哺乳動(dòng)物細(xì)胞線粒體基因組的轉(zhuǎn)錄及調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

熊 偉，張海洋，楊紅娟，杜亞曼

（大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

線粒體是在各類(lèi)真核細(xì)胞中廣泛存在的由雙層膜包被的細(xì)胞器，直徑在0.5～10 μm左右。真核細(xì)胞各自擁有的線粒體在大小、數(shù)量及外觀等方面上都有所不同。線粒體擁有自身的遺傳物質(zhì)和遺傳體系，是一種重要的半自主性細(xì)胞器，在生物能量轉(zhuǎn)換和新陳代謝中處于中心地位，所以被稱為“細(xì)胞的動(dòng)力工廠”。細(xì)胞行使各種生命活動(dòng)所必需的能量，大約95%來(lái)源于線粒體氧化磷酸化過(guò)程產(chǎn)生的ATP。此外，線粒體也涉及細(xì)胞的其他重要功能，比如脂肪酸的代謝、細(xì)胞的程序性死亡、活性氧自由基的產(chǎn)生、三羧酸循環(huán)以及鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)等。存在于真核細(xì)胞線粒體內(nèi)的核外線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA），稱為線粒體基因組，線粒體的功能受核基因組和線粒體基因組的雙重控制。研究表明，哺乳動(dòng)物線粒體DNA以類(lèi)核的形式存在于線粒體基質(zhì)中，其拷貝數(shù)可以是一個(gè)或者多個(gè)，有獨(dú)立自主的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)〔1〕。其中哺乳動(dòng)物線粒體基因組的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控機(jī)制研究一直是醫(yī)學(xué)研究和生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，本文歸納和總結(jié)了近年來(lái)線粒體轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)因子的研究進(jìn)展。

1 哺乳動(dòng)物線粒體基因組的結(jié)構(gòu)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞mtDNA多為雙鏈、閉合環(huán)狀DNA分子。人mtDNA全長(zhǎng)有16596 bp，根據(jù)兩條鏈的G+T含量不同和變性氯化銫密度梯度離心分為重鏈（H鏈）和輕鏈（L鏈）。見(jiàn)圖1。線粒體基因組共編碼了2個(gè)rRNA，22個(gè)tRNA和13個(gè)氧化呼吸鏈蛋白亞基。其中，重鏈編碼的基因有2個(gè)rRNA（12s rRNA和16s rRNA），14個(gè)tRNA，2個(gè)ATP酶的亞基（ATPase 6和ATPase 8），3個(gè)細(xì)胞色素氧化酶亞基（COX I，COX II，COX III），細(xì)胞色素b亞基（cytb）和6個(gè)NADH脫氫酶亞基（ND1，ND2，ND3，ND4，ND4L，ND5），輕鏈編碼的基因有8個(gè)tRNA和1種蛋白（ND6）。哺乳動(dòng)物的mtDNA基因排列都十分緊密，基因之間沒(méi)有間隔，沒(méi)有內(nèi)含子，tRNAPhe基因和tRNAPro基因之間一段長(zhǎng)約1.1 kb的片段是僅有的非編碼區(qū)，稱為D-loop區(qū)，包括了H鏈復(fù)制起始位點(diǎn)（OH），L鏈轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子（LSP）和mtDNA轉(zhuǎn)錄所需的一些順式作用元件，如中央保守區(qū)序列（Central conserved sequence blocks domain，CSB），終止相關(guān)序列（Termination-associat?ed sequence，TAS），TFAM結(jié)合位點(diǎn)等〔2〕。

注：OrH和OrL表示重鏈和輕鏈復(fù)制起點(diǎn)，HSP和LSP表示重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子（箭頭表示方向），粗線區(qū)表示rRNA和編碼蛋白的基因，圓圈表示tRNA基因。方框表示MTERF結(jié)合位點(diǎn)。

2 哺乳動(dòng)物線粒體基因組的轉(zhuǎn)錄單元與調(diào)控機(jī)制

哺乳動(dòng)物mtDNA上一共有3個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，即2個(gè)H鏈轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（HSP1，HSP2）和1個(gè)L鏈轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（LSP）。HSP1位于tRNAPhe基因上游16 bp處，轉(zhuǎn)錄終止于16S rRNA基因的3′末端，編碼大量rRNA。HSP2位于12S rRNA基因5′末端附近，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一條幾乎覆蓋整條H鏈的多順?lè)醋觤RNA。位于D-loop區(qū)域的LSP，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一條完整的L鏈多順?lè)醋覴NA〔3〕。見(jiàn)圖2。

圖2 哺乳動(dòng)物線粒體基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式圖

哺乳動(dòng)物mtDNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程需要很多蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子的共同參與，目前研究初步確認(rèn)了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中組成mtDNA轉(zhuǎn)錄裝置的成員，主要包括線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，mtTFA or TFAM）、轉(zhuǎn)錄因子B（mitochondrial tran?scription factor B，mtTFB or TFBM）、線粒體RNA聚合酶（mitochondrial RNA polymerase，mtRPOL or POLRMT）以及線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子（mitochondrial transcription termination factors，MTERFs）等多種重要的轉(zhuǎn)錄因子。

2.1 線粒體RNA聚合酶（POLRMT or mtRPOL）線粒體RNA聚合酶屬于類(lèi)T7 RNA聚合酶家族，是線粒體中僅有的一種由核基因組編碼的RNA聚合酶〔4〕。線粒體RNA聚合酶最早在酵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)（稱為Rpo41），后來(lái)才在人類(lèi)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。酵母線粒體RNA聚合酶的大亞基和噬菌體的單體RNA聚合酶同源，而小亞基和細(xì)菌RNA聚合酶中決定轉(zhuǎn)錄起始的因子有關(guān)，因此真核細(xì)胞線粒體RNA聚合酶可以看作是介于最簡(jiǎn)單的噬菌體RNA聚合酶和具有中等復(fù)雜程度的細(xì)菌RNA聚合酶之間的復(fù)合體〔5〕。人類(lèi)POLMT基因定位于19p13.3，cDNA全長(zhǎng)3831 bp，其編碼的蛋白質(zhì)由1230個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，N端的41個(gè)氨基酸殘基為該蛋白定位線粒體的前導(dǎo)肽，C端則包含一系列的保守結(jié)構(gòu)域。進(jìn)入線粒體后，成熟的POLRMT由1189個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。POLRMT在細(xì)胞線粒體內(nèi)不能進(jìn)行特異的基因轉(zhuǎn)錄，需要在TFAM、TFB1M或TFB2M等轉(zhuǎn)錄因子的存在才能啟動(dòng)線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄〔6〕。Maniura-Weber等在體外重建線粒體DNA轉(zhuǎn)錄體系的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)〔7〕。

2.2 線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM or mtTFA） 線粒體轉(zhuǎn)錄因子A是最先發(fā)現(xiàn)的線粒體轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)因子，其在mtDNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、mtDNA類(lèi)核結(jié)構(gòu)的形成和mtDNA修復(fù)等方面都發(fā)揮著很重要的作用。TFAM以二聚體形式結(jié)合到線粒體基因組HSP和LSP特異序列上，通過(guò)線粒體RNA聚合酶的作用，在體內(nèi)和體外都能調(diào)節(jié)mtDNA重鏈基因和輕鏈基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)哺乳動(dòng)物TFAM基因結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，該基因定位于10q21，共有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。其中，根據(jù)序列長(zhǎng)度的不同，這6個(gè)內(nèi)含子被分為2組，I、III和VI號(hào)內(nèi)含子小于600 bp，而另外3個(gè)內(nèi)含子則均大于1.8 kb。人類(lèi)的TFAM是一個(gè)25 kDa大小的蛋白質(zhì)分子，屬于以彎曲、纏繞、伸展和結(jié)合為特征的高遷移蛋白家族（HMG box蛋白家族）的成員之一。它包含兩個(gè)由27個(gè)氨基酸殘基連接的HMG結(jié)構(gòu)域和一個(gè)由25個(gè)氨基酸殘基組成的C末端尾巴〔8〕。其中，C末端尾巴是TFAM特異性識(shí)別和結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)，對(duì)于線粒體DNA的特異性轉(zhuǎn)錄有非常重要的作用。Larsson等發(fā)現(xiàn)敲除TFAM基因的小鼠由于mtDNA損耗會(huì)導(dǎo)致胚胎致命性損傷，說(shuō)明TFAM對(duì)于維持mtDNA的完整性和細(xì)胞的生存是必須的〔9〕。最初的研究認(rèn)為，TFAM是一個(gè)小的堿性蛋白，能夠與HSP和LSP上游-12～-39 bp處的識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合〔10〕。但隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，mtDNA幾乎是被TFAM包繞起來(lái)的，TFAM對(duì)于mtDNA來(lái)說(shuō)是過(guò)量的〔11〕。Dairaghi等的體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)體系中的hTFAM終濃度達(dá)到0.7 nM時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)LSP特異性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并在hTFAM終濃度達(dá)到70 nM時(shí)轉(zhuǎn)錄效率最高，超過(guò)這一濃度逐漸下降，當(dāng)hTFAM終濃度達(dá)到7000 nM時(shí)，由LSP起始的轉(zhuǎn)錄幾乎完全被抑制〔12〕，可能是由于與TFAM結(jié)合得越多，mtDNA越難以接近其它的轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致降低轉(zhuǎn)錄的速度。細(xì)胞中TFAM的表達(dá)水平可能是依據(jù)不同細(xì)胞特定的代謝情況來(lái)調(diào)節(jié)mtDNA的包裝和轉(zhuǎn)錄活性，低濃度的hTFAM對(duì)線粒體H鏈和L鏈的轉(zhuǎn)錄有明顯的激活作用，但存在一個(gè)飽和值，hTFAM濃度過(guò)高反而會(huì)導(dǎo)致H鏈和L鏈的轉(zhuǎn)錄水平下降或完全被抑制，但在一般情況H鏈和L鏈TFAM的轉(zhuǎn)錄水平是接近的〔13〕。在體外研究中發(fā)現(xiàn)，TFAM表達(dá)水平的高低直接影響TFB1M/POLRMT以及TFB2M/POLRM的轉(zhuǎn)錄起始活性，二者之間存在著劑量效應(yīng)關(guān)系〔11〕。由核編碼的TFAM調(diào)節(jié)mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的精細(xì)機(jī)制尚未完全證實(shí)。另外，也有報(bào)道認(rèn)為T(mén)FAM還參與了哺乳動(dòng)物mtDNA的復(fù)制和損傷修復(fù)過(guò)程〔14〕。

2.3 線粒體轉(zhuǎn)錄因子B（TFBM or mtTFB） 線粒體轉(zhuǎn)錄因子B（TFBM）是在哺乳動(dòng)物線粒體裂解物中發(fā)現(xiàn)的一種與RNA甲基轉(zhuǎn)移酶同源的蛋白因子，它與釀酒酵母中的單體轉(zhuǎn)錄因子sc-TFB同源〔15〕。人類(lèi)TFBM有兩個(gè)亞型，分別命名為T(mén)FB1M和TFB2M，編碼它們的基因分別定位于6q25.1和1q44。通常，TFB1M的轉(zhuǎn)錄活性是TFB2M的1/10，研究發(fā)現(xiàn)，除了甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，TFB1M主要在線粒體中核糖體的生成和蛋白翻譯的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。人類(lèi)線粒體TFB1M可以使核糖體12S rRNA小亞基保守莖環(huán)的一系列腺嘌呤甲基化；深入研究發(fā)現(xiàn)，TFB1M是一種具有雙重功能的蛋白質(zhì)，既有轉(zhuǎn)錄因子的活性，也有rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性〔15〕。TFB2M可能在物種進(jìn)化的過(guò)程中丟失了甲基轉(zhuǎn)移酶的功能而成為一個(gè)更加高效的轉(zhuǎn)錄因子。Adán等在黑腹果蠅Schneider細(xì)胞中采用RNAi的方法下調(diào)了TFB2M的水平，導(dǎo)致線粒體中RNA轉(zhuǎn)錄本的豐度下降了2～8倍〔16〕。然而，用同樣的技術(shù)沉默TFB1M基因后線粒體中RNA轉(zhuǎn)錄本沒(méi)有明顯變化，卻導(dǎo)致線粒體中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平顯著下降，這一現(xiàn)象提示TFB1M可能在翻譯調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，TFB2M則是真核生物中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子〔17〕。

體外模擬人mtDNA轉(zhuǎn)錄體系的研究發(fā)現(xiàn)，TFB2M的轉(zhuǎn)錄活化效率要比TFB1M至少高兩個(gè)數(shù)量級(jí)。TFB1M或TFB2M與POLRMT可以直接形成一種異源二聚體，隨著TFB2M的增加，轉(zhuǎn)錄速率加快，而且還發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)TFBM轉(zhuǎn)錄因子都能夠通過(guò)TFAM羧基末端尾巴發(fā)生蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。當(dāng)mtTFB2M與mtRNA pol的比例達(dá)到1:1時(shí)，轉(zhuǎn)錄速率達(dá)到最大〔18〕。

線粒體DNA轉(zhuǎn)錄的起始很可能是這樣一個(gè)過(guò)程：TFAM特異性的結(jié)合到HSP和LSP上游的識(shí)別位點(diǎn)，由于TFBM也能與TFAM的C-末端親和接觸，從而把TFBM-mtRPOL帶到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，通過(guò)蛋白-蛋白相互作用形成轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)復(fù)合體來(lái)提高轉(zhuǎn)錄起始的效率〔19〕。

2.4 線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子（MTERFs） 真核細(xì)胞線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子是一類(lèi)由核基因組編碼轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞線粒體，且能夠與mtDNA特異結(jié)合的單體蛋白，它們的分子量大小為40 kDa左右，在線粒體復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯中發(fā)揮調(diào)控作用〔20〕。到目前為止已經(jīng)鑒定出的動(dòng)物線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子有3種：果蠅的DmTTF、海膽的mtDBP、人類(lèi)的MTERF，它們都能夠與POLRMT結(jié)合，但與mtDNA結(jié)合的位點(diǎn)因不同物種而異〔20-21〕。人MTERF1基因定位于7q21，包含有兩個(gè)外顯子，其編碼的蛋白產(chǎn)物分子量為39 kDa。MTERF1在線粒體轉(zhuǎn)錄中起終止作用，其終止位點(diǎn)在16S rRNA和leucyl-tRNA基因聯(lián)結(jié)處。線粒體的轉(zhuǎn)錄終止因子MTERF1能結(jié)合雙向終止位點(diǎn)，促進(jìn)線粒體基因轉(zhuǎn)錄的終止。線粒體肌病腦病伴乳酸中毒及中風(fēng)樣發(fā)作綜合癥（MELAS）的A3243G點(diǎn)突變導(dǎo)致能解除16S rRNA轉(zhuǎn)錄終止，并且能減低MTERF1蛋白與線粒體DNA的親和力。研究結(jié)果提示，MTERF1蛋白與人類(lèi)線粒體疾病的產(chǎn)生存在著密切的聯(lián)系。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)中還存在一些與MTERF1序列高度同源的蛋白（MTERF2-F4），它們?cè)诰€粒體基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著不同的作用，所以將它們歸納為人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子蛋白家族〔20-22〕。利用PSI-BLAST的方法與美國(guó)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白質(zhì)序列比對(duì)顯示，MTERF蛋白家族成員普遍存在于植物與后生動(dòng)物中，但在真菌中尚未發(fā)現(xiàn)與其同源的蛋白質(zhì)〔22〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，在小鼠中敲除MTERF2后線粒體mRNA水平下降，氧化磷酸化水平也出現(xiàn)下降。因此推測(cè)MTERF2蛋白可能在mtDNA轉(zhuǎn)錄中起正調(diào)控作用〔23〕。2007年P(guān)ark等在Cell雜志上首次報(bào)道了哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)存在的一個(gè)負(fù)性調(diào)控mtDNA轉(zhuǎn)錄的因子——核基因組編碼的MTERF3蛋白，此蛋白為哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育所必需，敲除MTERF3蛋白的動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)mtDNA重鏈和輕鏈的轉(zhuǎn)錄起始活性都顯著增加。通過(guò)體內(nèi)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chro?matin immunoprecipitation，ChIP）研究顯示，MTERF3通過(guò)與mtDNA啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合來(lái)行使轉(zhuǎn)錄抑制作用〔24〕。可以預(yù)見(jiàn)的是，對(duì)MTERF蛋白家族各成員的深入研究將為人們進(jìn)一步闡明和理解mtDNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

3 問(wèn)題和展望

隨著近些年來(lái)人們對(duì)于哺乳動(dòng)物mtDNA轉(zhuǎn)錄及調(diào)控機(jī)制研究的不斷深入，迄今已經(jīng)初步明確了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中組成mtDNA基本轉(zhuǎn)錄裝置的元件，主要包括TFAM、TFB1M、TFB2M和POLRMT，以及MTERFs等多種調(diào)控蛋白，但對(duì)mtDNA在機(jī)體不同生理?xiàng)l件和病理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)錄和翻譯的分子調(diào)控機(jī)制（如線粒體基因與核基因的相互作用，組織特異性的調(diào)節(jié)機(jī)制、調(diào)控水平和程度等）以及線粒體內(nèi)核糖體生物發(fā)生過(guò)程等細(xì)節(jié)內(nèi)容并不十分清楚，有待于進(jìn)一步的研究探索。因此，人們?nèi)栽谂ふ抑碌木€粒體基因表達(dá)調(diào)控蛋白。對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞mtDNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程及調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步研究，不僅有助于深入闡明和理解線粒體基因組的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，而且也助于揭示臨床線粒體病（如Laber遺傳性視神經(jīng)病、Kearns－Sayre綜合征、MELAS、阿爾茨海默病、帕金森癥、線粒體糖尿病和母系遺傳性耳聾等）的發(fā)病機(jī)制，并為尋找新的線粒體基因治療的靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)〔25〕。

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