表明，比沙可啶是通過PGE2下調(diào)AQP3，阻礙結(jié)腸吸收水分而達(dá)到通便效應(yīng)[18]。

綜上，筆者及課題組成員認(rèn)為：①AQP3是結(jié)腸吸收水分的重要通道；②通過調(diào)控細(xì)胞膜上AQP3的表達(dá)數(shù)目，從而調(diào)節(jié)水運(yùn)輸?shù)男剩M(jìn)一步對結(jié)腸內(nèi)水液代謝產(chǎn)生影響，可能是眾多藥物通便的生物學(xué)基礎(chǔ)?；谏鲜鰞牲c(diǎn)，以AQP3作為潛在靶點(diǎn)治療CC具有較高研究價(jià)值。

4 以水通道蛋白3為潛在靶點(diǎn)展望中藥研究

有關(guān)膜運(yùn)輸?shù)鞍椎难芯吭缫殉蔀樯锘瘜W(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、藥理學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域中備受矚目的焦點(diǎn)，而由于膜運(yùn)輸?shù)鞍讓?xì)胞和機(jī)體生理功能的重要性，它們的激動劑或抑制劑已形成一個(gè)藥物大類，如胰島β細(xì)胞K+通道抑制劑用于治療2型糖尿病、Ca2+通道抑制劑用于治療高血壓等，開發(fā)更多、更特異地作用于組織細(xì)胞上轉(zhuǎn)運(yùn)體或通道的藥物，將有利于提高藥物療效及降低毒副作用[27]，其基礎(chǔ)是對各種轉(zhuǎn)運(yùn)體和通道的分布、序列、構(gòu)象、調(diào)控的更深入理解。

自1988年從人類紅細(xì)胞膜上偶然發(fā)現(xiàn)AQP1始，2003年Agre因其對AQP作出的突出貢獻(xiàn)而獲得諾貝爾化學(xué)獎，至今二十余年間該領(lǐng)域取得了大量研究成果并推動了科學(xué)技術(shù)發(fā)展進(jìn)步。盡管AQPs在動物與人體生理病理過程中的作用逐漸明了，以AQPs為靶點(diǎn)的制劑依然缺乏，目前已知的AQPs抑制劑，如汞、鎳、銅、金化合物及異丙酚等，都因其毒性或低選擇性而不能在體內(nèi)應(yīng)用。因此，發(fā)現(xiàn)特異性強(qiáng)的無毒或低毒化合物是此類藥物的研發(fā)方向。今后，在治療CC這一領(lǐng)域，以AQP3為潛在靶點(diǎn)，通過調(diào)控AQP3表達(dá)為主要作用機(jī)制的通便藥研究具有應(yīng)用前景，需要更多關(guān)于藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的深入研究，未來還有很長的路要走。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會胃腸動力學(xué)組，中華醫(yī)學(xué)會外科學(xué)分會結(jié)直腸肛門外科學(xué)組．中國慢性便秘診治指南(2013年，武漢)[J].中華消化雜志，2013，33(5)：291-297．

[2] Bove A，Bellini M，Battaglia E，et al.Consensus statement AIGO/SICCR diagnosis and treatment of chronic constipation and obstructed defecation(part II：treatment)[J].World Journal of Gastroenterology ：WJG，2012，18(36)：4994-5013.

[3] World Gastroenterology Organisation，Lindberg G，Hamid SS，et al.World gastroenterology organisation global guideline：Constipation——a global perspective[J].Journal of Clinical Gastroenterology，2011，45(6)：483-487.

[4] Nadal SR，Calore EE，Manzlone CR，et al.Effects of long-term administration of Senna occidentalis seeds in the large bowel of rats[J].Pathology，Research and Practice，2003，199(11)：733-737.

[5] Walda A，Scarpignato C，Mueller-lissner S，et al.A multinational survey of prevalence and patterns of laxative use among adults with self-defined constipation[J].Alimentary Pharmacology & Therapeutics，2008，28(7)：917-930.

[6] Johanson JF，Kralstein J.Chronic constipation：a survey of the patient perspective[J].Alimentary Pharmacology & Therapeutics，2007，25(5)：599-608.

[7] Thiagarajah JR，Verkman AS.CFTR inhibitors for treating diarrheal disease[J].Clinical Pharmacology and Therapeutics，2012，92(3)：287-290.

[8] Ikpa PT，Bijvelds MJ，De jonge HR.Cystic fibrosis：toward personalized therapies[J].The International Journal of Biochemistry & Cell B，2014，52：192-200.

[9] Kopic S，Geibel JP.Toxin mediated diarrhea in the 21 century：the pathophysiology of intestinal ion transport in the course of ETEC，V.cholerae and rotavirus infection[J].Toxins，2010，2(8)：2132-2157.

[10] Ford AC，Suares NC.Effect of laxatives and pharmacological therapies in chronic idiopathic constipation：systematic review and meta-analysis[J].Gut，2011，60(2)：209-218.

[11] Lembo AJ，Scheier H，Shiff SJ，et al.Two randomized trials of linaclotide for chronic constipation[J].The New England Journal of Medicine，2011，365(6)：527-536.

[12] Laforenza U.Water Channel proteins in the gastrointestinal tract[J].MOL Aspects MED，2012，33(5/6)：642-650.

[13] Kosinska EU，F(xiàn)ischer G，F(xiàn)riemann R，et al.Subangstrom resolution X-ray structure details aquaporin-water interactions[J].Science(New York，N.Y.)，2013，340(6138)：1346-1349.

[14] Armstrong SP，Seeber RM，Ayoub MA，et al.Characterization of three vasopressin receptor 2 variants：an apparent polymorphism(V266A)and two loss-of-function mutations(R181C and M311V)[J].PLOSONE，2013，8(6)：e65885.

[15] Fukuda AM，Badaut J.Aquaporin 4：a player in cerebral edema and neuroinflammation[J].Journal of Neuroinflammation，2012，9：279.

[16] Ikarashi N，Kon R，Iizasa T，et al.Inhibition of aquaporin-3 water Channel in the colon induces diarrhea[J].Biological & Pharmaceutical Bulletin，2012，35(6)：957-962.

[17] Ikarashi N，Ushiki T，Mochizuki T，et al.Effects of Magnesium sulphate administration on aquaporin 3 in rat gastrointestinal tract[J].Biological & Pharmaceutical Bulletin，2011，34(2)：238-242.

[18] Ikarashi N，Baba K，Ushiki T，et al.The laxative effect of bisacodyl is attributable to decreased aquaporin-3 expression in the colon induced by increased PGE2 secretion from macrophages[J].American Journal of Physiology.Gastrointestinal and Liver Physiology，2011，301(5)：887-895.

[19] Silberstein C，Kierbel A，Amodeo G，et al.Functional characterization and localization of AQP3 in the human colon[J].Brazilian Journal of Medical and Biological Research，1999，32(10)：1303-1313.

[20] Savage DF，Stroud RM.Structural basis of aquaporin inhibition by Mercury[J].Journal of Molecular Biology，2007，368(3)：607-617.

[21] Hirano Y，Okimoto N，Kadohira I，et al.Molecular mechanisms of how Mercury inhibits water permeation through aquaporin-1：understanding by molecular dynamics simulation[J].Biophysical Journal，2010，98(8)：1512-1519.

[22] Zhang W，Xu Y，Chen Z，et al.Knockdown of aquaporin 3 is involved in intestinal barrier integrity impairment[J].FEBS Letters，2011，585(19)：3113-3119.

[23] Jourdain P，Becq F，Lengacher S，et al.The human CFTR protein expressed in CHO cells activates aquaporin-3 in a cAMP-dependent pathway：study by digital holographic microscopy[J].Journal of Cell Science，2014，127(Pt 3)：546-556.

[24] Yang M，Gao F，Liu H，et al.Hyperosmotic induction of aquaporin expression in rat astrocytes through a different MAPK pathway[J].Journal of Cellular Biochemistry，2013，114(1)：111-119.

[25] Ikarashi N.The elucidation of the function and the expression control mechanism of aquaporin-3 in the colon[J].Yakugaku Zasshi ：Journal of the Pharmaceutical Society of Japan，2013，133(9)：955-961.

[26] Ikarashi N，Mimura A，Kon R，et al.The concomitant use of an osmotic laxative，Magnesium sulphate，and a stimulant laxative，bisacodyl，does not enhance the laxative effect[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences ：OFFI，2012，45(1-2)：73-78.

[27] Bagal SK，Brown AD，Cox PJ，et al.Ion channels as therapeutic targets：a drug discovery perspective[J].Journal of Medicinal Chemistry，2013，56(3)：593-624.