響應(yīng)面分析法優(yōu)化麥麩酯酶雙水相萃取的條件

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(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安 625014; 2. 攀枝花市食品藥品檢驗(yàn)所,四川攀枝花 617000)

麥麩是小麥加工的副產(chǎn)品,在加工中其產(chǎn)量將近小麥加工量的20%[1]。我國(guó)每年小麥面粉廠(chǎng)加工出的麥麩可達(dá)2000萬(wàn)t以上,但大多數(shù)都只是被作為飼料原料而直接利用[2],經(jīng)濟(jì)價(jià)值低。而谷物皮層具有重要的營(yíng)養(yǎng)學(xué)特性[3]。植物酯酶(plant esterase,PE),屬于羧酸酯水解酶類(lèi),為親水性蛋白質(zhì),存在于植物各個(gè)部位、不同發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞中[4],主要存在于小麥、玉米、大豆等谷物中[5]。其等電點(diǎn)約為4. 2[6 - 8],最適pH為6. 5,最適溫度為45℃,在40℃以下,pH6. 5 ～ 8. 0之間有較好的穩(wěn)定性,其活性可被某些金屬離子抑制,而在有機(jī)溶劑中有較好的耐受能力[9]。植物酯酶可作為農(nóng)藥殘留檢測(cè)的三種酶標(biāo)記物之一,而且其與膽堿酯酶相比,具有來(lái)源廣泛,價(jià)格低廉,檢測(cè)時(shí)間短,檢測(cè)靈敏性好,檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn),得到廣泛關(guān)注[10]。

雙水相萃取系統(tǒng)是由水溶性的兩種聚合物或一種水溶性聚合物與一種鹽和水構(gòu)成的三組分雙相體系[11]。雙水相萃取技術(shù)易于操作、設(shè)備簡(jiǎn)單,更重要的是雙水相萃取避免了傳統(tǒng)液 - 液萃取中生物活性物質(zhì)與有機(jī)溶劑的直接接觸,保護(hù)了其活性。并且雙水相體系的生物親和性,可以使初步純化的蛋白質(zhì)直接用于后續(xù)研究中,使操作趨于簡(jiǎn)便。所以其應(yīng)用前景廣闊,尤其是在酶的分離純化方面得到了越來(lái)越多的關(guān)注[12 - 15]。本研究采用PEG/鹽雙水相萃取技術(shù)純化麥麩酯酶,通過(guò)對(duì)成相物質(zhì)、成相物質(zhì)濃度、pH、離子強(qiáng)度等因素的考察,探討對(duì)麥麩酯酶的總蛋白分配系數(shù)、酶活回收率、純化倍數(shù)的影響,采用響應(yīng)面法優(yōu)化萃取條件,建立一種簡(jiǎn)單可行的純化麥麩酯酶的方法。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1. 1. 1 主要材料 麥麩(雅安市售普通麥麩);聚乙二醇/PEG(分子量為600、1000、2000、4000、6000) 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;考馬斯亮藍(lán) - G250 上海易利生物科技有限公司;α - 乙酸萘酯 上海億欣生物科技有限公司;固蘭B 上海江萊生物科技有限公司;牛血清白蛋白 鹽城賽寶生物科技有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS) 河南金?；?其余試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水 為超純水。

1. 1. 2 主要儀器 UV - 3100型紫外分光光度儀計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司;CP225D型電子天平,德國(guó)賽多利斯公司;HH - 2型數(shù)顯恒溫水浴鍋,江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;ST16R型冰凍離心機(jī)型,美國(guó)Thermo Fisher Sorvall公司;FW - 400A型傾斜式高速萬(wàn)能粉碎機(jī),北京中興偉業(yè)儀器有限公司;Milli - Q型超純水純化系統(tǒng),美國(guó)Millipore公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 麥麩酯酶萃取工藝流程 本研究前期已采用響應(yīng)面法優(yōu)化麥麩酯酶提取方法,確定麥麩酯酶的最佳提取方法。得出最佳提取工藝條件:NaNO3濃度0. 15mol/L、提取溫度35℃、提取時(shí)間60min,此條件下單位酶活的預(yù)測(cè)值為23338U/mL,驗(yàn)證值為23018. 7U/mL,達(dá)到預(yù)測(cè)值的98. 63%。

麥麩→粉碎→0. 15mol/L pH6. 5的NaNO3磷酸緩沖液1∶ 5(g/mL)浸提→35℃水浴60min→過(guò)濾→8000 r/min 4℃離心5min→粗酶液→雙水相萃取

1. 2. 2 雙水相相圖的制作 將不同分子量的PEG和硫酸銨制成一定濃度的原液,準(zhǔn)確稱(chēng)量一定量的PEG原液,加入三角瓶中,然后加入硫酸銨原液,混合,直至開(kāi)始出現(xiàn)混濁為止,計(jì)算加入硫酸銨的量,算出PEG和硫酸銨在系統(tǒng)中的質(zhì)量百分濃度,再加入適量(約1g)蒸餾水,使體系變澄清,計(jì)量加入蒸餾水的量,并繼續(xù)加入硫酸銨原液,使系統(tǒng)再次變混濁,如此反復(fù)操作,計(jì)算混濁時(shí)系統(tǒng)中PEG和硫酸銨在系統(tǒng)中的質(zhì)量百分含量,從而根據(jù)如下公式獲得相圖曲線(xiàn)[21]

式中:P:在某單相點(diǎn)時(shí)PEG在系統(tǒng)中的總量(g);Q:在某單相點(diǎn)時(shí)硫酸銨在系統(tǒng)中的總量(g);W:在某單相點(diǎn)時(shí)水在系統(tǒng)中的總量(g);X:在某單相點(diǎn)時(shí)PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù);Y:在某單相點(diǎn)時(shí)硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1. 2. 3 酶活力的測(cè)定

1. 2. 3. 1 α - 萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 將0. 25mL不同濃度α - 萘酚標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到4. 5mL pH7. 2的磷酸氫鈉緩沖液中,40℃恒溫水浴8min,取出加入0. 25mL 0. 03%固蘭B鹽溶液,再加入0. 25mL 4. 25%SDS溶液搖勻,加入0. 25mL 1∶ 1鹽酸溶液后在599nm處讀取OD值,用未加α - 萘酚標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白。以α - 萘酚濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),結(jié)果Y=834. 57X - 0. 1272。

麥麩酯酶酶活性單位定義——每分鐘催化得到1μmol α - 萘酚所需的酶量定義為1U,單位為μmol/min。

1. 2. 3. 2 測(cè)定酯酶酶活力方法 在4. 25mL pH7. 2的磷酸緩沖液中加入0. 2mL按一定比例稀釋的酶液,再加入0. 25mL濃度為8×10-4mol/L的α - 乙酸萘酯溶液,混合均勻后在40℃的恒溫水浴中預(yù)熱5min,依次加入0. 25mL 4. 25%SDS水溶液和0. 25mL 0. 03%固蘭B鹽溶液混合均勻且反應(yīng)終止,最后加0. 25mL 1∶ 1鹽酸溶液。以不加底物(α - 乙酸萘酯)的溶液作空白,用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè),在波長(zhǎng)599nm測(cè)定吸光度值。實(shí)驗(yàn)管減去對(duì)照管的吸光度值,其差值可根據(jù)α - 萘酚標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)查找含量值。

樣品中麥麩酯酶酶活力(U)=(C1- C2)×N×V1/5×V2

式中:C2- 樣品中麥麩酯酶濃度(μmol/mL);C1- 空白對(duì)照麥麩酯酶濃度(μmol/mL);V1- 反應(yīng)液總體積(mL);V2- 樣品反應(yīng)時(shí)所吸稀釋液的體積(mL);N - 酶液稀釋倍數(shù);5 - 測(cè)定反應(yīng)時(shí)間為5min。

1. 2. 4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn),參照考馬斯亮藍(lán)G - 250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[16]。

1. 2. 5 雙水相體系的操作 準(zhǔn)確稱(chēng)取2gPEG和1. 5g無(wú)機(jī)鹽于帶刻度的離心管中,加適量水,室溫下在漩渦混勻器上混合10min至充分溶解,再加入1mL粗酶液,用蒸餾水調(diào)至10g,混勻后2000r/min 4℃離心5min。分別測(cè)定上下相體積、酶活和蛋白含量,同時(shí)測(cè)定未經(jīng)雙水相處理的原酶液酶活和蛋白含量,按以下公式進(jìn)行計(jì)算。

相比(R)=上相體積/下相體積

分配系數(shù)(K)=上相酶活/下相酶活

回收率(Y)=RK/(1+RK)

比酶活=酶活/蛋白含量

純化倍數(shù)=上相比酶活/原酶比酶活

1. 2. 6 單因素實(shí)驗(yàn) 分別考察PEG相對(duì)分子量和濃度、無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)和濃度、pH及外加無(wú)機(jī)鹽6個(gè)因素對(duì)麥麩酯酶萃取效果的影響,以麥麩酯酶的總蛋白分配系數(shù)、酶活回收率、純化倍數(shù)為指標(biāo),各水平重復(fù)3次,單因素實(shí)驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

1. 2. 7 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box - Benhnken中心組合原理,確定實(shí)驗(yàn)的因素與水平,以純化倍數(shù)為響應(yīng)值。利用Design Expert 7. 0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),從而得出各因素之間的最佳組合。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3組平行,取其平均值,中心組合實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 Factors and levels in the center composite design

表1 單因素實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded levels for independent variables used in one - factor - at - a - time design

2 結(jié)果與分析

2.1PEG/(NH4)2SO4雙水相系統(tǒng)相圖

圖1為5種不同平均分子量的PEG和(NH4)2SO4組成的雙水相系統(tǒng)相圖。由于萃取是在兩相條件下進(jìn)行的,所以選擇在雙節(jié)線(xiàn)上方的質(zhì)量百分點(diǎn)作為參考條件。當(dāng)(NH4)2SO4濃度一定時(shí),隨著PEG相對(duì)分子質(zhì)量的增大,形成雙水相體系所需PEG的濃度降低。其原因可能是PEG相對(duì)分子質(zhì)量越大,其憎水程度越強(qiáng),且加大其與(NH4)2SO4分相的動(dòng)力,導(dǎo)致臨界分相濃度降低。

圖1 雙水相相圖Fig. 1 Two - phase aqueous diagram

2.2雙水相體系的優(yōu)化

由于核酸與多糖多分配于鹽相,并且高鹽濃度易造成酶失活,因此目標(biāo)酶分配系數(shù)高的體系更有利于酶的分離。本研究目的是對(duì)麥麩酯酶進(jìn)行分離純化,因此對(duì)麥麩酯酶純度要求高,在選擇分離體系時(shí)應(yīng)優(yōu)先考慮比酶活與純化倍數(shù),同時(shí)適當(dāng)?shù)幕厥章室彩呛罄m(xù)實(shí)驗(yàn)的保障。

2. 2. 1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2. 2. 1. 1 無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)對(duì)萃取效果的影響 本實(shí)驗(yàn)選擇20%(m/m)PEG 1000分別與質(zhì)量濃度均為15% MgSO4、(NH4)2SO4、NaH2PO4、Na2SO4組成雙水相體系,測(cè)定純化倍數(shù)、分配系數(shù)和回收率(體系pH為自然pH,約4. 3)。如圖2所示,PEG 1000/(NH4)2SO4組成的雙水相體系的分配系數(shù)均顯著高于其他體系,回收率和純化倍數(shù)也略高于其它體系,且(NH4)2SO4分相速度快,故選擇(NH4)2SO4與PEG組成雙水相體系成相物質(zhì)。

圖2 無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)對(duì)萃取效果的影響Fig. 2 Effect of inorganic salts on the extraction efficiency

2. 2. 1. 2 PEG相對(duì)分子量對(duì)萃取效果的影響 圖3為20%(m/m)分子量為600、1000、2000、4000、6000PEG分別與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的(NH4)2SO4組成雙水相體系時(shí),麥麩酯酶在兩相間純化倍數(shù)、分配系數(shù)和回收率的變化趨勢(shì)(體系pH為自然pH,約4. 3)。結(jié)果表明,PEG1000體系對(duì)麥麩酯酶萃取的純化倍數(shù)最大,雖然分配系數(shù)和回收率較PEG 600體系略低,但是差異并不明顯。與PEG 1000相比,分子量為2000、4000、6000組成的PEG/(NH4)2SO4體系的萃取效果顯著下降,且隨著分子量的增大,各項(xiàng)指標(biāo)均呈下降趨勢(shì)。這是由于低分子量的PEG親水性較強(qiáng),隨著PEG分子量的增大,其親水性降低,而酯酶是親水性的蛋白質(zhì),大量的水被分配到了無(wú)機(jī)鹽相中,導(dǎo)致PEG相中的酯酶減少。綜合考慮,選擇PEG1000與(NH4)2SO4構(gòu)成雙水相萃取體系。

圖3 PEG相對(duì)分子量對(duì)萃取效果的影響Fig. 3 Effect of relative molecular weight of PEG on the extraction efficiency

2. 2. 1. 3 無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)萃取效果的影響 圖4為20%(m/m)PEG1000與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12、14、16、18、20%(NH4)2SO4組成雙水相系統(tǒng)(體系pH為自然pH,約4. 3)。由圖4可知,(NH4)2SO4濃度對(duì)麥麩酯酶的回收率并沒(méi)有顯著影響。在鹽濃度較低的情況下,隨著鹽濃度的增大,純化倍數(shù)和分配系數(shù)呈升高的趨勢(shì),此時(shí)雙水相體系對(duì)麥麩酯酶選擇性逐漸增強(qiáng);但是當(dāng)鹽濃度超過(guò)18%(m/m)后,純化倍數(shù)和分配系數(shù)均顯著降低,可能是因?yàn)轶w系中鹽濃度過(guò)大,上相中含鹽量增加,抑制了酶的活性。故選擇18%(m/m)(NH4)2SO4與PEG 1000構(gòu)成的雙水相體系。

圖4 無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)萃取效果的影響Fig. 4 Concentration of(NH)2SO4 on the extraction efficiency

2. 2. 1. 4 PEG濃度對(duì)萃取效果的影響 圖5為18%(m/m)(NH4)2SO4與質(zhì)量濃度為16%、18%、20%、22%、24% PEG1000組成雙水相系統(tǒng)(體系pH為自然pH,約4. 3)。由圖5可知,當(dāng)PEG濃度較低時(shí),純化倍數(shù)和分配系數(shù)隨著PEG濃度的增大而增大;但當(dāng)PEG濃度超過(guò)22%時(shí),純化倍數(shù)和分配系數(shù)反而下降,可能是由于濃度過(guò)大,導(dǎo)致相界面張力與相粘度增大,不利于麥麩酯酶進(jìn)入PEG相。但由于PEG濃度越大,上相體積也顯著增大,雖然單位體積的酶活降低,但酶活回收率變化不大,甚至略有增加。因此,選擇22%(m/m)PEG1000與18%(m/m)(NH4)2SO4構(gòu)成的雙水相體系。

圖5 PEG濃度對(duì)萃取效果的影響Fig. 5 Concentration of PEG on the extraction efficiency

2. 2. 1. 5 pH對(duì)萃取效果的影響 體系的pH影響蛋白質(zhì)和酯酶在溶液中的解離度,引起蛋白質(zhì)和酶的電荷性改交;另一方面,體系pH的改變,也會(huì)引起成相物質(zhì)分子和相界面的電位差變化,導(dǎo)致麥麩酯酶與成相物質(zhì)分子間作用變化,使分配系數(shù)K發(fā)生變化。不同pH對(duì)麥麩酯酶分配的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知,分配系數(shù)和回收率隨pH變化并無(wú)明顯規(guī)律,在pH4. 5時(shí)達(dá)到最大,此時(shí)分離效果最好。其原因是帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)更優(yōu)先選擇上相,而帶正電荷的蛋白質(zhì)通常分配到下相,植物酯酶的等電點(diǎn)約為4. 2,在pH4. 5時(shí),蛋白質(zhì)電荷呈負(fù)電性,酯酶和PEG分子之間的作用增強(qiáng),故麥麩酯酶的分配系數(shù)增加。pH對(duì)純化倍數(shù)的影響無(wú)明顯的規(guī)律性,當(dāng)pH4. 5時(shí),純化倍數(shù)最大;隨著pH的增大,純化倍數(shù)降低。綜合考慮選擇pH4. 5作為萃取的最佳酸度條件。

圖6 pH對(duì)萃取效果的影響Fig. 6 pH on the extraction efficiency

2. 2. 1. 6 離子強(qiáng)度對(duì)萃取效果的影響 在雙水相體系中適當(dāng)增加離子強(qiáng)度,由于陰、陽(yáng)離子在兩相中的分配差異,形成穿過(guò)相界面的電位,從而影響帶電大分子物質(zhì)在兩相中的分配,強(qiáng)化分配效率,從而加快分配速度,因此一般選擇加入中性鹽。參考其它酶類(lèi)雙水相萃取條件并結(jié)合實(shí)驗(yàn)條件[17 - 19],選擇加入中性鹽NaCl。如圖7所示,麥麩酯酶的純化倍數(shù)、分配系數(shù)和回收率均隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而降低,所以本體系中添加NaCl反而不利于得到好的萃取效果。分析原因可能是由于Na+與Cl-在兩相分配情況不同,從而引起兩相電位差的變化所致;另外離子強(qiáng)度影響酶的表面疏水性,擾亂雙水相系統(tǒng),改變各相中物質(zhì)的組合和相體積比,這種相性質(zhì)的改變直接影響酶的萃取效果。外加NaCl對(duì)麥麩酯酶在該雙水相體系中的影響作用是復(fù)雜的,在本實(shí)驗(yàn)的條件下,外加鹽NaC1對(duì)植物酯酶的分配是不利的,故選擇雙水相體系中不加入NaCl。

圖7 外加無(wú)機(jī)鹽對(duì)萃取效果的影響Fig. 7 Concentration of NaCl on the extraction efficiency

2. 2. 2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2. 2. 2. 1 模型建立及其顯著性分析 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用響應(yīng)面方法進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。根據(jù)Box - Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理,以純化倍數(shù)為響應(yīng)值,在PEG1000/(NH4)2SO4體系基礎(chǔ)上,對(duì)PEG濃度(m/m)(X1)、(NH4)2SO4濃度(m/m)(X2)和pH(X3)設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)面因素水平編碼表見(jiàn)表2、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。利用Design -Expert統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合,由Box - Benhnken程序計(jì)算得到回歸方程:

表3 Box - Benhnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表Table 3 Box - Benhnken experimental design matrix and experimental results

表4 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 4 Analysis of varianc and significance test of the regression model

注:* *顯著性在0. 01水平;*顯著性在0. 05水平。

純化倍數(shù)(Y)=2. 92 - 0. 025X1- 9. 409×10-4X2-0. 1X3+0. 011X1X2- 0. 013X1X3+0. 022X2X3- 0. 036X12- 0. 041X22- 0. 21X32

2. 2. 2. 2 各因素交互作用對(duì)純化倍數(shù)的影響 響應(yīng)面等高線(xiàn)圖能夠直觀(guān)地反映出各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響,圓形表示二因素交互作用不顯著,橢圓形表示二因素交互作用顯著。如圖8a所示,沿PEG濃度軸向等高線(xiàn)變化密集,而(NH4)2SO4濃度軸向等高線(xiàn)相對(duì)稀疏,說(shuō)明PEG濃度對(duì)純化倍數(shù)的影響比(NH4)2SO4濃度大;如圖8b和圖8c所示,沿pH軸向等高線(xiàn)變化密集,而PEG和(NH4)2SO4濃度軸分別向等高線(xiàn)相對(duì)稀疏。由此可知,pH對(duì)雙水相萃取酯酶的純化倍數(shù)影響最為顯著,PEG濃度與(NH4)2SO4濃度次之。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Validation of reliability of optimal sedimentation conditions

圖8 各兩因素交互作用對(duì)麥麩酯酶純化倍數(shù)影響的響應(yīng)面圖Fig. 8 Response surface and contour plots for the effect of warious parameters on purification factor

對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo),分別為X1=21. 4,X2=17. 8,X3=4. 38,即最佳萃取條件為:PEG濃度21. 4%,(NH4)2SO4濃度17. 8%,pH4. 38,雙水相萃取麥麩酯酶的純化倍數(shù)為2. 9208。結(jié)合實(shí)際情況考慮,將實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整后進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),在PEG濃度為21%,(NH4)2SO4濃度18%,pH為4. 4,純化倍數(shù)為2. 9190,與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0. 06%,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)計(jì)理論值基本吻合。這說(shuō)明,響應(yīng)面分析法能優(yōu)化麥麩酯酶雙水相萃取條件因素,利用響應(yīng)面優(yōu)化得到的實(shí)驗(yàn)參數(shù)真實(shí)可靠。

2. 2. 3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 對(duì)回歸方程的合適性和有效性進(jìn)行驗(yàn)證,選取未經(jīng)雙水相萃取的粗提取原酶液和最優(yōu)條件組進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表5。通過(guò)與粗酶液比較,發(fā)現(xiàn)萃取后的酶液總酶活與比酶活均明顯增大,說(shuō)明PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系萃取麥麩酯酶是可行的。回歸方程預(yù)測(cè)雙水相萃取純化倍數(shù)可達(dá)到2. 9208,三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的平均純化倍數(shù)為2. 9190±0. 0068,與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0. 06%,證明通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化后得出的回歸方程具有實(shí)踐指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論與討論

3.1姜彬等[17]運(yùn)用PEG1000/NaH2PO4雙水相體系萃取小麥酯酶,利用單因素實(shí)驗(yàn)選擇的萃取體系為:PEG1000與NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為23%和16%、pH4。相較于本文采用響應(yīng)面法優(yōu)化的麥麩酯酶萃取體系存在一定差異,分析可能由于酯酶來(lái)源不同有關(guān)。

3.2PEG/鹽體系萃取效果雖然不及高聚物/高聚物體系(一般為高聚物/高聚物體系的1/3 ～ 1/5),但其價(jià)格便宜,因此在酶的分離純化中應(yīng)用較多。孟玲等[20]采用27%(m/m)PEG與13%(m/m)(NH4)2SO4萃取面粉中的植物酯酶,表明酶液的純化效果好。謝芳等[21]選擇30%(m/m)PEG及10%(m/m)(NH4)2SO4雙水相萃取技術(shù)分離提取生姜中生姜蛋白酶,結(jié)果表明該方法能快速純化生姜蛋白酶。Sarote Nitsawang等[22]利用8%(m/m)PEG/15%(m/m)(NH4)2SO4組成的雙水相體系從番木瓜乳漿中萃取木瓜蛋白酶,表明該方法能在較短的時(shí)間內(nèi)獲得高純度的木瓜蛋白酶并且不會(huì)破壞酶的成分。因此PEG/鹽萃取體系相比于高聚物/高聚物體系成本低,在酶的純化方面應(yīng)用前景廣闊,具有工業(yè)應(yīng)用意義。

3.3本研究在確定PEG1000/(NH4)2SO4體系的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box - Benhnken中心組合原理,以PEG濃度(m/m)(X1)、(NH4)2SO4濃度(m/m)(X2)和pH(X3)為自變量,以純化倍數(shù)(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平共15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。結(jié)合實(shí)際操作的可行性,最佳雙水相萃取麥麩酯酶工藝條件修訂為:21%PEG1000(m/m)、18%(NH4)2SO4(m/m)、pH4. 4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果純化倍數(shù)可達(dá)2. 9190。本實(shí)驗(yàn)確立了PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系萃取麥麩酯酶的最佳條件,為麥麩酯酶的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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