ERK1/2在缺血再灌注損傷肺細胞凋亡中的作用及缺血后處理的干預

陳海娥，馬迎春，黃林靜，何金波，宋冬，鄭夢曉，應磊，王萬鐵

（溫州醫(yī)科大學 缺血/再灌注損傷研究所、病理生理學教研室，浙江 溫州 325035）

·論 著·

ERK1/2在缺血再灌注損傷肺細胞凋亡中的作用及缺血后處理的干預

陳海娥，馬迎春，黃林靜，何金波，宋冬，鄭夢曉，應磊，王萬鐵

（溫州醫(yī)科大學 缺血/再灌注損傷研究所、病理生理學教研室，浙江 溫州 325035）

目的：探究細胞外信號調節(jié)激酶1/2（ERK1/2）在缺血/再灌注（IR）損傷肺細胞凋亡中的作用及缺血后處理的干預。方法：雄性SD大鼠，隨機分成5組（n=8），即對照組（C組）、肺缺血/再灌注組（IR組）、肺缺血/再灌注+缺血后處理組（IPO組）、缺血后處理+溶劑對照組（D組）、缺血后處理+U0126組（U組）。分別于再灌注2 h留取左肺組織，電鏡觀察肺組織超微結構改變；原位末端標記（TUNEL）法檢測肺細胞凋亡情況并計算凋亡指數（AI）；RT-PCR法、免疫組化法測定肺組織Bax、Bcl-2基因和蛋白的表達。結果：與C組相比，IR組肺組織AI、Bax基因及蛋白表達均顯著升高（P＜0.05），電鏡下肺細胞均發(fā)生明顯損傷；Bcl-2、Bcl-2/Bax基因及蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；IPO組、D組、U組與IR組相比，肺組織AI、Bax基因及蛋白表達均顯著降低（P＜0.05），電鏡下肺細胞損傷情況有所改善；Bcl-2、Bcl-2/Bax顯著升高；D組與IPO組比較各項指標差異均無統計學意義（均P＞0.05），U組與IPO組相比，肺組織AI值顯著升高（P＜0.05），電鏡下肺上皮細胞超微結構破壞較嚴重，胞內細胞器不完整；Bcl-2基因及蛋白表達明顯降低，Bax基因及蛋白表達明顯升高，Bcl-2/Bax顯著降低。結論：IR抑制了MAPK家族中的ERK1/2激活，導致大鼠肺組織結構嚴重破壞，細胞大量凋亡；IPO可以通過激活ERK1/2通路，改善其結構破壞和細胞凋亡。

缺血/再灌注；缺血后處理；肺；細胞凋亡；細胞外信號調節(jié)激酶1/2；U0126；Bcl-2；Bax；大鼠

隨著移植技術的廣泛開展，缺血/再灌注（ischemia reperfusion，IR）損傷成為了阻止移植成功的主要難題，肺缺血/再灌注是影響心肺移植成功與否的重大問題，其發(fā)生機制非常復雜，目前認為主要與氧自由基損傷、細胞凋亡、細胞內鈣超載損傷及內皮細胞的激活、炎性細胞的聚集激活、細胞黏附分子的釋放等因素有關[1]。缺血后處理（ischemic postconditioning，IPO）是在再灌注早期進行的一系列快速的血流中斷/再通的過程，其可以改變再灌注血流動力學并對缺血再灌注器官產生保護作用，是近年發(fā)現的一種重要內源性保護機制。已有研究表明IPO對肺IR有明顯的保護作用，但其機制仍不清楚[2]。

細胞外信號調節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatd protein kinase，MAPK）家族的一員，其基本的信號傳遞步驟是：Ras-Raf-MEK-ERK。ERK通路在細胞增殖、分化、抗凋亡中發(fā)揮重要作用，可被多種刺激（如神經遞質、氧化應激、缺血等）激活[3]。有研究表明ERK1/2在心臟IPO中被激活而發(fā)揮保護作用[4]，尚未有研究表明其是否在肺IPO中發(fā)揮作用，本實驗意在探明ERK1/ 2在肺IPO中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠40只，雄性，體質量200～250 g，由上海斯萊克動物實驗中心提供[實驗動物使用許可證號：SCXK（滬）2012-0002]。動物實驗方案經溫州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審核并同意實施。

1.2 主要試劑U0126（貨號U120，美國Sigma公司），原位細胞凋亡檢測試劑盒（LOT：13033000，德國Roche公司），Trizol提取液（美國Life technologies公司），反轉錄試劑盒（美國Fermentas Life Science公司），PCR試劑盒（美國Fermentas Life Science公司），Bcl-2鼠多克隆抗體（美國santa cruz公司），Bax鼠多克隆抗體（美國santa cruz公司），即用型SABC過氧化物酶試劑盒（武漢博士德公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司），脫氧核糖核酸酶I（美國Sigma公司），其余均為市售分析純。

1.3 動物模型復制按照已發(fā)表文獻[2]報道的方法復制大鼠原位肺IR和IPO動物模型。大鼠稱重后，按8 mL/kg體質量20%烏拉坦腹腔注射麻醉。麻醉后氣管插管，連接小動物呼吸機，行機械通氣，呼吸機參數設置為：潮氣量7～8 mL/kg，呼吸頻率70 b/min，吸呼比3:2。消毒左胸部皮膚，分離筋膜和肌肉，斷開第3、第4根肋骨，打開胸腔，暴露左肺，游離左肺門，動脈夾夾閉30 min，即為缺血期，松開動脈夾，即為再灌注期，再灌注時間為2 h，如此即成功復制在體原位單肺IR模型；再灌注前給予3個循環(huán)的缺血30 s/再灌注30 s處理，結束后再灌注2 h，即為IPO組。C組游離左肺門后不夾閉肺門，觀察2.5 h。

1.4 實驗分組隨機將實驗動物分為5組（每組8只）：對照組（C組），IR組，IPO組，IPO+0.4%二甲基亞砜（DMSO）的PBS溶液對照組（D組），IPO+U0126組（U組）。U0126用藥劑量為0.3 mg/kg體質量，將0.3 mg U0126溶于7.5 mL 0.4% DMSO的PBS溶液中，使其充分溶解，缺血前尾靜脈注入大鼠體內[5]，余處理同IPO組；D組于缺血前尾靜脈注入7.5 mL/ kg 0.4% DMSO的PBS溶液，余處理同IPO組。各組實驗結束后留取左肺組織標本。

1.5 肺組織電鏡檢測依據文獻[6]所述方法進行，即各組實驗結束后，處死動物，取左肺近肺門處約1 mm×1 mm×1 mm大小的肺組織若干小塊，立即經2.5%戊二醛前固定，再依次經1%鋨酸后固定，1%醋酸鈾塊染，酒精梯度脫水，丙酮浸透，Epon 812包埋聚合，半薄切片和超薄切片，經醋酸鈾和硝酸鉛雙重染色后，于電鏡下觀察各標本超微結構改變。

1.6 原位末端標記（TUNEL）法檢測依據文獻[7] Roche公司提供的試劑盒說明書所述方法進行操作。凋亡細胞胞核經DAB染色呈棕褐色，未凋亡細胞胞核復染后呈藍紫色。計數5個高倍鏡（×400）下的凋亡細胞數。每張片子至少觀察500個細胞，計算每100個細胞內的陽性細胞，即凋亡指數（apoptotic index，AI）。

1.7 RT-PCR法測定肺組織Bax、Bcl-2基因的表達Trizol法提取肺組織總RNA。測定總RNA濃度。按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA。再按照PCR試劑盒說明書進行cDNA擴增。內參及各目的基因的序列見表1。PCR反應條件為：起始變性，94 ℃，3 min；變性，94 ℃，30 s；退火，55 ℃（β-actin和Bax）/61.6 ℃（Bcl-2），30 s；延伸，72 ℃，1 min；終止延伸，72 ℃，5 min。循環(huán)數β-actin和Bax各30次，Bcl-2 33次。各目的基因擴增產物片段長度為：β-actin：378 bp；Bax：337 bp；Bcl-2：411 bp。用各基因擴增產物的密度與β-actin基因擴增產物的密度比值（即Bcl-2 mRNA/β-actin mRNA、Bax mRNA/β-actin mRNA）表示各基因表達水平。

表1 引物序列

1.8 免疫組化法檢測標本中Bax、Bcl-2蛋白的表達水平及其定位按照試劑盒所提供的說明書和文獻[8]中所述步驟進行操作。標本上呈棕褐色顯色的部分為Bcl-2、Bax蛋白陽性表達。采用美國IPP6.0（Image-pro plus）彩色圖像分析系統測定陽性部位及背景的光密度值，以陽性部位的光密度值減背景的光密度值代表陽性部位的吸光度（optical density，OD）值。

1.9 統計學處理方法采用SPSS17.0軟件。計量資料均進行正態(tài)性檢驗，以±s表示。多組樣本均數比較進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進行Dunnet’s t檢驗。雙變量相關性分析，采用Bivariate過程的Pearson相關分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電鏡下肺組織超微結構的變化C組電鏡下細胞結構完整，細胞器清晰可見，核內染色質均勻，未見核固縮碎裂或溶解；IR組超微結構損傷較嚴重，可見核碎裂、溶解，細胞器結構破壞嚴重，肺泡I I型上皮細胞內線粒體腫脹、脊消失，板層小體空泡化；IPO組和D組損傷有所減輕，未見明顯核碎裂、溶解，細胞間連接緊密，肺泡I I型上皮細胞內板層小體數量尚可，未見明顯空泡化，細胞器結構無破壞；U組細胞結構略有破壞，細胞間連接較疏松，部分細胞核內出現碎裂、溶解，核染色質邊集，肺泡I I型上皮細胞微絨毛略有脫落，線粒體腫脹（見圖1）。

2.2 各組細胞凋亡情況及AI值的變化與C組（11.66 ±1.11）相比，IR組AI值（35.65±0.76）顯著升高，D組（25.74±0.94）、U組（30.86± 1.13）、IPO組（26.26±0.95）AI值顯著低于IR組（均P＜0.05），D組與IPO組相比無明顯差異（P＞0.05），U組顯著高于IPO組（P＜0.05）。凋亡細胞主要為肺泡上皮細胞與血管內皮細胞（見圖2）。

2.3 肺組織Bax、Bcl-2基因表達水平的變化在C組Bcl-2呈高水平表達、Bax表達不明顯，IR組較C組Bcl-2表達明顯下降、Bax明顯上調，同時Bcl-2/Bax的比值降低（均P＜0.05）；與IR組比較，D組、U組、IPO組Bcl-2 mRNA表達增強，Bax mRNA表達減弱，Bcl-2/Bax的比值增高（均P＜0.05），D組與IPO組相比差異無統計學意義（P＞0.05）；U組與IPO組比較，Bcl-2表達下降、Bax表達上調，二者比值下降（見圖3）。

圖2 TUNEL法示各組肺組織細胞凋亡情況（×400）

圖3 ART-PCR法示Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的表達

圖3 B柱狀圖示Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達及Bcl-2/Bax比值變化

2.4 肺組織 Bax、Bcl-2蛋白的表達水平的變化及定位在C組Bcl-2蛋白呈高水平表達，Bax蛋白表達不明顯，IR組表達較C組Bcl-2表達明顯下降，Bax明顯上調，同時Bcl-2/Bax的比值降低（均P＜0.05）；與IR組比較，D組、U組、IPO組Bcl-2蛋白表達增強，Bax表達減弱，Bcl-2/Bax的比值增高（P＜0.05），D組與IPO組相比差異無統計學意義（P＞0.05），U組Bcl-2表達較IPO組明顯降低、Bax表達明顯升高，二者比值降低。Bcl-2與Bax陽性細胞主要分布于血管內皮細胞、肺泡上皮細胞及支氣管上皮細胞（見圖4-6）。

2.5 相關性分析肺組織AI與Bax基因及蛋白表達之間呈正相關（r分別為0.796，0.895，均P＜0.01，n=40）；肺組織AI與肺組織Bcl-2基因及蛋白、Bcl-2/Bax基因及蛋白呈負相關（r分別為-0.748，-0.797，-0.897，-0.960，均P＜0.01，n=40）。

3 討論

細胞凋亡又被稱為程序化細胞死亡，是細胞接受某種信號后或受到某些因素剌激后的一種主動的，由一些凋亡相關基因相互作用的細胞死亡過程。近年來，國內外學者的大量研究發(fā)現，細胞凋亡參與了肺IR損傷[1]。本實驗中，IR組AI值較C組明顯升高，肺組織超微結構損傷較C組嚴重，這些充分證明了以上結論。

圖4 各組肺組織Bax蛋白表達情況（免疫組化法，×200）

圖5 各組肺組織Bcl-2蛋白表達情況（免疫組化法，×200）

圖6 IPP6.0計算各組肺組織Bcl-2、Bax蛋白表達情況及Bcl-2/Bax比值

Ng等[1]報道，觸發(fā)細胞凋亡的途徑主要有死亡受體途徑（外源性途徑）和線粒體-細胞色素C（cytochrome C，Cyt c）途徑（內源性途徑）。其中外源性途徑通過特定的受體-配體相互作用，比如Fas/Fas-L、血管緊張素I I和腫瘤壞死因子（TNF）/受體，導致一系列的細胞內凋亡級聯激活主要是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspases）；內源性途徑主要是通過Bcl-2家族基因中的促凋亡基因Bax作用于線粒體膜表面，使其通透性改變，Cyt c和凋亡蛋白酶激活因子（Apaf）釋放，凋亡小體形成，激活caspases家族，導致細胞凋亡的發(fā)生。細胞凋亡與否主要是細胞內的促凋亡基因Bax和抑制凋亡基因Bcl-2相互作用，Bcl-2占優(yōu)勢時細胞存活，Bax占優(yōu)勢時細胞走向凋亡[9]。本實驗結果顯示：肺IR時， Bcl-2基因及蛋白表達下降，Bax基因及蛋白表達均升高，且Bcl-2/Bax比值下降；AI與Bax及Bcl-2/Bax基因及蛋白表達呈正相關，與Bcl-2基因及蛋白表達呈負相關，這與文獻[9]報道一致；而肺IPO中，Bcl-2基因及蛋白表達上調，Bax基因及蛋白表達下降，AI減少，超微結構下肺泡I I型上皮細胞胞膜及細胞器結構完整，線粒體未發(fā)生水腫，線粒體脊清晰可見，結果表明了肺IPO可減輕肺IR的細胞損傷和細胞凋亡。

更多的研究表明MAPKs家族在肺IR及其所致的細胞凋亡中發(fā)揮了不可忽視的作用[10-11]，而ERK1/2是MAPK家族的重要成員，目前ERK1/2的激活在細胞凋亡中究竟發(fā)揮何種調節(jié)機制仍有爭論，更多的研究認為適度激活ERK1/2可以抑制凋亡的發(fā)生[12-14]。本室先前研究表明，肺IR時，抑制ERK1/2的激活，導致細胞凋亡率明顯增加[8]。在心臟等器官IR中，ERKs被認為有抗凋亡作用，對IR臟器有保護作用[15]。Darling等[4]研究表明，在多種在體和離體的心肌IR中，IPO可通過ERK1/2的激活來減輕IR引起的心肌結構損傷和細胞凋亡。本實驗也發(fā)現，當應用ERK1/2特異性抑制劑U0126后，IPO中凋亡細胞數增多，即AI值增加，凋亡基因Bax占優(yōu)勢，說明阻斷ERK1/2后，IPO對IR的保護作用減弱。應用U0126后，Bax與Bcl-2也發(fā)生了相應的改變，這說明ERK1/ 2在內源性凋亡途徑中處于Bcl-2/Bax的上游，很可能ERK1/2的激活促使Bcl-2/Bax發(fā)生相應的改變，從而減少細胞凋亡。

綜上所述，IPO可激活肺組織ERK1/2，使抗凋亡基因Bcl-2表達增加，而促凋亡基因Bax表達減弱，減輕了IR引起的肺組織結構損傷和細胞凋亡。

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（本文編輯：吳健敏）

Effects of ERK1/2 on pneumocyte apoptosis after lung ischemia/reperfusion injury and ischemic postconditioning

intervention

CHEN Haie, MA Yingchun, HUANG Linjing, HE Jinbo, SONG Dong, ZHENG Mengxiao, YING

Lei, WANG Wantie.Department of Pathophysiology, Ischemia/Reperfusion Injury Research Institute, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To investigate the role of ERK1/2 on pneumocyte apoptosis after lung ischemia/ reperfusion injury and ischemic postconditioning (IPO) intervention.Methods:Forty adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups based upon the intervention (n=8): control group (C), IR group (IR), IR+IPO group (IPO), IPO+solution countrol group (D), IPO+U0126 group (U). Left lung tissue was isolated after the 2 hours of reperfusion, The ultrastructure of the left lung were observed under electron transmission microscopes. Apoptosis index (AI) of lung tissue was determined by terminal deoxynuleotidyl transferase mediated dUTP nick end and labeling (TUNEL) method. The mRNA expression and protein levels of Bcl-2 and Bax were measured by RT-PCR and quantitative immunohistochemistry (IHC).Results:Compared with C group, AI and the expression of Bax of IR were significantly increased, the expression of Bcl-2 and Bcl-2/Bax were significantly decreased (P< 0.05), and ultrastructure abnormality was obviously found in lung tissue. Compared with IR group, all the indexes of IPO except for the expression of Bcl-2 and Bcl-2/Bax were obviously reduced, the expression of Bcl-2 and Bcl-2/Bax was increased (P<0.05). All the indexes between D and IPO were little or no significant (P>0.05). the expression of Bcl-2 and Bcl-2/Bax of U was significantly decreased and other indexes were increased than those of IPO (P<0.05).Conclusion:IPO may attenuate pneumocyte apoptosis in LIRI by activation of ERK1/2 MAPK, up-regulating expression of Bcl-2/Bax ratio.

ischemia/reperfusion; ischemic postconditioning; lung; cell apoptosis; ERK1/2; U0126; Bcl-2; Bax; rats

R363

A

1000-2138（2014）02-0095-06

2013-09-22

溫州市高層次人才創(chuàng)新技術重點資助項目（2 01 1-05）；浙江省中醫(yī)藥重點學科建設計劃項目（2 01 2-X K-A 28）。

陳海娥（1986-），女，河北秦皇島人，碩士生。

王萬鐵，教授，博士生導師，Email：wwt@wzmc.edu.cn。