干細(xì)胞標(biāo)志分子在豬臍帶組織中的表達(dá)

余樹民，凌占業(yè),2，劉 丹，劉歡歡，夏 娟，沈留紅，曹隨忠，左之才，鄧俊良，任志華，馬曉平，王 婭，胡延春

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，環(huán)境公害與動(dòng)物疾病四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 雅安 625014；2 河南省黃泛區(qū)鑫欣牧業(yè)有限公司，河南 周口 466632)

Oct4、Nanog、Sox2、Rex-1是干細(xì)胞自我更新和多潛能性的關(guān)鍵調(diào)控因子[1-2]，常與胚胎階段特異性抗原(Stage-specific embryonic antigen,SSEA)SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4一起被用作鑒定胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ES)[3]、胚胎生殖細(xì)胞(Embryonic germ cells,EG)[4-5]等多潛能細(xì)胞的標(biāo)志分子。近年來，有許多關(guān)于上述標(biāo)志分子在不同組織器官來源的成體干細(xì)胞(Somatic stem cells,SSCs)中表達(dá)的研究報(bào)道，如性腺[6-7]、骨髓[8-9]、脂肪[8]、皮膚[8]、血液[10]、臍帶[11-16]等，因此許多學(xué)者將這些干細(xì)胞“干性”標(biāo)志分子用于評(píng)價(jià)成體干細(xì)胞的多潛能性。臍帶是妊娠時(shí)連接母體和胎兒的管狀器官。近年來的研究表明。臍帶是獲取胎兒干細(xì)胞的最適來源之一，利用臍帶分離干細(xì)胞具有來源豐富、不需要手術(shù)取樣和損傷小等優(yōu)點(diǎn)，且分離成功率可達(dá)100%，明顯優(yōu)于骨髓、臍血和脂肪[17-18]；臍帶來源細(xì)胞增殖能力旺盛，呈現(xiàn)堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)活性和高端粒酶活性，表達(dá)早期胚胎細(xì)胞標(biāo)志分子[11-16，18]。

豬不僅是一種與人類生活息息相關(guān)的重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，而且是人類異種器官移植的理想來源。多潛能干細(xì)胞是豬基因改造和組織器官發(fā)育研究的重要起始材料。已有研究顯示，以分化程度低的干細(xì)胞作為細(xì)胞核移植供核細(xì)胞能顯著提高重構(gòu)胚囊的胚形成率[19-20]。Carlin等[11]報(bào)道，豬臍帶來源細(xì)胞具有堿性磷酸酶和端粒酶活性，表達(dá)Oct4、Nanog和Sox2，體外培養(yǎng)可形成ES樣細(xì)胞集落?；诖耍驹囼?yàn)以豬臍帶為材料，從基因轉(zhuǎn)錄和蛋白水平研究SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、Oct4、Nanog、Sox2和Rex-1的表達(dá)，以期為豬臍帶的利用及其來源細(xì)胞在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中更好地發(fā)揮作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)材料 豬臍帶采自四川某規(guī)?；i場三元雜交(長白×大白×杜洛克)種豬足月分娩的仔豬，共采集臍帶20份；hES-18細(xì)胞RNA由西北農(nóng)林科技大學(xué)國家干細(xì)胞工程技術(shù)中心陜西分中心華進(jìn)聯(lián)教授惠贈(zèng)，作為試驗(yàn)陽性對(duì)照；Hela細(xì)胞由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)中心保存，作為試驗(yàn)陰性對(duì)照。

1.1.2 主要試劑 免疫組化用一抗為兔抗人Nanog和Sox2多克隆抗體，以及鼠抗人 Oct4、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4單克隆抗體等，免疫組化用二抗為通用羊抗兔和羊抗鼠抗體，以及顯色試劑盒等，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)用試劑焦碳酸二乙酯 (DEPC)、DNA Marker、RNA保存液、總RNA抽提試劑盒(Simple total RNA Kit)和PCR 2×Master Mix等，購自北京天根生化科技有限公司。PMD19-T Simple Vector、PrimeScript?RT reagent Kit等，購自大連寶生物工程有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 以GenBank收錄的基因Oct4(GenBank登錄號(hào)：DQ486513)、Nanog(GenBank登錄號(hào)：AY230262)、Sox-2(GenBank登錄號(hào)：Z31560)、Rex-1(GenBank登錄號(hào)：AF450454)和β-actin(GenBank登錄號(hào)：DM_001101.3)的cDNA序列為模板，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列和產(chǎn)物長度詳見表1。引物合成由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方 法

1.2.1 臍帶組織總RNA的抽提 將豬臍帶樣品用無RNA酶磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)漂洗去除血凝塊與污物，剪碎，用RNA凍存液-20 ℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)時(shí)，按RNA 抽提試劑盒說明書分別抽提臍帶組織和Hela細(xì)胞(陰性對(duì)照)的總RNA。

1.2.2 RT-PCR檢測分析和擴(kuò)增片段測序 按照PrimeScript?RT試劑盒說明書分別將各樣品總RNA(包括Hela細(xì)胞)及hES-18細(xì)胞RNA(陽性對(duì)照)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再取cDNA按下述反應(yīng)條件在PCR儀(型號(hào)MyCycler，美國BIO-RAD)上進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測各樣品中基因Oct4、Nanog、Sox2、Rex-1和β-actin的轉(zhuǎn)錄情況，以β-actin作為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)體積均為20 μL，包括2×PCR Master Mix 10 μL、樣品cDNA 2.0 μL、上下游引物各1.0 μL和雙蒸水6 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性35 s，按表1所示溫度退火35 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完畢，擴(kuò)增產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳(90 mV，30 min)，凝膠成像儀(型號(hào)GelDoc 2000，美國BIO-RAD)觀察并記錄電泳圖像。試驗(yàn)重復(fù)3次。利用Quantity One軟件將電泳圖像中各目的條帶的灰度值換算為具體數(shù)值，其與β-actin電泳條帶灰度值的比值即為目的基因在樣品中的mRNA相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為：目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量=目的基因條帶灰度值/β-actin基因條帶灰度值。

用DNA回收試劑盒分別回收臍帶組織基因Oct4、Nanog、Sox2、Rex-1的PCR擴(kuò)增片段，將其與測序載體PMD19-T連接，送華大基因有限責(zé)任公司測序。用Blasta軟件將測序結(jié)果分別與相應(yīng)基因的引物設(shè)計(jì)模板(見1.1.3)進(jìn)行同源比對(duì)。

表1 檢測基因的引物序列、退火溫度和產(chǎn)物長度

1.2.3 臍帶組織的免疫組化分析 將豬臍帶樣品浸入40 mL/L多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)常規(guī)沖洗、脫水、透明化、石蠟包埋、切片、烘片等程序制作組織切片，備用。部分切片經(jīng)蘇木精/伊紅(HE)染色，觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，其中細(xì)胞核會(huì)被染成藍(lán)色，胞漿染為紅色。

免疫組化染色用于鑒定干細(xì)胞標(biāo)志分子Oct4、Nanog、Sox2、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4蛋白抗原在臍帶組織中的表達(dá)。Oct4、Nanog和Sox2作為一抗進(jìn)行免疫組化染色時(shí)，需對(duì)組織切片進(jìn)行抗原修復(fù)，其余操作與SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4作為一抗的試驗(yàn)操作相同，均按SP免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作，即將切片或經(jīng)抗原修復(fù)的切片用雙氧水處理，然后分別與一抗孵育，4 ℃過夜，清洗，再根據(jù)所用一抗加入羊抗兔或羊抗鼠二抗孵育，清洗后滴加顯色試劑DAB顯色，漂洗后脫水透明，于顯微鏡下觀察照相，組織切片背景為微黃色或無色，反差強(qiáng)而能辨認(rèn)即進(jìn)行判定，切片中呈棕褐色、棕黃色、棕紅色的為陽性細(xì)胞，說明該細(xì)胞表達(dá)一抗對(duì)應(yīng)的蛋白抗原。其中，Oct4、Nanog和Sox2為核蛋白抗原，SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4為胞漿或膜抗原，免疫組化染色切片未進(jìn)行復(fù)染。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)”表示，用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬臍帶組織中干細(xì)胞“干性”調(diào)控關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因的RT-PCR

RT-PCR結(jié)果顯示，從20份臍帶樣品中均擴(kuò)增出干細(xì)胞“干性”調(diào)控關(guān)鍵基因Oct4、Nanog、Sox2和Rex1(部分樣品擴(kuò)增結(jié)果見圖1)的目的條帶；用同一引物和相同的PCR擴(kuò)增條件也顯示，陽性對(duì)照hES-18細(xì)胞強(qiáng)陽性表達(dá)基因Oct4、Nanog、Sox2和Rex1，陰性對(duì)照Hela細(xì)胞不表達(dá)這4個(gè)基因(見圖1)；將臍帶組織基因Oct4、Nanog、Sox2和Rex1的PCR擴(kuò)增片段分別回收并進(jìn)行測序，顯示各基因擴(kuò)增片段序列與其模板(GenBank登錄號(hào)分別為NR_002304、NM_024865、NM_003106和NM_174900)的同源性分別為98%，99%，100%和98%。該結(jié)果說明，本試驗(yàn)所用引物及反應(yīng)條件特異擴(kuò)增了各個(gè)目的基因，豬臍帶組織轉(zhuǎn)錄表達(dá)干細(xì)胞“干性”調(diào)控關(guān)鍵基因Oct4、Nanog、Sox2和Rex1。

由表2可知，NanogmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于Oct4 mRNA、Sox2 mRNA和Rex1 mRNA，而Oct4 mRNA、Sox2 mRNA和Rex1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量無顯著性差異。

圖1 豬臍帶部分樣品中Oct4、Nanog、Sox2和Rex1基因表達(dá)的RT-PCR電泳結(jié)果

表2 豬臍帶組織中基因Oct4、Nanog、Sox2和Rex1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

2.2 豬臍帶組織中胚胎干細(xì)胞標(biāo)志分子表達(dá)的免疫組化分析

以O(shè)ct4、Nanog、Sox2、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4為一抗的免疫組化分析結(jié)果如圖2所示，試驗(yàn)?zāi)殠悠返慕y(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。由圖2和表3可知，75%以上豬臍帶樣品陽性表達(dá)Oct4、Nanog、Sox2、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4蛋白抗原，陽性細(xì)胞不同程度地被染成棕褐色、棕紅色或棕黃色；Nanog呈陽性染色的樣品數(shù)量明顯較Oct4、Sox2、SSEA-1多，但在組織切片上其著色強(qiáng)度明顯較后三者弱，而Sox2、SSEA-1的著色程度明顯強(qiáng)于Oct4、Nanog、SSEA-3和SSEA-4。圖2還顯示，陽性細(xì)胞主要分布于臨近血管的華通氏膠區(qū)域，細(xì)胞多為橢圓形和圓形，多數(shù)單個(gè)散在，也有少數(shù)成簇聚集。組織切片H/E染色結(jié)果(圖2)顯示，血管周圍及華通氏膠區(qū)域分布較多單個(gè)散在的小細(xì)胞，這類細(xì)胞呈蘇木精深染。

圖2 豬臍帶組織HE染色及其免疫組化分析

表3 多潛能細(xì)胞標(biāo)志分子在豬臍帶組織中表達(dá)的免疫組化檢測(n=20)

3 討 論

盡管有報(bào)道指出，臍帶源原代細(xì)胞能形成ES樣細(xì)胞集落，但傳代后均呈纖維樣細(xì)胞形態(tài)[12-13]。而目前從臍帶分離的主要是間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSC)，雖已有一些關(guān)于臍帶來源細(xì)胞表達(dá)ES細(xì)胞標(biāo)志分子的研究報(bào)道，但其結(jié)果并不完全一致。在人上，Jo等[12]和Fong等[13-14]分別報(bào)道臍帶源MSC表達(dá)Oct4、Nanog、Sox2、SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81，但關(guān)于SSEA-1、SSEA-3表達(dá)的結(jié)果卻不盡一致；Carlin等[11]、Lee等[16]分別報(bào)道豬和犬的臍帶基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Nanog、Oct4、Sox2，其中犬臍帶基質(zhì)細(xì)胞還表達(dá)SSEA-4。Hoynowski等[15]報(bào)道，馬臍帶基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Oct4、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60、c-Kit、CD133和C-myc。綜觀以上研究，其均以體外培養(yǎng)的細(xì)胞為材料，而不同培養(yǎng)條件會(huì)使基因表達(dá)呈現(xiàn)不同的特點(diǎn)[21-22]，所以體外培養(yǎng)的細(xì)胞不一定能真實(shí)反映臍帶組織的基因表達(dá)狀況。本試驗(yàn)中，RT-PCR和免疫組化分析結(jié)果顯示，豬臍帶組織在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平均表達(dá)Oct4、Nanog、Sox2，同時(shí)也轉(zhuǎn)錄表達(dá)Rex-1 mRNA，結(jié)果與Carlin等[11]、Jo等[12]、Fong等[13-14]和Lee等[16]的結(jié)果一致；免疫組化分析結(jié)果還顯示，豬臍帶組織表達(dá)SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4抗原，與Jo等[12]、Fong等[13-14]、Hoynowski等[15]以及Lee等[16]的結(jié)果部分一致，SSEA表達(dá)特點(diǎn)與Tsung等[23]報(bào)道的豬胚胎生殖細(xì)胞一致，提示臍帶可能存留有未分化原始生殖細(xì)胞。本試驗(yàn)中，豬臍帶組織切片的H/E染色結(jié)果顯示，臨近血管的華通氏膠區(qū)域分布有較多體積小且以胞核著色為主的細(xì)胞，但目前還未見從臍帶獲得類ES細(xì)胞或EG細(xì)胞的報(bào)道；另外，臍帶來源MSC所表現(xiàn)的早期未分化干細(xì)胞特點(diǎn)是其本身所為，還是因?yàn)槠渲泻卸酀撃苄栽缙谂咛ゼ?xì)胞，或者含有最近報(bào)道的極小胚胎樣干細(xì)胞(Very small embryo-like cells, VSEL)[24]，尚需要進(jìn)一步研究。

有研究指出，Oct4并不是SSCs自我更新和多能性維持所必需的轉(zhuǎn)錄因子[9，25]，Nanog是人MSC多潛能調(diào)控因子[9]。Arnold等[26]指出，Sox2是早期胚胎、胎兒和出生后個(gè)體等不同發(fā)育階段各類型干細(xì)胞或未成熟前體細(xì)胞共同表達(dá)的標(biāo)志分子，是機(jī)體各種干細(xì)胞/前體細(xì)胞自我更新和保持分化潛能所必需的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不管是基因轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白水平，Sox-2均呈現(xiàn)高表達(dá)，根據(jù)Arnold等[26]的結(jié)果推斷，這可能與臍帶再生有關(guān)；另外，筆者注意到Oct4 mRNA表達(dá)量與Sox-2 mRNA差異不顯著，但免疫組化分析結(jié)果顯示其呈弱表達(dá)，這一差異可能與部分Oct4 mRNA無翻譯功能有關(guān)，或者是Oct4表達(dá)假基因的結(jié)果，因?yàn)橛袌?bào)道指出，在很多情況下Oct4存在假基因表達(dá)的現(xiàn)象[27]。

本研究在mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上證實(shí)，多潛能性細(xì)胞標(biāo)志分子Oct4、Nanog、Sox2、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4在豬臍帶組織中表達(dá)，SSEA表達(dá)特點(diǎn)與豬胚胎生殖細(xì)胞一致，提示豬臍帶組織中可能含有早期未分化的多潛能細(xì)胞。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Boyer L A,Lee T I,Cole M F,et al.Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells [J].Cell,2005,122(6):947-956.

[2] Boiani M,Sch?ler H R.Regulatory networks in embryo-derived pluripotent stem cells [J].Nat Rev Mol Cell Biol,2005,6(11):872-884.

[3] Ginis I,Luo Y,Miura T,et al.Differences between human and mouse embryonic stem cells [J].Dev Biol,2004,269(2):360-380.

[4] Shamblott M J,Axelman J,Wang S,et al.Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells [J].Proc Natl Acad Sci,1998,95(23):13726-13731.

[5] Leitch H G,Blair K,Mansfield W,et al.Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state [J].Development,2010,137(14):2279-2287.

[6] Conrad S,Renninger M,Hennenlotter J,et al.Generation of pluripotent stem cells from adult human testis [J].Nature,2008,456(7220):344-349.

[7] Parte S,Bhartiya D,Telang J,et al.Detection,characterization,and spontaneous differentiationinvitroof very small embryonic-like putative stem cells in adult mammalian ovary [J].Stem Cells Dev,2011,20(8):1451-1464.

[8] Riekstina U,Cakstina I,Parfejevs V,et al.Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow,adipose tissue,heart and dermis [J].Stem Cell Rev,2009,5(4):378-386.

[9] Pierantozzi E,Gava B,Manini I,et al.Pluripotency regulators in human mesenchymal stem cells:Expression of NANOG but not of OCT-4 and SOX-2 [J].Stem Cells Dev,2011,20(5):915-923.

[10] Cesselli D,Beltrami A P,Rigo S,et al.Multipotent progenitor cells are present in human peripheral blood [J].Circ Res,2009,104 (10):1225-1234.

[11] Carlin R,Davis D,Weiss M,et al.Expression of early transcription factors Oct-4,Sox-2 and Nanog by porcine umbilical cord (PUC) matrix cells [J].Reprod Biol Endocrinol,2006,4:5-13.

[12] Jo C H,Kim O S,Park E Y,et al.Fetal mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord sustain primitive characteristics during extensive expansion [J].Cell Tissue Res,2008,334(3):423-433.

[13] Fong C Y,Richards M,Manasi N,et al.Comparative growth behaviour and characterization of stem cells from human Wharton’s jelly [J].Reprod Biomed Online,2007,15(6):708-718.

[14] Fong C Y,Chak L L,Biswas A,et al.Human Wharton’s jelly stem cells have unique transcriptome profiles compared to human embryonic stem cells and other mesenchymal stem cells [J].Stem Cell and Rep,2011,7:1-16.

[15] Hoynowski S M,Fry M M,Gardner B M,et al.Characterization and differentiation of equine umbilical cord-derived matrix cells [J].Biochem Biophys Res Commun,2007,362(2):347-353.

[16] Lee K S,Nah J J,Lee B C,et al.Maintenance and characterization of multipotent mesenchymal stem cells isolated from canine umbilical cord matrix by collagenase digestion [J].Res Vet Sci,2013,94 (1):144-151.

[17] Secco M,Zucconi E,Vieira N M,et al.Multipotent stem cells from umbilical cord:Cord is richer than blood [J].Stem Cells,2008,26:146-150.

[18] Troyer D L,Weiss M L.Wharton’s jelly-derived cells are a primitive stromal cell population [J].Stem Cells,2008,26(3):591-599.

[19] Zhu H,Craig J A,Dyce P W,et al.Embryos derived from porcine skin-derived stem cells exhibit enhanced preimplantation development [J].Biol Reprod,2004,71:1890-1897.

[20] Bosch P,Pratt S L,Stice S L.Isolation,characterization,gene modification and nuclear transfer reprogramming of porcine mesenchymal stem cells [J].Biol Reprod,2006,74:46-57.

[21] Kues W A,Petersen B,Mysegades W,et al.Isolation of murine and porcine fetal stem cells from somatic tissue [J].Biol Reprod,2005,72(4):1020-1028.

[22] Pochampally R R,Smith J R,Ylostalo J,et al.Serum deprivation of human marrow stromal cells (hMSCs) selects for a subpopulation of early progenitor cells with enhanced expression of OCT-4 and other embryonic genes [J].Blood,2004,103(5):1647-1652.

[23] Tsung H C,Du Z W,Rui R,et al.The culture and establishment of embryonic germ (EG) cell lines from Chinese mini swine [J].Cell Res,2003,13(3):195-202.

[24] Kucia M,Halasa M,Wysmzyrmki M,et al.Morphological and molecular characterization of noval population of CXCR4+,SSEA4+,Oct4+very small embryonic-like ceils purified from human cord blood:Preliminary report [J].Leukemia,2007,21(2):297-303.

[25] Lengner C J,Camargo F D,Hochedlinger K,et al.Oct4 expression is not required for mouse somatic stem cell self-renewal [J].Cell Stem Cell,2007,1(4):403-415.

[26] Arnold K,Sarkar A,Yram M A,et al.Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice [J].Cell Stem Cell,2011,9(4):317-329.

[27] Suo G,Han J,Wang X,et al.Oct4 pseudogenes are transcribed in cancers [J].Biochem Biophys Res Commun,2005,337(4):1047-1051.