改良NADPH-d和AchE酶組織化學法診斷先天性巨結腸

朱利斌，張華，林進漢，戴麗娜，黃璜，李仲榮

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 小兒外科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

改良NADPH-d和AchE酶組織化學法診斷先天性巨結腸

朱利斌，張華，林進漢，戴麗娜，黃璜，李仲榮

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 小兒外科，浙江 溫州 325027）

目的：探討進一步改良后的還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黃遞酶（NADPH-d）和乙酰膽堿酯酶（AchE）酶組織化學染色法診斷先天性巨結腸（HD）的優(yōu)勢，以期提高HD術前及術中診斷的準確率。方法：取HD患兒術中切除的結腸標本18例，其中女7 例，男11例，平均年齡（8.6±3）月。標本分狹窄段、移行段、擴張段，其冰凍切片分別用改良的NADPH-d和AchE酶組織化學染色法進行染色，與常規(guī)HE染色進行比較，并用腸神經(jīng)元特異標記物β-III Tubulin（TUJ-1）行免疫熒光及蛋白基因產物9.5（protein gene product 9.5，PGP9.5）行免疫組化檢查論證改良方法的特異性。結果：NADPH-d法能快速確定擴張段近端切緣是否存在神經(jīng)節(jié)細胞，診斷HD的陽性率為94.4%（17/18）；AchE法對于HD狹窄段黏膜下異常增生的神經(jīng)叢診斷陽性率為88.9%（16/18）；兩組間診斷陽性率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。耗時方面NADPH-d法為（7.0±1.7）min，AchE法為（30.9±2.2）min，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。上述兩種改良方法與TUJ-1及PGP9.5對照結果一致。結論：NADPH-d法能快速確定腸管切緣是否有神經(jīng)節(jié)細胞分布，適用于術中快速診斷HD；AchE法適用于術前直腸黏膜層的活檢診斷。

先天性巨結腸；診斷；酶組織化學；結直腸外科手術

先天性巨結腸（Hirschsprung disease，HD）是由腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遷移異常導致的腸道疾病，病變段結腸運動功能障礙，由此患兒出現(xiàn)反復便秘、腹脹等癥狀，嚴重影響生存質量。該病的治療依賴于手術切除病變腸段，目前普遍行I期經(jīng)肛門拖出巨結腸根治術。根據(jù)術中組織活檢冰凍切片后HE染色來確定切緣是否存在腸神經(jīng)節(jié)細胞分布，但常規(guī)的HE染色對腸神經(jīng)節(jié)細胞的有效識別率不高，乙酰膽堿酯酶（AchE）法也存在反應時間過長而影響術中應用等問題?；诩韧难芯浚覀冞M一步改良了還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黃遞酶（NADPH-d）及AchE兩種酶組織化學染色法，發(fā)現(xiàn)NADPH-d法有一定優(yōu)勢，可供術中快速診斷HD，并確定腸管切除范圍，有實際應用價值。

1 材料和方法

1.1 標本來源標本均取自于2009年1月-2012年12月本院18例HD患兒巨結腸根治術術中切除的結腸，患兒男11例，女7例，年齡3～16個月，平均（8.6±3）月。標本分擴張段、移形段和狹窄段，腸管橫切面常規(guī)冰凍切片，片厚4μm，多聚賴氨酸載玻片貼片，制片后分批超低溫冰箱保存。隨機奇數(shù)切片做NADPH-d法快速染色，偶數(shù)切片做AchE法染色。所用標本經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準同意。

1.2 方法

1.2.1 改良NADPH-d酶組織化學反應：反應液由1 mL 0.1 mol/L PB液（pH 8.0）中加入0.5 mg NADPH-d（Sigma）、10μL二甲基亞砜（蘇州正興化工研究院）、0.6 mg NBT（Sigma）、3μL Triton X-100（北京拜爾迪生物公司）組成。反應液37 ℃提前預熱，滴加反應液后再置于37 ℃水浴箱中5～10 min，觀察反應液由澄黃色變?yōu)槲⒆仙笕〕?，光鏡下觀察神經(jīng)節(jié)細胞顯示清晰后PBS沖洗終止反應，伊紅襯染10 s，PBS沖洗，水性封片劑Clear mount封片，完全干燥后可用中性樹膠再次封片。

1.2.2 改良AchE酶組織化學反應：反應液由0.1 mol/L醋酸緩沖液（pH 5.8）6.5 mL，碘化乙酰硫代膽堿5 mg（Sigma），0.1 mol/L枸櫞酸鈉0.5 mL，5 mmol/L六氰基鐵酸鉀1 mL（Sigma），0.25 mol/ L硫酸銅溶液0.2 mL（Sigma）組成。反應液37 ℃預熱，置入切片完全浸入，光鏡下觀察到黏膜下增生紊亂的神經(jīng)叢后停止反應，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.3 HE染色方法：冰凍切片室溫下干燥，固定，PBS洗2 min，蘇木素染（37 ℃）1 min，PBS沖洗，95%乙醇5 s，伊紅染20～30 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.4 蛋白基因產物9.5（protein gene product 9.5，PGP9.5）免疫組織化學法：切片固定后加入封閉液1 h，兔抗人多克隆一抗PGP9.5（北京中杉），工作濃度1:200，置于4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗，加入相應二抗30 min，沖洗后DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.5 β-III Tubulin （TUJ-1）免疫熒光：NADPH-d法染色完成后采集圖像，PBS沖洗5 min，枸櫞酸高壓法抗原修復，室溫冷卻，PBS沖洗。光鏡下再觀察，原NADPH-d陽性細胞經(jīng)抗原修復后無變化，背景同未處理前一致。切片加入封閉液1 h，滴入鼠單克隆抗體TUJ-1（福州邁新生物）置4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗，加入FITC標記二抗，避光室溫1 h，熒光顯微鏡下觀察陽性結果，PBS沖洗，加Hoechst33258（Sigma）染核5 min，PBS沖洗，加入防熒光淬滅劑，不同波長下采集圖像，保存，Image Pro Plus 5.1軟件圖像重建分析。

1.2.6 觀察指標：擴張段、移行段的肌間神經(jīng)叢及黏膜下神經(jīng)叢著色情況、陽性神經(jīng)節(jié)細胞是否可輕易識別，與背景有無反差。狹窄段黏膜下神經(jīng)叢有無增生、紊亂。腸神經(jīng)元特異標記物TUJ-1及PGP9.5結果是否同NADPH-d及AchE法的結果一致。

1.3 統(tǒng)計學處理方法采用SPSS for windows 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。處理組間陽性率比較采用配對x2檢驗（校正），耗時比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 改良NADPH-d法擴張段近端切緣切片滴加反應液后5～10 min內肉眼即可觀察到反應液由澄黃變?yōu)榈仙捅剁R下可見環(huán)肌和縱肌之間豐富的神經(jīng)叢，呈串珠狀分布，環(huán)肌層內亦有大量陽性神經(jīng)纖維及少許體積較小的神經(jīng)節(jié)細胞分布（見圖1）。高倍鏡下見陽性神經(jīng)節(jié)細胞，胞核空白無著色，胞漿呈藍紫色（見圖2）。該法的組織切片背景單一，為無色半透明，經(jīng)伊紅襯染后，不僅陽性神經(jīng)叢更易辨認，環(huán)肌層間陽性神經(jīng)纖維清晰可見，同時也提供了其他背景信息，如黏膜層及黏膜下層的情況（見圖3-4）。移行段低倍鏡下可見較少著色神經(jīng)叢，神經(jīng)叢體積較小，分布較稀疏；高倍鏡下神經(jīng)節(jié)細胞可清楚分辨，但單個神經(jīng)叢內節(jié)細胞數(shù)量及大小較擴張段明顯變小，環(huán)肌層陽性神經(jīng)纖維少。狹窄段NADPH-d法染色后鏡下見背景清晰，無任何著色，未見NADPH-d陽性神經(jīng)叢及陽性神經(jīng)節(jié)細胞（見圖5）。

2.2 改良AchE法在擴張段可見AchE陽性肌間神經(jīng)叢及節(jié)細胞分布，近黏膜肌層有黏膜下神經(jīng)叢散在分布，量少（見圖6）。狹窄段AchE染色后見黏膜下層大量增生、肥厚、排列紊亂的AchE陽性神經(jīng)叢，以近黏膜固有肌層為著。蘇木素復染后結果更易判斷（見圖7）。

2.3 HE染色擴張段切片HE染色后，光鏡下見肌間神經(jīng)叢、神經(jīng)節(jié)細胞隱約可見，但不易識別，背景組織細胞極多，結果不易判斷。狹窄段HE染色，可見肌間雜亂分布的肥大神經(jīng)纖維束，無任何陽性神經(jīng)節(jié)細胞。

2.4 PGP9.5免疫組化法擴張段見大量陽性神經(jīng)叢，其胞核、胞漿均著色，環(huán)肌層亦有大量陽性神經(jīng)纖維遷入，與NADPH-d法的結果一致（見圖8）。移行段神經(jīng)叢分布相對稀疏。狹窄段黏膜下可見大量異常增生的PGP9.5陽性神經(jīng)叢，與AchE結果一致（見圖9）。

2.5 TUJ-1免疫熒光為判斷NADPH-d陽性節(jié)細胞及神經(jīng)叢的特異性，故對原先NADPH-d處理的切片（見圖1）再行高壓法抗原修復，加入神經(jīng)元特異性抗體TUJ-1進行雙重染色分析，結果與NADPH-d陽性部位一致，證實原先串珠狀分布的藍紫色組織，即為肌間神經(jīng)叢及神經(jīng)節(jié)細胞。組織切片再加用Hoechst33258染核，細胞核顯色藍色熒光，背景顯示更清晰，組織層次分明，陽性結果更易判斷。用Image Pro Plus 5.1專業(yè)軟件圖像重建，陽性肌間神經(jīng)叢輕易可見（見圖10）。

2.6 NADPH-d法和AchE法結果比較診斷陽性率NADPH-d法為94.4%（17/18），AchE法為88.9%（16/ 18），組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。耗時NADPH-d法最短，為（7.0±1.7）min，AchE法（30.9±2.2）min，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

圖1 擴張段NADPH-d陽性神經(jīng)叢及神經(jīng)節(jié)細胞（×100）

圖2 NADPH-d法顯示陽性神經(jīng)節(jié)細胞（×400）

圖3 伊紅襯染后背景信息豐富（×40）

圖4 伊紅襯染后環(huán)肌層陽性神經(jīng)纖維明顯（×100）

圖5 NADPH-d法狹窄段未見陽性結果（×100）

圖6 擴張段AchE陽性神經(jīng)叢（× 100）

圖7 狹窄段黏膜下層異常增生神經(jīng)叢（× 100）

圖8 擴張段PGP9.5陽性神經(jīng)叢及環(huán)肌間神經(jīng)纖維（×100）

圖9 PGP9.5免疫組化顯示狹窄段異常增生的黏膜下神經(jīng)叢（×100）

圖10 TUJ-1免疫熒光（×100）

3 討論

酶組織化學是利用組織細胞內酶具有催化某種反應的特性來檢測酶活性。在一定的條件下（具有酶的底物等）全酶進行催化作用，產生一種可見產物，沉淀在酶所在的部位，最終通過顯微鏡對酶的活性進行定位或定量研究。酶組織化學法優(yōu)于傳統(tǒng)HE染色或免疫組化法，在于能發(fā)現(xiàn)組織里的代謝變化。Bruder等[1]指出AchE的酶組織化學反應是超短段型巨結腸的獨特診斷方式。

我們改良了由NADPH-d等組成的快速酶組織化學染色方法，NADPH-d陽性神經(jīng)即為氮能神經(jīng)，釋放內源性NO，在腸神經(jīng)系統(tǒng)內代表舒張因素。在HD的標本中，我們發(fā)現(xiàn)擴張段近端切緣NADPH-d陽性神經(jīng)叢大量分布，環(huán)肌內有大量陽性神經(jīng)纖維遷入，說明近端切緣已有正常腸神經(jīng)系統(tǒng)分布，符合手術要求。狹窄段腸管痙攣與缺乏產生NO神經(jīng)有關，而合成NO需要NADPH-d的催化，故狹窄段無上述表現(xiàn)[2]。故該結果可以供手術當中診斷HD，評估狹窄段和移行段區(qū)域范圍，達到手術“精準”的要求[3-4]。NADPH-d陽性切片經(jīng)抗原修復后再用腸神經(jīng)特異性單克隆抗體TUJ-1驗證，兩者陽性神經(jīng)細胞分布一致；用PGP9.5免疫組化再次驗證陽性細胞及神經(jīng)叢分布，結果也相符；說明NADPH-d陽性神經(jīng)節(jié)細胞即腸神經(jīng)節(jié)細胞，故該方法可以準確確認腸管切緣[5-6]。不足之處是NADPH-d法染色背景較單一，黏膜下神經(jīng)叢反應較弱。有趣的是，我們在實驗中偶然使用了伊紅襯染，提供了豐富的背景信息，不僅陽性神經(jīng)叢和環(huán)肌層陽性神經(jīng)纖維更易辨認，而且也獲知了黏膜層及黏膜下層的情況，這種復染方法，鮮有報道。但這僅是目前的一個初步研究結果，樣本均為典型HD病例，且樣本數(shù)不多，對于HD類緣病診斷結果如何，尚需今后進一步研究。

AchE陽性神經(jīng)為乙酰膽堿能神經(jīng)，代表收縮因素，曾經(jīng)作為診斷HD的金標準[7]。我們在狹窄段黏膜下發(fā)現(xiàn)大量增生、扭曲的神經(jīng)叢，符合HD病理改變，亦與腸神經(jīng)元特異性標記物PGP9.5免疫組化結果相符，說明AchE法診斷HD切實可行。在HD病變段腸管中，AchE活性異常升高，通過顯色反應可看到膽堿能神經(jīng)纖維大量增生，該技術由Karnovsky等[8]在1964年首次報道，現(xiàn)在被廣泛運用。AchE化學染色對膽堿能纖維敏感，染色后可以識別出增生的膽堿能神經(jīng)纖維，該方法曾是證明黏膜以及黏膜下神經(jīng)干是否增粗的最好的技術之一，并且很適合在冰凍切片中使用，但在診斷神經(jīng)節(jié)細胞時特異性不是很高[2]。Nakao等[9]報道稱單獨使用這一方法時，診斷HD的特異性約為91%。很多學者不斷對這種傳統(tǒng)的AchE組織化學染色方法進行改進，但完成整個過程仍需至少2 h，不僅耗時而且步驟復雜，較難應用于術中快速診斷。我們提高了整個反應體系溫度，反應液配制后在37 ℃預熱，反應在孵育箱內進行，結果能在30 min內顯示。但同臨床術中快速診斷的要求還有差距，如果能通過今后進一步改良各種反應因素，完善反應體系，AchE法可能還有更廣泛的應用空間。我們認為AchE法的優(yōu)勢在于對黏膜下異常增生神經(jīng)叢的診斷非常準確，故特別適用于經(jīng)肛門吸引活檢的黏膜組織。國內有學者曾報道用AchE染色方法，可以識別出增生的膽堿能神經(jīng)纖維，而正常組神經(jīng)纖維不顯色[10]。但我們的結果發(fā)現(xiàn)在正常腸壁亦有AchE陽性肌間神經(jīng)叢及神經(jīng)節(jié)細胞分布，該結果與Kobayashi等[11]報道的一致。

目前用于診斷HD最常用的方法還是HE染色法。該方法作為病理檢查的基礎，各級醫(yī)院中均可開展，但對于識別發(fā)育未成熟、結構不典型的神經(jīng)節(jié)細胞有一定局限性，直接影響診斷準確率。Maia[2]曾報道術中快速冰凍HE染色診斷HD患者與病理檢查的一致性約為89%，這比其他需要進行術中快速冰凍切片診斷的病例與常規(guī)病理檢查一致性低。HD術中快速冰凍HE診斷錯誤的概率不是很高，但是對患病兒童造成的后續(xù)影響很大。

總之，不同方法在診斷HD時各有優(yōu)點，也有不容忽視的局限性。改良后的NADPH-d法適用于術中快速診斷HD，確定腸管切除范圍，最大優(yōu)勢在于快速、陽性結果易識別。因狹窄段肌間無NADPH-d表達，故NADPH-d法也適用于術前直腸肌層活檢的診斷。AchE法的優(yōu)勢在對于黏膜下異常增生神經(jīng)叢的診斷，特別適用于經(jīng)直腸黏膜吸引活檢的組織，但顯色的主要是膽堿能神經(jīng)纖維，并不能很好地顯示神經(jīng)節(jié)細胞，因此用作術中快速診斷HD仍有一定局限性。

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（本文編輯：胡苗苗）

Diagnosis of Hirschsprung’s disease with modified NADPH-d and AchE enzyme histochemistry

ZHULibin, ZHANG Hua, LIN Jinhan, DAI Lina, HUANG Huang, LI Zhongrong.
Department of Pediatric Surgery, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To assess the superiorities of modified NADPH-diaphorase (NADPH-d) and acetylcholinesterase (AchE) enzyme histochemistry staining technique to diagnose Hirschsprung’s disease (HD). To increase the identification of ganglion cells in the boundary of the bowel in HD and decrease the risks of reoperation.Methods:Full-thickness colon samples of 18 children with HD (girl 7 cases, boy 11 cases ), with average age (8.6±3) months, were examined. Frozen sections at three levels (narrow segment, transitional segment and dilated segment) were performed and investigated to determine the extent of aganglionosis by modified NADPH-d and AchE staining respectively, which were compared by traditional HE staining. TUJ-1 (β-III Tubulin) and PGP9.5(Protein Gene Product 9.5), markers of enteric neural cells, were used for identification of positive myenteric plexus and ganglion cells by immunofluorescence or immunohistochemistry.Results:NADPH-d staining could rapidly confirm whether the normal ganglion cells existed at the proximal end of the resected bowel. AchE technique clearly stained submucosal hypertrophic nerve trucks in aganglion segments. The specifica identifications of HD, NADPH-d staining was 94.4% (17/18), and AchE staining was 88.9% (16/18), respectively (P> 0.05). Time comsuming was (7.0±1.7) min in NADPH-d, and (30.9±2.2) min in AchE, respectively (P<0.01). The results of two modified methods mentioned above were in keeping with TUG-landPGP 9.5.Conclusion:Modified NADPH-d staining can rapidly confirmed whether the ganglion cells distribute at proximal end of resected bowel and it is suitable for rapidly intraoperative diagnosis of HD. AchE staining is the best technique to demonstrate hypertrophic nerve trunks in the submucosa and is suitable for diagnosing samples of suction rectal biopsy.

Hirschsprung’s disease; diagnosis; enzyme histochemistry; colorectal surgery

R726.1

A

1000-2138（2014）01-0031-05

2013-01-29

浙江省衛(wèi)生廳科研基金資助項目（2009A149）。

朱利斌（1977-），男，浙江臺州人，主治醫(yī)師，碩士。

李仲榮，教授，博士生導師，Email：wmclzr@163.com。