新型細胞死亡顯像劑18F-FPDuramycin的自動化合成

要少波 胡孔珍 唐剛?cè)A 梁 祥 姜申德

1（天津大學(xué) 藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 天津 300072）

2（中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科 廣州 510080）

PET技術(shù)在臨床研究中可用于神經(jīng)退行性疾病和腫瘤化療治療水平的評估，多數(shù)化療藥物通過誘發(fā)腫瘤細胞死亡（凋亡和壞死）發(fā)揮藥效[1]。細胞凋亡過程中伴隨著多種生理和生化過程[2?3]。因此，越來越多的人開始關(guān)注這種基于細胞生理生化變化而檢測細胞凋亡的無創(chuàng)傷分子影像技術(shù)[4?5]。

耐久霉素(duramycin)是一段含有 19個氨基酸的多肽，可與位于凋亡細胞外翻內(nèi)膜上的磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)高選擇性地結(jié)合[6?7]。4-nitrophenyl 2-[18F]fluoropropionate (18FNFP)可作為輔助側(cè)鏈來標記小分子多肽[8?9]。因此，我們對18F-NFP標記耐久霉素進行了研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Cyclone 10/5（比利時IBA公司），PET-MF-2V-IT-I型氟-18多功能合成模塊（北京派特生物有限公司）。氨基聚醚 Kryptofix 2.2.2(K.222)，2-溴丙酸乙酯，無水乙腈(MeCN, 99.9%)，三氟乙酸(TFA)，二（對硝基苯）碳酸酯(NPC)，耐久霉素(duramycin)，二甲基亞砜(DMSO)，二異丙基乙基胺(DIPEA)(美國Sigma-Aldrich公司)。

Sep-Pak light QMA柱、Sep-Pak plus C18柱、Oasis HLB柱(美國Waters公司)。QMA柱的預(yù)處理是依次用 NaHCO3（8.4%水溶液）和水沖洗；C18和HLB柱的預(yù)處理是依次用乙醇和水沖洗。

1.2 高效液相色譜(HPLC)

在 PET-MF-2V-IT-I合成模塊中配備了半制備高效液相色譜(High performance liquid chromatography, HPLC)，半制備HPLC配有反向C18柱(10mm×250 mm；5 mm)、UV 檢測器（Alltech 201，UV吸收波長為254 nm）和放射性檢測器（北京派特生物有限公司），流動相為乙腈/水（55/45，V/V，含有 0.1% TFA），流速為4 mL·min?1。

分析型高效液相色譜1200系列（美國Agilent公司）；紫外檢測器（Agilent interface 35900E，UV吸收波長為254 nm），放射性檢測器（美國Bioscan公司），放射性活度計 CRC-25PET（美國 Capintec公司），色譜柱 XDB-C18 (4.6 mm×150 mm，5 mm)。流動相為梯度：0 min，乙腈/水（2/98，V/V，含有0.1% TFA）；8 min，乙腈/水（10/90，V/V，含有0.1% TFA）；20 min，乙腈/水（20/80，V/V，含有0.1% TFA），流速為 1 mL·min?1。

1.3 自動化合成18F-NFP

18F-NFP是一種多用途的輔助基團，常用來標記小分子氨基酸和多肽等帶有裸露氨基結(jié)構(gòu)的化合物，在PET-MF-2V-IT-I合成模塊上合成的流程示意圖(圖1)，18F-NFP的合成共需要三步反應(yīng)(圖2)和兩個反應(yīng)瓶，合成模塊中各原料瓶和試劑瓶中試劑的布置(表 1)。

圖1 18F-FPDuramycin在PET-MF-2V-I合成模塊上自動化合成的流程圖Fig.1 Schematic diagram of the automated synthesis of 18F-FPDuramycin on the PET-MF-2V-I synthesis module.

表1 放化合成18F-FPDuramycin所需的試劑分別置于PET-MF-2V-I合成模塊的不同原料瓶中Table 1 Reagents for the radiosynthesis of 18F-FPDuramycin on the PET-MF-2V-I synthesizer.

圖2 18F-NFP和18F-FPDuramycin 的合成路線Fig.2 Synthetic route of 18F-NFP and 18F-FPDuramycin.

回旋加速器(比利時IBA公司)通過18O(p, n)18F核反應(yīng)生產(chǎn)得到18F負離子，經(jīng)過QMA柱俘獲后用K.222 (1.0 mL, Vial B1)溶液淋洗到反應(yīng)瓶1中；通氮氣(100 mL·min?1)并在 116 °C 加熱條件下將液體蒸發(fā)至干燥；加入無水乙腈(1.5 mL, Vial B2)，通氮氣并加熱至116 °C，使殘留的水和乙腈共沸以再次除水；將2-溴丙酸乙酯(5 mg, 28mmol)的乙腈溶液(Vial B3)加入至含有活性[18F]KF/K.222的反應(yīng)管1中，在封閉的反應(yīng)管中加熱至 100 °C并保持10min，我們得到了 2-18F-丙酸乙酯；將 0.2 mol·L?1KOH水溶液(Vial B4)加入至反應(yīng)管1中，密閉下加熱至100 °C并保持10 min，得到2-18F-丙酸鈉鹽，通氮氣并加熱至100 °C將液體蒸干，得到了淡黃色的固體粘附于反應(yīng)瓶底；加入NPC(40 mg, 130 mmol)的乙腈溶液(Vial B5)，密閉下加熱至 100 °C保持10min；冷卻反應(yīng)管至室溫，向反應(yīng)瓶中加入5%醋酸水溶液(Vial B6)淬滅反應(yīng)，充分混勻；將混合溶液轉(zhuǎn)移至瓶B0中，并用半制備HPLC中分離，洗脫條件如方法1中所述；根據(jù)18F-NFP放射峰的出峰位置收集流動相于(Vial B10)，瓶中含有0.1% TFA水溶液40 mL，將18F-NFP吸附于HLB柱上；吸附完成后用水1 mL (Vial B11)洗HLB柱；此時的HLB柱通氮氣(80 mL·min?1)吹干，用無水乙醚(Vial B12)將18F-NFP從HLB柱上洗下，溶有18F-NFP的乙醚溶液通過硫酸鈉柱干燥，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)瓶 2；干燥的乙醚溶液在室溫下用氮氣吹干，這樣我們便得到了高放化純度的18F-NFP。

1.4 18F-NFP與耐久霉素的偶聯(lián)反應(yīng)

將耐久霉素(300 mg)、DMSO(200 mL)和 DIPEA(40 mL)的混合溶液(Vial B7)加入至含有18F-NFP的反應(yīng)瓶2中，50 oC加熱反應(yīng)8 min，用5%醋酸水溶液(10 mL, Vial B8)淬滅反應(yīng)并稀釋反應(yīng)液；將該反應(yīng)溶液通過C18柱，使18F-FPDuramycin(圖2[10])吸附于C18柱上；將吸附于C18柱上的產(chǎn)物用乙醇(2 mL, Vial B9)淋洗，加熱至70 oC用氮氣將乙醇吹干，將18F-FPDuramycin與注射用生理鹽水配比，并通過無菌 Millipore濾膜(0.22 mm,4 mm)過濾除菌，將溶液導(dǎo)入至無菌瓶(10 mL)備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 放化合成

使用PET-MF-2V-IT-I合成模塊，以2-溴丙酸乙酯為原料，依次經(jīng)過親核氟化、水解和取代三步反應(yīng)合成了氟標側(cè)鏈18F-NFP，反應(yīng)完后用5%醋酸水溶液淬滅，半制備HPLC分離(圖3)，氟離子保留時間為220 s，收集產(chǎn)品18F-NFP從760 s開始出峰，880 s結(jié)束，接收此范圍的HPLC洗脫液并用大量0.1% TFA水溶液稀釋后吸附于HLB柱上，乙醚淋洗即可得到高化學(xué)和放化純度(99%)中間體18F-NFP。

圖3 半制備HPLC分離18F-NFP的放射峰圖譜Fig.3 Semi-preparative of HPLC radioactive chromatogram for purification of 18F-NFP.

隨后，將所得18F-NFP在DMSO溶液中DIPEA為縛酸劑，與耐久霉素50 °C下反應(yīng)8 min，用分析HPLC檢測其溶液(圖4)。反應(yīng)液中的各成分經(jīng)分析HPLC 檢測，18F 離子(RT=3.1 min)，2-18F-丙酸(RT=4.2 min)，18F-FPDuramycin (RT=16.5 min)，由于18F-NFP很活潑并且容易在加熱條件下水解，反應(yīng)溶液中副產(chǎn)物較多。之后用酸將反應(yīng)液淬滅后稀釋掛C18柱，并用大量水洗，乙醇洗脫后的溶液再用HPLC分析，出峰位置靠前的18F離子和2-18F-丙酸放射峰已消失，因其極性較大故水溶性較好，很容易被水洗去。

圖4 分析HPLC放射圖譜(a) 反應(yīng)液中的放射吸收圖譜, (b) 經(jīng)C18柱純化后的放射吸收圖譜Fig.4 HPLC analysis of radioactive chromatogram.(a) Reaction mixture, (b) Purified 18F-FPDuramycin

對于18F-NFP和duramycin的反應(yīng)中用到的溶劑和縛酸劑篩選，采用正交試驗分析了幾種不同溶劑(圖5)：乙腈(MeCN)、二甲基亞砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)；且嘗試了兩種堿：三乙胺(TEA)和二異丙基乙基胺(DIPEA)。結(jié)果顯示，在 DMSO溶劑中的反應(yīng)收率最高，并且使用DIPEA作為縛酸劑的總體效果比三乙胺好，最終選擇了 DMSODIPEA體系作為18F-NFP和duramycin的反應(yīng)體系，并以較高和較穩(wěn)定的收率得到終產(chǎn)物。

圖5 影響18F-NFP與duramycin反應(yīng)收率的因素Fig.5 Influence factors to the yield of reaction.

對18F-NFP和duramycin的反應(yīng)時間，我們也做了詳細的研究，從圖6中可以看出，反應(yīng)收率在起始階段(2?6 min)處于急速上升期，并于8 min時達到最大值，之后便處于平緩階段，說明此時已反應(yīng)完。于是我們選擇反應(yīng)到8 min時加入醋酸水溶液將反應(yīng)淬滅進行后處理。

圖6 反應(yīng)時間對18F-NFP與duramycin反應(yīng)收率的影響Fig.6 Relationship between time and yield to the reaction.

該反應(yīng)過程中需要注意幾點，制備得到的18F-NFP吸附于HLB柱上后需要通氮氣充分吹干；并且用乙醚洗脫至反應(yīng)瓶2中，反應(yīng)瓶溫度保持在室溫，隨后加熱吹干，溫度不超過40 oC，18F-NFP非?；顫?，較高的溫度會導(dǎo)致18F-NFP水解為2-18F丙酸，甚至發(fā)生脫氟現(xiàn)象，以致產(chǎn)率降低。18F-NFP與耐久霉素的反應(yīng)中生成了18F離子和2-18F-丙酸，主要由于反應(yīng)原料中的含水量所致，18F-NFP在加熱條件下很快水解，因此反應(yīng)前要把原料duramycin用烘箱40 °C中烘干1 h，過高的溫度有可能導(dǎo)致多肽的分解變質(zhì)，經(jīng)干燥后，18F-NFP和 duramycin反應(yīng)中的水解產(chǎn)物少了很多。

本方法以18F離子為起始原料，整體合成過程共需120 min，未經(jīng)衰變矯正的放化收率為(10±5)%(n=8)，終產(chǎn)物18F-FPDuramycin的放化純度大于99%，比活度(23.7±13.7) GBq·mmol?1(n=10)，該方法為全自動化合成方法，合成過程中無需打開箱體進行操作，可以進行放大量的合成反應(yīng)。

2.2 質(zhì)量控制

注射液目測觀察為澄清、透明并且無顆粒狀物質(zhì)；pH值的檢測是使用pH值2.0?9.0的精密pH試紙來檢測，pH值在6.5?7.5；放射性核素純度是通過檢測注射液的半衰期，與已知的18F離子（半衰期為 110 min）作對比而得出結(jié)論，經(jīng)檢測其半衰期為(109.5±0.3) min (n=5)；將溫度保持在 25 °C 左右，將合成得到的FPDuramycin標準品與帶有放射性的產(chǎn)品混合后一同用HPLC分析（方法2），通過比較保留時間而確定化合物的結(jié)構(gòu)(圖7)。同時還檢測了其放化和化學(xué)純度，放化純度高于99%，保留時間 RT=16.5 min(圖 7(a))；化學(xué)純度大于 98%，HPLC檢測保留時間RT=16.9 min(圖7(b))。

圖7 將18F-FPDuramycin注射液和標準品FPDuramycin混合后進行HPLC分析，所得的放射性圖譜(a)和紫外吸收圖譜(b)Fig.7 HPLC radioactive (a) and ultraviolet (b) chromatograms of the purified 18F-FPDuramycin solution co-injected with the standard (FPDuramycin).

穩(wěn)定性實驗中，將18F-FPDuramycin注射溶液置于室溫保存2 h，用HPLC檢測分析（方法2），其放化純度依然高于95%，顯示出了很好的穩(wěn)定性。毒性試驗主要依據(jù)中國藥典規(guī)定進行檢測，其檢測方法參見文獻[11]，經(jīng)尾靜脈注射18F-FPDuramycin(0.5 mL)的小鼠在48 h之內(nèi)，生長健康，無不良反應(yīng)和死亡現(xiàn)象，經(jīng)解剖后各器官未發(fā)現(xiàn)損傷。表明該放化藥物毒性較低，有望在動物以及人體PET顯像中應(yīng)用。

3 結(jié)語

本實驗設(shè)計了潛在的細胞死亡顯像劑18F-FPDuramycin，并成功對其進行了自動化標記合成研究，為18F-FPDuramycin自動化合成提供了較實用的合成工藝，有望進一步在動物實驗及人體PET顯像中得到應(yīng)用。但是，18F-FPDuramycin作為潛在的細胞死亡顯像劑用于細胞凋亡/細胞死亡相關(guān)疾病檢測以及腫瘤放化療治療效果監(jiān)測，仍有待研究。

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