硫酸香茅醛顯色法測定莪術(shù)油微囊載藥量與包封率

吳繼龍，張立華，陳歡，楊麗娜，代英輝，王東，劉東春，b※

(1．沈陽藥科大學(xué)a．中藥學(xué)院；b．中韓分子生藥學(xué)研究室，沈陽110016；2．大連華立金港藥業(yè)有限公司，遼寧大連116100)

中藥莪術(shù)是姜科植物廣西莪術(shù)(CurcumakwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang)、蓬莪術(shù)(C.phaeocaulisVal.)或溫郁金(C.wenyujinY.H.Chen et C.Ling)的干燥根莖。中醫(yī)理論認(rèn)為，莪術(shù)性溫，味辛、苦。有行氣破血、消積止疼之功效。莪術(shù)油為莪術(shù)中提取的揮發(fā)油，含有多種倍半萜類化合物，其中，主要有欖香烯、莪術(shù)醇、莪術(shù)酮、莪術(shù)二酮等，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等作用[1]。莪術(shù)油容易氧化和揮散，莪術(shù)油微囊化后可防止其揮散并降低氧化速度，提高穩(wěn)定性。將新型的包衣材料聚乙烯醇·丙烯酸·甲基丙烯酸甲酯共聚物(Povacoat)加入麥芽糊精中作為囊材，采用噴霧干燥法研究制備了一種莪術(shù)油微囊，可以提高藥物的包封率和微囊的穩(wěn)定性。為了評價莪術(shù)油/(麥芽糊精-Povacoat)微囊的質(zhì)量，本試驗研究開發(fā)了一種簡單方便的莪術(shù)油微囊載藥量及包封率的測定方法。

1 儀器與試劑

ZNCL-BS智能數(shù)顯磁力加熱板(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；T18 basic分散機(IKA公司)；L-117實驗室微型噴霧干燥機(北京來亨科學(xué)儀器公司)；電子分析天平ESJ182-4(沈陽龍騰電子有限公司)；CT14RD冷凍離心機(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；紫外-可見分光光度計UV-1700(日本島津公司)；Olympus Bx51(日本奧林巴斯有限公司)。

莪術(shù)油(大連華立金港藥業(yè)有限公司)；麥芽糊精(上海運宏化工制劑輔料技術(shù)有限公司)；Povacoat(F型，日本大同化工業(yè)株式會社)；香茅醛(AR級，天津市博迪化工有限公司)；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 莪術(shù)油微囊的制備

麥芽糊精與水溶性新型輔料Povacoat F型作為水相囊材，莪術(shù)油及少量磷脂為油相，高速分散混合均勻后經(jīng)噴霧干燥，即得微囊?？瞻孜⒛业闹苽溥^程中不加入莪術(shù)油，其余方法同上。

2.2 莪術(shù)油微囊載藥量的測定

2.2.1顯色機制及分光光度法測定波長的選擇莪術(shù)油中的倍半萜類化合物可以與香茅醛硫酸試液產(chǎn)生多種鮮艷的顏色反應(yīng)，靈敏度高，檢測限為12ng，此法常用于莪術(shù)油的定性及定量檢查[2]。

測定波長的選擇：精密移取一定濃度莪術(shù)油乙醇溶液1.0mL，置于10mL容量瓶中，加入新制備的0.2%香茅醛硫酸溶液(稱取香茅醛0.2g于100mL容量瓶中，加1.0mL無水乙醇使其溶解，加入冷硫酸溶液(1+2)至刻度，搖勻即得)定容至刻度。將上述溶液搖勻，室溫下避光保存30min后于400～800nm波長范圍內(nèi)掃描測定吸光度，結(jié)果顯示，莪術(shù)油乙醇溶液經(jīng)香茅醛硫酸顯色后在508nm處有一最大吸收峰，而空白微囊經(jīng)超聲振蕩破囊后的提取液經(jīng)香茅醛硫酸顯色后在508nm處無干擾，見圖1。

a.莪術(shù)油；b.空白微囊 a.Zedoary turmeric oil;b.Microcapsule without drug

2.2.2顯色穩(wěn)定性精密配制一定濃度的莪術(shù)油乙醇溶液(18.7μg/mL)，精密移取1.0mL置于10mL容量瓶中，按“2.2.1”項下方法顯色后，于508nm處每隔30min測定吸光度值。結(jié)果顯示，在150min內(nèi)吸光度值穩(wěn)定，結(jié)果見表1。

表1顯色穩(wěn)定性

Table 1 Results of color stability test (n=6)

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取49.8mg莪術(shù)油置于25mL容量瓶中，以無水乙醇定容至刻度，得莪術(shù)油儲備液。精密移取上述儲備液5.0mL，置于50mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，即得工作液(199.2μg/mL)。精密移取工作液10μL、50μL、100μL、200μL、300μL、400μL、500μL分別置于10mL容量瓶中，另取1.0mL無水乙醇于10mL容量瓶中作為空白對照液。將上述溶液以0.2%香茅醛硫酸溶液定容至刻度，搖勻，室溫下避光保存30min，于508nm處測定吸光度[3，4]。以濃度C為橫軸、吸光度A為縱軸作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用最小二乘法計算得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=0.094 7C-0.001 2，r=0.999 3，線性范圍為0.199 2μg/mL～9.960 0μg/mL。

2.2.4精密度試驗精密稱取30mg微囊，置于50mL帶蓋離心管中，精密加入蒸餾水2.0mL，旋緊密封蓋后超聲振蕩20min，精密加入18.0mL無水乙醇，精密稱定離心管重量，渦旋混勻，超聲提取15min后精密稱定離心管重量，補加乙醇至原來重量，然后在4 000r/min下離心6min，精密移取上清液各1.0mL分別置于6個10mL容量瓶中，按“2.2.1”項下方法顯色后，于508nm處測定吸光度。RSD為0.5%，結(jié)果顯示方法的精密度良好。

2.2.5載藥量測定回收率試驗精密移取莪術(shù)油標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，加于約30mg空白微囊中，其余步驟按“2.2.4”項下的方法操作，于508nm處測定吸光度，記錄吸光度值，按公式：回收率=實測量/加入量×100%，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2載藥量測定加樣回收率實驗結(jié)果(n=6)

Table2Resultsofrecoverytestofdrugloadingcapacity

加入量(μg)Added實測量(μg)Measured回收率(%)Recovery平均回收(%)AveragerecoveryRSD(%)15301547101.11530152199.41530150198.199.61.51530151599.015301557101.81530150398.3

2.2.6莪術(shù)油微囊載藥量的測定結(jié)果精密稱取30mg微囊，其余步驟按“2.2.4”項下的方法操作，于508nm處測定吸光度，記錄吸光度值[5～7]，并按公式：載藥量=微囊中揮發(fā)油的總質(zhì)量/微囊的質(zhì)量，計算莪術(shù)油載藥量。結(jié)果見表3。

表3載藥量測定結(jié)果

Table 3 Results of drug loading (n=3)

2.3 莪術(shù)油微囊包封率的測定

2.3.1洗脫液的選擇分別選用無水乙醇、乙醚、石油醚作為洗脫液，對同一批微囊進(jìn)行玻璃小柱洗脫。精密稱取100mg微囊，填裝到玻璃小柱中，分別用上述3種洗脫液洗脫，收集洗脫液50mL。分別吸取上清液1.0mL置于10mL容量瓶中，以香茅醛硫酸溶液定容。結(jié)果顯示，石油醚洗脫液不能與顯色劑互溶，有分層現(xiàn)象；乙醚作為洗脫液極易揮發(fā)，容易造成較大誤差；無水乙醇作為洗脫液有較好的流速，且顯微觀察結(jié)果表明微囊浸泡于無水乙醇30min后未發(fā)現(xiàn)破囊(圖2)，因此選擇無水乙醇作為洗脫液。

2.3.2洗脫液用量的確定精密稱取100mg莪術(shù)油微囊置于上述玻璃小柱中，用無水乙醇洗脫，以5.0mL作為1個流份，分別收集。每組流份各移取1.0mL，分別置于不同的10mL容量瓶中，按“2.2.1”項下方法顯色后，記錄508nm處吸光度值，并計算累積莪術(shù)油未包封藥量。結(jié)果顯示(圖3)，洗脫液用量達(dá)到40mL時基本可將微囊壁外殘留藥物洗脫完全，最終確定洗脫液用量為50mL。

圖2 莪術(shù)油微囊浸泡于無水乙醇30min

圖3 洗脫體積的確定

2.3.3包封率測定回收率試驗精密稱取100mg空白微囊置于自制的玻璃小柱，精密加入莪術(shù)油標(biāo)準(zhǔn)溶液，以無水乙醇洗脫，收集洗脫液50mL。精密移取洗脫液1.0mL置于10mL容量瓶中，按“2.2.1”項下方法顯色后，于508nm處測定吸光度，

記錄吸光度值，按公式：回收率=實測量/加入量×100%，計算回收率，結(jié)果見表4。

2.3.4包封率的測定結(jié)果精密稱取100mg微囊置于自制的玻璃小柱，其余步驟按“2.3.3”項下方法操作，于508nm處測定吸光度，并計算未包封的莪術(shù)

表4包封率測定加樣回收率實驗結(jié)果(n=6)

Table4Resultsofrecoverytestofencapsulationefficiency

加入量(μg)Added實測量(μg)Measured回收率(%)Recovery平均回收(%)AveragerecoveryRSD(%)516.2521.8101.1516.2497.496.4516.2512.299.299.12.9516.2499.696.8516.2502.197.3516.2534.9103.6

油量，每批樣品重復(fù)測定3次。包封率=(載藥量-未包封藥量)/載藥量×100%[6]。3批莪術(shù)油微囊未包封藥量及包封率測定結(jié)果見表5。

表5包封率測定結(jié)果(n=3)

Table 5 Encapsulation efficiency of microcapsules

3 討論

準(zhǔn)確測定莪術(shù)油微囊包封率的關(guān)鍵在于能否準(zhǔn)確對微囊表面未包封莪術(shù)油進(jìn)行定量。有文獻(xiàn)報道類似的其它含揮發(fā)油微囊包封率測定方法，有采用洗滌-離心法[8，9]及烘干稱重法[10]清洗微囊表面的揮發(fā)油后定量。但通過我們研究發(fā)現(xiàn)振蕩及離心易造成囊壁破損；烘干時微囊內(nèi)部揮發(fā)油容易散失，造成結(jié)果不準(zhǔn)確。采用柱洗脫法可避免微囊受到較強外力而破裂。莪術(shù)油易溶于無水乙醇，本研究的微囊囊材中麥芽糊精及Povacoat均不溶于無水乙醇，處方中磷脂可以溶于無水乙醇，有造成微囊在乙醇中破裂、泄露的可能，但研究顯示，此微囊在無水乙醇中30min內(nèi)無破囊現(xiàn)象發(fā)生，原因可能為處方中磷脂含量不高，且基本上和莪術(shù)油一起被包裹在微囊內(nèi)，并沒有大量存在于囊膜中。同時，包封率測定實驗中較高的回收率也表明，短時間內(nèi)此微囊的藥物透過性也沒有發(fā)生改變。所以本研究選用無水乙醇洗脫微囊表面莪術(shù)油。

4 結(jié)論

本研究建立的莪術(shù)油/(麥芽糊精-Povacoat)微囊載藥量及包封率測定方法簡便易行、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為以麥芽糊精-Povacoat作為復(fù)合囊材的莪術(shù)油微囊質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。

[1]李國棟,許付,沈愛軍.莪術(shù)油的研究進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志，2002，37(11):806-809.

[2]田樹革,劉從.香茅醛在中藥材定性定量分析中的應(yīng)用[J].新疆師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2006,25(4):38-41.

[3]于麗萍,龐樹和.用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定莪術(shù)油的含量[J].黑龍江醫(yī)藥,1997,10(3):143.

[4]李國棟,許付.自乳化莪術(shù)油軟膠囊中莪術(shù)油的含量測定研究[J].藥學(xué)實踐雜志,2002,20(4):240-242.

[5]游劍,于英偉,崔福德,等.莪術(shù)油微球的含量測定[J].中成藥,2005,27(1):25-28.

[6]譚龍飛,武偉,楊連生.噴霧干燥法制備肉桂醛微膠囊工藝條件的研究[J].華南師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2001,4(4):84-87.

[7]馮怡,沈嵐,徐德生,等.麥冬皂苷腸溶微球的載藥量和包封率研究[J].中成藥,2004,26(8):611-613.

[8]馮怡,張瑛,楊胤,等.影響陳皮揮發(fā)油微囊成囊因素的考察[J].中成藥,2007,29(2):202-208.

[9]馮怡,張瑛,楊胤,等.噴霧干燥法制備陳皮揮發(fā)油微囊的影響因素考察[J].中草藥,2007,38(10):1480-1484.

[10]張郁松,韓建軍.大蒜油噴霧干燥微膠囊工藝的研究[J].中國調(diào)味品,2011,36(5):57-59.