藥用植物提取物抑制鈣調(diào)磷酸酶活性作用的研究進展

何 娜，吳鵬飛，崔志峰

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州 310032）

藥用植物提取物抑制鈣調(diào)磷酸酶活性作用的研究進展

何 娜，吳鵬飛，崔志峰

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州 310032）

鈣調(diào)磷酸酶抑制劑如環(huán)孢素A和他克莫司是目前臨床上常用的免疫抑制劑，但具有腎毒性、高血糖等多種不良反應(yīng)。從藥用植物中提取篩選鈣調(diào)磷酸酶抑制劑為開發(fā)新的高效低毒免疫抑制劑提供了一條新途徑。研究表明，聚異戊二烯二苯甲酮類化合物isogarcino l、槲皮素、山奈酚、苯乙醇苷類化合物、艾里莫芬烷倍半萜類化合物eremoxylarins A和eremoxylarins B以及扁柏提取物、菝葜提取物和矮探春提取物等對鈣調(diào)磷酸酶活性具有明顯的抑制作用。本文對近年來藥用植物提取物抑制鈣調(diào)磷酸酶活性作用的研究進行綜述，旨在為利用和開發(fā)藥用植物來源的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑提供參考。

植物，藥用；鈣調(diào)磷酸酶；鈣調(diào)磷酸酶抑制劑

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．03．026

鈣調(diào)磷酸酶（calcineurin，CN）亦稱蛋白磷酸酶2B，是真核細(xì)胞生物中高度保守的一種受Ca2＋／鈣調(diào)素（calmodulin，CaM）調(diào)節(jié)的絲／蘇氨酸蛋白磷酸酶。CN作為人體中Ca2＋信號調(diào)節(jié)途徑的重要信號酶，在人體免疫調(diào)節(jié)、學(xué)習(xí)記憶、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和肌肉量調(diào)節(jié)等方面起著極其重要的作用［1－2］。尤其在免疫系統(tǒng)中，CN在細(xì)胞因子介導(dǎo)的T細(xì)胞活化中起到調(diào)節(jié)樞紐的作用［3－4］。由于這個原因，絕大多數(shù)臨床上使用的免疫抑制劑都是CN抑制劑（calcineurin inhibitor，CNI），如環(huán)孢素A（cyclosporineA，CsA）、他克莫司（tacrolimus）和匹美克莫司（pimecrolimus）［5］。但長期大量用藥仍可產(chǎn)生腎毒性、高血糖等多種不良反應(yīng)，影響了其在臨床的用［6－8］。

藥用植物是我國的傳統(tǒng)醫(yī)藥和天然藥物的寶庫，從藥用植物篩選CNI為開發(fā)新的高效低毒免疫抑制劑提供了一條新途徑。本文對近年來藥用植物提取物抑制CN活性作用的研究進行綜述，旨在為利用和開發(fā)藥用植物來源的CNI提供參考。

1 鈣調(diào)磷酸酶

1．1 鈣調(diào)磷酸酶的結(jié)構(gòu)特點

CN是真核細(xì)胞生物中高度保守的一種受Ca2＋／CaM調(diào)節(jié)的絲／蘇氨酸蛋白磷酸酶。CN是二聚體蛋白，由催化亞基CnA和調(diào)節(jié)亞基CnB組成，其結(jié)構(gòu)見圖1。高等真核生物CnA及其異構(gòu)體的大小相對固定為58～64 ku，而低等真核生物中一般變化較大，為51～71 ku，但都含有催化區(qū)域、CnB結(jié)合區(qū)域、CaM結(jié)合區(qū)域和自身抑制區(qū)域4個高度同源的功能區(qū)域。人體CnA的催化區(qū)域位于71～342 aa，其氨基酸序列與絲／蘇氨酸蛋白磷酸酶1和絲／蘇氨酸蛋白磷酸酶2A非常相似；CnB結(jié)合區(qū)域位于348～370氨基酸，CaM結(jié)合域位于391～414氨基酸；自身抑制域位于457～482氨基酸（圖1）。CnB具有4個與Ca2＋結(jié)合的EF-hand結(jié)構(gòu)域。CnB不具有磷酸酶活性，但對于維持CN的高度專一性是必須的，對酶的活性起著調(diào)節(jié)作用［9－10］。

1．2 鈣調(diào)磷酸酶在免疫調(diào)節(jié)中的作用

圖1 鈣調(diào)磷酸酶催化亞基CnA與調(diào)節(jié)亞基Cn B的結(jié)構(gòu)．a(chǎn)a：氨基酸．

CN參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，它的脫磷酸化作用與轉(zhuǎn)錄以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多生命過程密切相關(guān)，特別是在細(xì)胞因子介導(dǎo)的T細(xì)胞活化中起著調(diào)節(jié)樞紐的作用。在免疫應(yīng)答中，活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor o f activated T ce ll，NFAT）是T淋巴細(xì)胞受抗原刺激后產(chǎn)生細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）所需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，而NFAT蛋白活性又依賴于CN的作用。隨著胞內(nèi)Ca2＋水平的升高，活化的CN使胞漿中NFAT脫磷酸化，從而暴露出其核定位信號，脫磷酸化的NFAT轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，與IL-2基因的增強子結(jié)合，從而啟動IL-2基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致T細(xì)胞活化。因此，CN是T細(xì)胞活化的關(guān)鍵酶，在免疫調(diào)節(jié)中有著非常重要的作用［3－4］。

1．3 鈣調(diào)磷酸酶抑制劑

CNI如CsA、他克莫司和匹美克莫司是目前臨床上常用的免疫抑制劑［5］。CsA最初是從真菌To lypoc ladium in flatum發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)的具有免疫抑制活性的代謝產(chǎn)物，它是一種由11個氨基酸組成的環(huán)多肽，其作用靶點是CN。CsA于1983年被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床腎移植，是第一個具有選擇性的免疫抑制劑。CsA的發(fā)現(xiàn)大大提高了各種器官移植的成功率，使器官移植進入了一個全新的時期［11］。但CsA和他克莫司等CNI的長期大量用藥仍可產(chǎn)生腎毒性、高血糖等多種不良反應(yīng)，影響了其在臨床的使用［6－8］。如何克服或減少CNI的不良反應(yīng)成了迫切需要解決的新的研究課題。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，CN的催化亞基有3種異構(gòu)體即CnAα，CnAβ和CnAγ。其中CnAα和CnAβ廣泛分布于動物體內(nèi)各個組織，CnAγ只存在哺乳動物的睪丸當(dāng)中，可能與精子的形成相關(guān)。而且有關(guān)的研究表明，CnAβ主要參與免疫調(diào)節(jié)，CnAα則與腎功能調(diào)節(jié)相關(guān)［11］。因此，選擇性地結(jié)合CnAβ的下一代CNI可能會極大地克服目前臨床常用的CNI選擇性低、不良反應(yīng)大等缺陷。藥用植物和微生物是天然藥物的寶庫，從藥用植物篩選新的高效低毒CNI是當(dāng)前免疫抑制劑研究領(lǐng)域的一個重要方向。

2 藥用植物抑制CN活性

2．1聚異戊二烯二苯甲酮類化合物異藤黃酚

異藤黃酚（isogarcinol）是藤黃酚（garcino l）的氧化同分異構(gòu)體，具有多種生物活性，如抗瘧原和抗菌活性［12－13］?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式如圖2所示。Cen等［14］以CN為靶酶，探討了藤黃屬山竹子中多種天然化合物的免疫抑制特性，并發(fā)現(xiàn)一種活性化合物isogarcino l。CN酶活性抑制分析表明，isogarcino l能抑制CN的活性，且在＜83．06μmol·L－1范圍內(nèi)呈濃度依賴性，抑制酶活性的IC50為36．35μmol·L－1。動物實驗結(jié)果表明，在相對低毒性的濃度下，isogarcino l能夠抑制刀豆蛋白A誘導(dǎo)的小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，刀豆蛋白A誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)24，48和72 h時，IC50分別為30．2，15．0和12．1μmol·L－1。同樣，混合淋巴細(xì)胞分別培養(yǎng)48，72和96 h時，IC50分別為24．9，19．0和11．3μm ol·L－1。此外，毒性實驗結(jié)果顯示，小鼠分別口服isogarcinol和CsA 2周，小鼠無死亡，發(fā)現(xiàn)isogarcinol毒性更低，不良反應(yīng)少，可減輕遲發(fā)型超敏反應(yīng)，延長異體皮膚移植的存活［14］。以上結(jié)果表明，isogarcino l可作為一種新型的可口服的免疫調(diào)節(jié)藥物，并用于自身免疫性疾病的治療。

圖2 isogarcino l的化學(xué)結(jié)構(gòu)．

2．2 槲皮素

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，其化學(xué)名為3，3′，4′，5，7-五羥基黃酮，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖3所示。多以苷的形式（如蕓香苷、槲皮苷和金絲桃苷等）存在于植物的花、葉和果實中［15］。許多中草藥如槐米、桑葉、銀杏葉、羅布麻、三七、金蕎麥和紅棗等都含該成分。槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗血小板聚集和清除自由基等多種生物特性［16－18］。Wang等［19］發(fā)現(xiàn)，槲皮素是一種新的CNI，其作用位點位于CN的催化亞基CnA，無論在體外或在Jurkat細(xì)胞都可以結(jié)合和非競爭性抑制CN。以RⅡ肽為底物的方法測定槲皮素抑制人重組CN酶活性的IC50為（11．2±2）μm ol·L－1。在Jurkat細(xì)胞中，槲皮素能顯著抑制IL-2基因的表達，表明其可能為有效的免疫抑制劑。最新的研究還表明，槲皮素結(jié)合CN的區(qū)域與CsA和他克莫司結(jié)合CN的區(qū)域相似［20］。槲皮素具有改善肝腎損傷等藥理作用，是許多中藥材治療肝疾病的有效活性成分，通過建立慢性CsA腎病的大鼠模型，觀察槲皮素對CsA慢性腎毒性所致的腎小管間質(zhì)纖維化的影響，發(fā)現(xiàn)槲皮素對CsA所致的腎毒性具有明顯的改善作用［21］。

圖3 槲皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)．

2．3 山奈酚

山奈酚（kaem p fero l）化學(xué)名3，4′，5，7-四羥基黃酮，又名山柰黃酮醇，屬于黃酮類化合物，分子式為C15H10O6。廣泛存在于各種植物中，如槐米、銀杏、辣木等綠色植物，具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗病毒等多種功效［22］。Wang等［23］報道，山奈酚在體外和Jurkat細(xì)胞中都具有CN抑制活性。山奈酚不需免疫親和素，通過直接非競爭性的方式結(jié)合到鈣調(diào)磷酸酶催化亞基CnA的催化區(qū)域抑制其活性，以32P標(biāo)記的RⅡ磷酸多肽為底物測定山奈酚抑制人重組CN酶活的IC50＝（51±3）μm o l·L－1。CaM和CN的調(diào)節(jié)亞基CnB協(xié)同性地提高山奈酚對CN的抑制活性，其中CnB對山奈酚抑制效果的影響尤為顯著。山奈酚也明顯抑制Jurkat細(xì)胞中IL-2基因的表達。

2．4 苯乙醇苷類化合物

苯乙醇苷類化合物是一類由苯乙醇與糖結(jié)合形成的苷，多與環(huán)烯醚萜類共存于植物中，廣泛見于民間藥用雙子葉植物中，如馬鞭草科、玄參科、木犀科、車前科等。該類化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性［24］。Sasaki等［25］從地黃中分離得到的苯乙醇苷類化合物對綿羊紅細(xì)胞抗體有很好的免疫抑制作用。Huang等［26］從車前子中提取的苯乙醇苷類化合物（毛蕊花糖苷）對小鼠來源的樹突狀細(xì)胞具有免疫調(diào)控作用。Prescott等［27］研究報道，從消炎鎮(zhèn)痛類中藥材石蠶香科（Teucrium chamaedrys）和假荊芥屬（Nepeta cataria）中分離得到苯乙醇苷類化合物咖啡酸苯乙醇苷（teucrioside）（圖4A）、毛蕊花糖苷（verbascoside）（圖4B）和苯丙素苷（lam iuside A）（圖4C），它們不需任何的親免蛋白直接抑制CN活性，以pNPP為底物時，咖啡酸苯乙醇苷、毛蕊花糖苷和苯丙素苷抑制CN活性的IC50分別為10．4，11．6和4．5μmol·L－1。在以RⅡ磷酸多肽為底物時，咖啡酸苯乙醇苷、毛蕊花糖苷和苯丙素苷都是與CN直接結(jié)合來抑制酶活性，CaM降低咖啡酸苯乙醇苷與毛蕊花糖苷的酶抑制活性，但是增強苯丙素苷的酶抑制活性。苯乙醇苷類化合物的生物活性十分廣泛，隨著其藥理特性和作用機制研究日漸完善，采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對該類物質(zhì)進行新藥研發(fā)，極有希望成為一類新型調(diào)節(jié)人體免疫功能的苷類藥物。

圖4 咖啡酸苯乙醇苷（A）、毛蕊花糖苷（B）和苯丙素苷（C）的化學(xué)結(jié)構(gòu)．

2．5艾里莫芬烷倍半萜類化合物erem oxy larins A和erem oxy larins B

艾里莫芬烷倍半萜（eremophilane sesquiterpenes）是菊科千里光族植物中存在的一類特征性化學(xué)成分，也分布在微生物界，具有抗腫瘤和抗白血病等生理活性［28］。Ogasawara等［29］利用高度靈敏的酵母突變株zds1正篩選模型篩選鈣離子通道抑制劑時，發(fā)現(xiàn)新型艾里莫芬烷倍半萜類化合物eremoxylarins A（圖5A）和eremoxylarins B（圖5B）。這些化合物能夠挽救高鈣離子引起的酵母生長抑制，且相對于酵母鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)亞基缺陷菌株cnb1無明顯影響，對酵母MAP激酶缺陷菌株mpk1顯示出合成致死作用，表明它們的分子靶標(biāo)是CN途徑。在體外實驗中，eremoxylarins A和erem oxylarins B在無需免疫親和素的情況下以競爭性方式直接抑制CN的活性，抑制CN活性的IC50分別為2．7和1．4μmol·L－1。該類物質(zhì)可作為免疫抑制劑和抗過敏藥物良好的先導(dǎo)化合物。

圖5艾里莫芬烷倍半萜類化合物eremoxylarins A（A）和erem oxy larins B（B）的化學(xué)結(jié)構(gòu)．

2．6扁柏提取物p isiferdio l

pisiferdiol為松香烷型二萜類化合物，從日本扁柏屬植物中分離得到（圖6）。扁柏枝葉有涼血、止血之功效，該屬植物中所含的二萜化合物具有抗菌、抗腫瘤及抗氧化等生物活性，具有廣闊的藥用價值［30］。pisiferdio l在體外具有特異性活化鼠蛋白磷酸酶2Cα的活性，在人早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞株HL60中能促進蛋白磷酸酶2C的細(xì)胞內(nèi)底物Bad脫磷酸化［31］。CN在真核細(xì)胞生物中的高度保守性也促進了用酵母模型篩選CNI方法的發(fā)展。在利用酵母zds1突變株正篩選模型篩選鈣離子信號途徑抑制劑時，Aburai等［32］發(fā)現(xiàn)，鼠蛋白磷酸酶2Cα激活劑pisiferdiol能夠挽救高鈣離子引起的酵母生長抑制，而且pisiferdio l對于酵母鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)亞基缺陷菌株cnb1無明顯影響，對酵母促分裂原活化蛋白激酶缺陷菌株m pk1顯示出合成致死作用，表明pisiferdiol的分子靶標(biāo)是鈣調(diào)磷酸酶途徑而不是促分裂原活化蛋白激酶途徑。通過酵母CDRE∷laZ報告基因，他們還發(fā)現(xiàn)，pisiferdio l抑制CN介導(dǎo)的CDRE∷laZ的表達，pisiferdio l 62．5 g·L－1與他克莫司0．01 g·L－1具有相同的抑制作用。由此推測，pisiferdiol可能通過蛋白磷酸酶2C間接抑制CN途徑。Gonza lez等［33］報道，蛋白磷酸酶2C的同源蛋白2C型蛋白磷酸酶1的高表達或活化可能抑制CN活性。

圖6 p isiferd io l的化學(xué)結(jié)構(gòu)．

2．7 菝葜提取物

菝葜（Sm ilax china L．）為百合科植物菝葜的干燥根莖，臨床上用于治療各種炎癥性疾病，具有消腫解毒、祛風(fēng)利濕、抗炎癥痛及抗腫瘤等多種藥理活性［34］。藥理研究表明，菝葜中的有效成分可以參與機體內(nèi)免疫因子的調(diào)節(jié)，治療免疫性疾病。通過底物發(fā)色法測定菝葜不同溶劑提取物對CN活性的抑制作用，陳東生等［35］發(fā)現(xiàn)，菝葜提取物具有抑制CN的活性。菝葜提取物可能通過抑制CN活性來阻斷其介導(dǎo)的T細(xì)胞活化核因子脫磷酸化反應(yīng)，抑制其移位到核內(nèi)，進而抑制參與T淋巴細(xì)胞分化的生長因子IL-2等的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮免疫抑制作用。菝葜提取物中具有CN抑制作用的活性部分主要集中在正丁醇萃取部位，提取物5 g·L－1對CN的抑制率達到45．35%。

2．8 矮探春提取物

矮探春（Jasm inum hum ile L．）是灌木或小喬木，喜溫暖，稍耐寒，生于海拔2300～3100 m的林中或灌叢中。其葉可用于治療皮膚病，具有清火，解毒及抗感染等特性。Prescott等［36］利用酵母CDRE∷LacZ報告基因高通量模型篩選出該植物根葉提取物具有CNI活性。用重組人CN試劑盒直接檢測CNI活性的結(jié)果證明，該植物根葉提取物不需免疫親和素能夠直接抑制CN活性，以RII磷酸多肽為底物測定根和葉提取物IC50分別為32．3和31．8 mg·L－1。此外，矮探春根葉提取物對人體CNCaM復(fù)合物活性的抑制效果比對直接人體CN抑制效果更好，說明該植物提取物可能是與CN-CaM復(fù)合物結(jié)合或是經(jīng)過CaM活化的CN結(jié)合。由于中草藥矮探春的提取物具有明顯的抑制酵母和人體CN活性的作用，可作為潛在的新型CN抑制劑。

3 展望

中草藥是我國的傳統(tǒng)醫(yī)藥。臨床上，中草藥在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的治療中具有良好的效果。最近孫世芹等［37］也對雷公藤、蘇木、青風(fēng)藤、天花粉及青蒿等中草藥中的單體化合物的免疫抑制活性研究作了綜述。由此可見，對中草藥的CNI活性和免疫抑制活性研究已成為當(dāng)前免疫抑制劑研究領(lǐng)域的重點之一。目前臨床上常用的免疫抑制劑如CsA、他克莫司和匹美克莫司都是CNI［5］。對中草藥CNI活性，尤其是中草藥單體化合物CNI活性的深入研究可以更加有效的發(fā)揮中草藥的免疫抑制作用。從中草藥篩選和提取具有CNI活性的免疫抑制劑具有來源廣、成本低和毒性低的優(yōu)點，加強開發(fā)中草藥來源的具有CNI活性的免疫抑制新藥，必將推動我國免疫性疾病治療和器官移植的迅速發(fā)展。

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Progress o f inhibitory effect ofmedicinal p lant extracts on calcineurin

HE Na，WU Peng-fei，CUIZhi-feng
（College of Bio logical and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

Calcineurin inhibitors，such as cyclosporin A and tacrolimus，are w idely-used immunosupp ressive d rugs c linica lly．However，renal toxicity，hyperg lycaem ia and other side-e ffects can occur over long-term use．Iso lation o f nove l ca lcineurin inhibitors from medicinal p lants in recent years has p rovided a new app roach to the development o f new immunosuppressive d rugs w ith high e fficiency and low toxicity．Recnt studies have shown that m edicina l p lant extracts，such as isogarcino l，quercetin，kaem p fero l，phenylethanoid g lycosides，erem ophilane sesquiterpenes A and B，pisiferdiol，as we ll as extracts from Sm ilax china L and Jasm inum hum ile L，have obvious inhibitory effecton calcineurin．

plants，medicinal；calcineurin；calcineurin inhibitor

CUIZhi-feng，E-mail：zfcui＠zjut．edu．cn，Tel：（0571）88320741

R979．5，R285

A

1000-3002（2014）03-0462-06

2014-01-14 接受日期：2014-04-15）

（本文編輯：齊春會）

何 娜（1989－），女，碩士研究生，主要從事鈣調(diào)磷酸酶抑制劑的篩選和研究。

崔志峰，Tel：（0571）88320741，E-mail：zfcui＠zju t．edu．cn