骨關(guān)節(jié)結(jié)核各類標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)與PCR檢測的陽性率結(jié)果分析

董偉杰 秦世炳 趙立平 付育紅 黃海榮

骨關(guān)節(jié)結(jié)核是除結(jié)核性胸膜炎和淋巴結(jié)核外最常見的肺外結(jié)核，約占結(jié)核病患者的1%～3%[1]。臨床上骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷是一個(gè)難點(diǎn)，患者從首次出現(xiàn)癥狀到最后確診往往需要幾個(gè)月甚至幾年的時(shí)間。近年來，隨著磁共振成像(MRI)技術(shù)[2]的推廣使用，使得骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷所需時(shí)間大大縮短。雖然結(jié)核病的細(xì)菌學(xué)診斷是最直接可靠的證據(jù)，然而骨關(guān)節(jié)結(jié)核卻往往由于標(biāo)本的不易獲得和培養(yǎng)陽性率低等原因，在骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷中沒能發(fā)揮重要作用。為了解標(biāo)本的性質(zhì)和培養(yǎng)方法對培養(yǎng)陽性率的影響，筆者觀察了骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶中膿液、肉芽、死骨及干酪壞死組織的BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)培養(yǎng)及改良羅氏培養(yǎng)的培養(yǎng)陽性率，以期為將來骨關(guān)節(jié)結(jié)核標(biāo)本的留取和培養(yǎng)方式的選擇提供依據(jù)，提高骨關(guān)節(jié)結(jié)核的細(xì)菌學(xué)診斷水平。

對象和方法

一、研究對象

選取2011年6月至2012年5月北京胸科醫(yī)院收治的術(shù)前通過CT及MRI發(fā)現(xiàn)存在膿腫及死骨，后經(jīng)病理檢查明確診斷為骨關(guān)節(jié)結(jié)核的全部患者50例，其中男26例，女24例；年齡范圍為15～84歲，平均(40.7±19.6)歲；60歲以上老年患者9例(18.0%)；根據(jù)患病部位分為脊柱結(jié)核40例，關(guān)節(jié)結(jié)核8例，胸骨關(guān)節(jié)結(jié)核2例。所有患者均接受病灶清除手術(shù)，術(shù)中取得病灶中的膿液、干酪、肉芽及死骨組織，分別進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌MGIT 960 培養(yǎng)及改良羅氏培養(yǎng)，另外對所有的膿液標(biāo)本開展了結(jié)核分枝桿菌PCR檢測。本研究標(biāo)本為常規(guī)送檢標(biāo)本中的剩余標(biāo)本，已通過北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所倫理委員會(huì)審核。

50例患者通過病灶清除術(shù)共分離出膿液標(biāo)本50份、干酪標(biāo)本42份、肉芽標(biāo)本48份及死骨組織標(biāo)本43份，其中有37位患者同時(shí)獲取了全部4種類型的標(biāo)本。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.標(biāo)本處理：膿液標(biāo)本依照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[3]中的N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-氫氧化鈉法進(jìn)行標(biāo)本處理。干酪、肉芽及死骨組織在加入適量磷酸鹽緩沖液后，應(yīng)用微型研磨器Fastprep-24(美國MP Biomeidcals公司)進(jìn)行勻漿，之后直接接種。

2.羅氏培養(yǎng)：接種后的改良羅氏培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)，每周檢查一次細(xì)菌的生長狀態(tài)直至有菌落生長為止。以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv作為陽性對照，以空白管作為陰性對照。

3. MGIT 960培養(yǎng)：接種后的MGIT 960培養(yǎng)管放入MGIT 960全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)(美國BD公司)中進(jìn)行培養(yǎng)，以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv作為陽性對照，以空白管作為陰性對照。

4.結(jié)核分枝桿菌PCR檢測：采用達(dá)安基因公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌PCR檢測試劑盒，陽性對照、陰性對照設(shè)置及其他具體操作見產(chǎn)品說明。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示。

結(jié) 果

所有標(biāo)本的改良羅氏培養(yǎng)結(jié)果，MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果及PCR檢測結(jié)果見表1。依據(jù)MGIT 960培養(yǎng)陽性率排列4種標(biāo)本順序?yàn)椋核拦墙M織(41.9%，18/43)>膿液(40.0%，20/50)>肉芽(33.3%，16/48)=干酪(33.3%，14/42)；依據(jù)羅氏培養(yǎng)陽性率排列4種標(biāo)本順序?yàn)椋喝庋?20.8%，10/48)>膿液(20.0%，10/50)>死骨組織(16.3%，7/43)>干酪(14.3%，6/42)。以50例患者所取的4種標(biāo)本中1種標(biāo)本或以上培養(yǎng)陽性評價(jià)兩種培養(yǎng)方法，則MGIT 960 培養(yǎng)陽性率為42.0%(21/50)，羅氏培養(yǎng)陽性率為30.0%(15/50)；兩種培養(yǎng)方法的聯(lián)合陽性率為 50.0%(25/50)。

50份膿液標(biāo)本單獨(dú)進(jìn)行了PCR檢測，其中有24份PCR檢測陽性，陽性率為48.0%(24/50)。24份PCR檢測陽性的膿液標(biāo)本中有18份培養(yǎng)也獲得陽性結(jié)果，另有6份標(biāo)本培養(yǎng)陰性。PCR檢測、MGIT 960及改良羅氏培養(yǎng)3種方法的聯(lián)合陽性率為68.0%(34/50)。

表1 膿液、干酪、肉芽及死骨組織的MGIT 960、羅氏培養(yǎng)及PCR陽性情況

討 論

骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷目前可以依賴的手段包括影像學(xué)檢測、病理學(xué)檢測和病原微生物學(xué)檢測。由于長期以來骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性率較低[4]，臨床上主要依賴影像學(xué)檢查進(jìn)行診斷，依靠術(shù)后病理檢查進(jìn)行最后確診，而作為結(jié)核病診斷最為直接可靠的細(xì)菌學(xué)檢查技術(shù)常得不到臨床醫(yī)生的重視。為了探討如何提高骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者獲得細(xì)菌學(xué)診斷的比例，筆者開展了此項(xiàng)研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過選取骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶中的膿液、肉芽組織、死骨及干酪壞死組織等多種標(biāo)本，聯(lián)合使用BACTEC MGIT 960培養(yǎng)和改良羅氏培養(yǎng)可以獲得50.0%的培養(yǎng)陽性率。這一陽性率遠(yuǎn)高于吳啟秋等[5]報(bào)道的應(yīng)用BACTEC TB460檢測儀選取膿液、干酪壞死組織及肉芽組織進(jìn)行培養(yǎng)獲得的18.4%的培養(yǎng)陽性率。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，除了增加羅氏培養(yǎng)小幅度提升了培養(yǎng)陽性率外，標(biāo)本的處理方式對于陽性率提高有非常重要的作用。本研究中分離到的死骨組織的MGIT 960培養(yǎng)陽性率高于膿液及肉芽組織，這一結(jié)果出乎試驗(yàn)設(shè)計(jì)之初的預(yù)期。本試驗(yàn)中，筆者將死骨組織經(jīng)微型研磨器打碎離心處理后進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，獲得的MGIT 960培養(yǎng)陽性率為41.9%(18/43)，高于骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者最常留取的膿液標(biāo)本的培養(yǎng)陽性率(40.0%，20/40)。由此表明，未來臨床醫(yī)生在骨關(guān)節(jié)結(jié)核手術(shù)中，應(yīng)該盡量留取多種標(biāo)本并根據(jù)標(biāo)本選取恰當(dāng)?shù)臉?biāo)本處理方式，以提高后續(xù)培養(yǎng)的陽性率。

本研究中，4種類型標(biāo)本MGIT 960培養(yǎng)的陽性率都較相應(yīng)的羅氏培養(yǎng)陽性率高，提高程度從12.5%到25.6%不等，表明MGIT 960培養(yǎng)比羅氏培養(yǎng)更適用于骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的標(biāo)本培養(yǎng)。然而對于所納入的50例患者，有4例患者僅羅氏培養(yǎng)獲得陽性結(jié)果，由此表明在條件允許的時(shí)候同時(shí)開展兩種培養(yǎng)有利于提高總體陽性率。對所有的膿液標(biāo)本進(jìn)行PCR檢測，再聯(lián)合改良羅氏培養(yǎng)及MGIT 960培養(yǎng)可使本組標(biāo)本的總體陽性率達(dá)到68.0%。這從一個(gè)側(cè)面提示，骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶中的病變組織若得以妥善分離利用，并綜合利用目前成熟的微生物學(xué)培養(yǎng)方法及分子生物學(xué)技術(shù)將對骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷大有裨益，對縮短診斷時(shí)間亦有積極意義。目前，對于早期骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷，通常采用病變部位穿刺的辦法獲得標(biāo)本，但在脊柱結(jié)核，由于解剖位置深，往往獲得的組織量微小[6]，除常規(guī)送檢病理外，如何通過分子生物學(xué)技術(shù)對穿刺標(biāo)本進(jìn)行處理，以獲得微生物學(xué)診斷依據(jù)，亦不失為日后努力的方向。

骨關(guān)節(jié)結(jié)核獲得細(xì)菌學(xué)證據(jù)不僅有利于確診，而且還為后續(xù)的細(xì)菌學(xué)研究提供了條件。以本研究為例，筆者對10株羅氏培養(yǎng)陽性的菌株開展了后續(xù)的藥敏試驗(yàn)，其中5株被確定為耐藥菌株，而其中又有3株為耐多藥菌株。鑒于骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者在手術(shù)之后仍然需要進(jìn)行抗結(jié)核化療，而早期獲得患者耐藥及藥敏結(jié)果，并給予合理的抗結(jié)核治療并結(jié)合合理的手術(shù)方法是治愈的關(guān)鍵[7]，因此獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果對于指導(dǎo)化療方案的選擇意義重大，而提高骨關(guān)節(jié)結(jié)核的陽性培養(yǎng)率是開展傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的前提。

傳統(tǒng)的培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)有些耗時(shí)過長，影響了其對臨床的指導(dǎo)價(jià)值。新興的一些分子生物學(xué)技術(shù)如GeneXpert[8-9]尤以其能夠進(jìn)行快速藥敏診斷而深受臨床歡迎。本研究至少提示未來開展新的分子診斷技術(shù)時(shí)，可以恰當(dāng)?shù)剡x擇術(shù)中取得的組織來進(jìn)行有效檢測，以早期獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)耐藥患者，調(diào)整治療方案，以減少術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生。

總之，本研究的結(jié)果表明，對于骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者，除了留取常規(guī)的膿液標(biāo)本外，應(yīng)盡可能選擇多種標(biāo)本以提高培養(yǎng)陽性率。MGIT 960培養(yǎng)可以作為首選的細(xì)菌學(xué)診斷方法，但如果再聯(lián)合使用改良羅氏培養(yǎng)和PCR擴(kuò)增技術(shù)，能夠進(jìn)一步提高檢出陽性率。

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