大豆硬實(shí)形成機(jī)制與破除技術(shù)的研究進(jìn)展

孫星邈，王 政，李曙光，孟凡凡，王曙明，張井勇

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所/大豆國(guó)家工程研究中心，長(zhǎng)春 130033）

硬實(shí)（硬粒hard seed，Hardseededness）是種子休眠類型之一，在植物種子中廣泛存在，農(nóng)作物中最常見于豆科作物。硬實(shí)是指由于種皮致密、不透水或透水性差而不能吸脹發(fā)芽，又被稱為不透水或石種子（impermeable or stone seeds）。

在大多數(shù)情況下，硬實(shí)并非人們所需要的特性，大豆硬實(shí)種子即使經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間浸種或在合適的溫濕度條件下，長(zhǎng)達(dá)8d時(shí)間種子仍不能吸收水分發(fā)芽，這樣就會(huì)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中嚴(yán)重影響播種品質(zhì)，導(dǎo)致發(fā)芽延遲，出苗率差，出苗不整齊，進(jìn)而造成田間保苗密度不同，易于滋生雜草，最終降低了收獲產(chǎn)量[1-2]；并且連作時(shí)會(huì)造成后作大豆種子混雜。此外，在大豆食品加工利用過程中，硬實(shí)不僅會(huì)影響全粒用型（whole-soy foods）大豆，如豆芽、納豆、烘烤型大豆食品的感觀品質(zhì)，而且會(huì)降低大豆原料在豆腐、味噌（miso，日本豆面醬）、豆?jié){與醬油等（cracked-soy foods）加工過程中的碾磨品質(zhì)，剔除硬實(shí)種子必然會(huì)提高成本[3-4]。因此，在育種實(shí)踐中，育種者傾向于選育非硬實(shí)的大豆品種。

然而，在收獲時(shí)遇到高溫多雨天氣，以及對(duì)于大豆貯藏、運(yùn)輸和種質(zhì)資源保存而言，由于硬實(shí)大豆質(zhì)地堅(jiān)硬種子不易吸收水分，有利于延緩種子劣變、生活力下降，通過將硬實(shí)基因引入某些品種，增強(qiáng)種皮保護(hù)作用延緩種子老化變質(zhì)[5]，使得利用硬實(shí)特性成為保存種質(zhì)資源的途徑之一[6]。

針對(duì)硬實(shí)在生產(chǎn)實(shí)踐、食品加工過程中存在的弊端，以及硬實(shí)在防止種子發(fā)生劣變方面的優(yōu)勢(shì)，從大豆硬實(shí)發(fā)生的原因與影響因素，解除方法以及應(yīng)用潛力方面進(jìn)行討論。

1 大豆硬實(shí)發(fā)生的原因與影響因素

1.1 大豆硬實(shí)的發(fā)生原因

大豆的種皮、種臍、合點(diǎn)、種孔等均與硬實(shí)的形成密切相關(guān)。

種皮的影響作用最大，其中種皮厚度影響不大，種皮滲透性影響起主要作用。大豆種皮從外到里依次由角質(zhì)層，表皮層，表皮下層以及薄壁細(xì)胞層組成。其中，角質(zhì)層通常由沉積在種子表面的蠟質(zhì)、脂質(zhì)半纖維素或果膠質(zhì)組成[7]，一定程度上阻礙種子的吸水。Ma等報(bào)道了大豆可滲透性種子（正常）與不滲透性種子（硬實(shí)）的關(guān)鍵區(qū)別，是種子最外面的連續(xù)性角質(zhì)層是否完整[8]。利用掃描電子顯微鏡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)可滲透性種子的角質(zhì)層存在細(xì)微的裂痕，大多數(shù)裂縫在于種子背側(cè)，吸脹時(shí)一般是種皮背側(cè)首先出現(xiàn)皺縮；而硬實(shí)種子的角質(zhì)層保持完整，沒有裂痕，使得水分不能通過種皮的角質(zhì)層。此外角質(zhì)層之下的表皮層又稱柵欄層，其細(xì)胞內(nèi)的纖維質(zhì)物質(zhì)及栓化層可在柵欄層外端形成致密區(qū)域，對(duì)種皮的不透性具有重要作用[9-11]。Meyer等進(jìn)一步證實(shí)種皮缺乏透性是硬實(shí)種子吸取水分的限制因素[2]，硬實(shí)種子種皮的導(dǎo)水率小于非硬實(shí)的導(dǎo)水率；除去種皮后，硬實(shí)與非硬實(shí)種子單獨(dú)的種胚吸收水分的速率相當(dāng)。

當(dāng)處于潮濕條件時(shí)，種子種臍、合點(diǎn)、種孔等結(jié)構(gòu)關(guān)閉會(huì)阻止外界水分和水汽進(jìn)入，這是形成種子硬實(shí)的另一主要原因[10,12]。種臍是鑒別豆科種子穩(wěn)定的重要特征，臍縫處可能有兩層?xùn)艡趯蛹?xì)胞，其中一層位于角質(zhì)層外側(cè)，稱為反向柵欄層，他會(huì)形成一個(gè)控制水分進(jìn)出的閥門結(jié)構(gòu)，只允許水分散出而阻止其進(jìn)入。朱麗偉等證明不論在何種相對(duì)濕度條件下[13]，硬實(shí)種子的種臍臍縫寬度均顯著小于非硬實(shí)種子，且隨環(huán)境改變硬實(shí)種子的臍縫變化幅度小于非硬實(shí)種子。

大豆種皮中較高的鈣質(zhì)含量也是形成硬實(shí)的重要原因之一。Chen等證明種皮鈣質(zhì)含量與種子硬實(shí)呈正相關(guān)[14]，但是受到土壤類型、溫度變化等環(huán)境影響而表現(xiàn)不一致。朱麗偉等對(duì)多種豆科植物硬實(shí)種子研究也發(fā)現(xiàn)硬實(shí)種皮中的大部分礦質(zhì)元素（Mg、Al、Si、K、Ca、Fe、Cu、Zn等）含量均顯著高于非硬實(shí)種子[13]，推測(cè)高的礦質(zhì)元素含量增加了硬實(shí)種子的耐壓能力，種皮不易產(chǎn)生裂縫，進(jìn)而降低了滲水性形成硬實(shí)。

1.2 大豆硬實(shí)的影響因素

大豆種子的硬實(shí)形成受內(nèi)部因素和外部因素的共同制約。內(nèi)因主要為種子成熟程度和自身遺傳因素；外因包括成熟過程中土壤水分和養(yǎng)分供應(yīng)情況以及收獲之后貯藏、運(yùn)輸過程中的空氣相對(duì)濕度和溫度變化等外界環(huán)境因子。

1.2.1 影響硬實(shí)內(nèi)部因素 硬實(shí)的形成和種子本身的成熟度有關(guān)，未充分成熟的種子不會(huì)發(fā)生硬實(shí)，硬實(shí)是種子成熟到一定程度才出現(xiàn)的，這一現(xiàn)象與種子的含水量有關(guān)。隨著種子的不斷成熟，含水量逐漸降低，種皮外層的厚壁柵欄細(xì)胞開始發(fā)育，種皮逐漸硬化，完全成熟時(shí)柵欄細(xì)胞收縮引起硬實(shí)產(chǎn)生[12]，許多豆科植物均在此時(shí)產(chǎn)生休眠[15-16]。

研究表明這一系列的變化受遺傳控制，但在顯隱性關(guān)系和基因數(shù)目上結(jié)論均存在爭(zhēng)議。早期研究認(rèn)為種子的吸水性至少是部分顯性或?yàn)?個(gè)顯性單基因控制；Kilen和Hartwig利用大豆“Tracy”（非硬實(shí)）דD67-5679”（硬實(shí)）正反交組合[17]，認(rèn)為硬實(shí)受3個(gè)主基因控制，軟實(shí)對(duì)硬實(shí)為顯性；Verma和Ram對(duì)6個(gè)親本正反交各自產(chǎn)生的F1、F2、F3代籽粒進(jìn)行種子滲透性分析[18]，同樣認(rèn)為軟實(shí)對(duì)硬實(shí)為顯性，但不同組合受不同數(shù)目的顯性基因控制。張?zhí)降妊芯緿86-4448（硬粒）×商用大豆品種A6297（正常粒）的F2群體則認(rèn)為，硬粒性狀受2個(gè)主基因控制，基因間有累加效應(yīng)，硬實(shí)為顯性。Shahi和Pandey認(rèn)為該性狀受1個(gè)基因控制[19]，但顯隱關(guān)系研究與選用品種有關(guān)，亞種間雜交時(shí)，硬實(shí)為顯性，品種間雜交時(shí)，硬實(shí)為隱性。因此在經(jīng)典遺傳學(xué)水平研究硬實(shí)，由于試驗(yàn)材料遺傳背景不同，得出的結(jié)果有較大差異，同時(shí)也說明了硬實(shí)性狀受基因控制的復(fù)雜性。

隨著分子遺傳研究的開展，硬實(shí)逐漸被作為復(fù)雜數(shù)量性狀進(jìn)行研究，Keim等在亞種間雜交時(shí)[20]，5個(gè)RFLP標(biāo)記以及這些標(biāo)記間上位性互作可以解釋71%的硬實(shí)遺傳變異，鑒定了i位點(diǎn)（QTL）可解釋該分離群體32%的遺傳變異；Zhang等利用874個(gè)SSR標(biāo)記發(fā)現(xiàn)了多環(huán)境下穩(wěn)定遺傳的2個(gè)QTL（Ha1和Ha2）[4]，分別位于LGL、D1a連鎖群上，目前正在多個(gè)遺傳背景下進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 影響硬實(shí)外部因素 大豆生長(zhǎng)后期的環(huán)境，包括地區(qū)的氣候、降雨、灌溉、太陽(yáng)光輻射和土壤鈣質(zhì)含量等因素均會(huì)影響硬實(shí)的發(fā)生。結(jié)莢鼓粒期是大豆需水的關(guān)鍵期，高溫干旱不僅會(huì)影響水分吸收和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累，造成高溫逼熟，飽滿度差，落莢嚴(yán)重，豆莢空癟率高，大豆減產(chǎn)嚴(yán)重，而且會(huì)大大增加硬實(shí)率，Vieira等在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下大豆硬實(shí)種子比例增加[21]，這一現(xiàn)象在小粒型種子中尤為明顯，成熟時(shí)干旱會(huì)使種子的萌發(fā)推遲3d左右。馬盾和劉健研究顯示秋大豆一般比夏大豆硬實(shí)多[22]，推測(cè)也是由秋大豆在干燥季節(jié)成熟引起?；谟矊?shí)對(duì)干旱條件的敏感，灌溉條件也會(huì)對(duì)硬實(shí)產(chǎn)生明顯影響，季良和張振泰對(duì)北疆地區(qū)灌水模式進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)[23]，灌水量和灌水次數(shù)均會(huì)影響大豆硬實(shí)情況，即較少灌水量對(duì)大豆硬實(shí)形成影響顯著，在同一灌水次數(shù)下，灌水量越大，硬實(shí)率越低，偏旱年份灌水量對(duì)硬實(shí)率的影響大于灌水次數(shù)。另外土壤中鈣質(zhì)含量高，硬實(shí)就多；鈣質(zhì)含量少，硬實(shí)種子就少[12]。太陽(yáng)光輻射時(shí)間越長(zhǎng)，強(qiáng)度越大，硬實(shí)率也越高[24]。

成熟收獲后的貯藏條件也會(huì)對(duì)硬實(shí)形成產(chǎn)生重要影響，濕度與溫度是貯藏中形成硬實(shí)的2個(gè)最重要的外部因素。非硬實(shí)的種子，隨著進(jìn)一步干燥，會(huì)造成二次休眠，因此貯藏時(shí)相對(duì)濕度降低會(huì)增加種子硬實(shí)率，在菜豆冬季貯藏試驗(yàn)中，當(dāng)含水量由16%降到10%時(shí)，有近半數(shù)的種子會(huì)形成硬實(shí)[25]。這種現(xiàn)象可能是因?yàn)楹拷档涂墒狗N皮柵狀細(xì)胞更加收縮，結(jié)構(gòu)更為緊密造成的。除干燥條件會(huì)影響種子的休眠和硬實(shí)外，恒溫貯藏時(shí)，溫度較高則休眠率下降較快[26]。

2 大豆硬實(shí)的破除方法

2.1 機(jī)械劃破種皮

采用機(jī)械處理的方式擦破種皮可能是最為普遍的處理硬實(shí)種子的方法，劃破種皮使得空氣和水分能夠透過種皮，促使種子快速吸水和萌發(fā)。當(dāng)處理少量的大粒種子時(shí)，可以在除種臍以外種皮上側(cè)向切掉一小塊至露出子葉，李忠賢利用刀片劃破硬實(shí)大豆種皮[27]，除個(gè)別種子霉?fàn)€外，平均發(fā)芽率達(dá)到96%以上，由此說明機(jī)械方法對(duì)于破除硬實(shí)效果明顯。批量處理也可在采用砂紙磨擦、在研缽中與粗砂混勻研磨及機(jī)械磨擦的方法，但處理程度應(yīng)損傷種皮但不傷及種胚部位，因此不宜處理大批量大粒種子。在處理批量的種皮較薄的小種子可選用硬實(shí)種子碰撞機(jī)、小型種子磨擦機(jī)、電動(dòng)磨米機(jī)等磨傷種皮打破硬實(shí)[28]。

2.2 溫度處理

溫度的變化可改變大豆種皮透性，可破除休眠并改變發(fā)芽率。將種子置于高溫（熱水）中一段時(shí)間后冷卻是破除休眠的主要方法之一。但每一種豆科植物種子都存在一個(gè)休眠破除的臨界溫度[29]，因此處理的具體時(shí)間和溫度需根據(jù)種子大小與種皮厚度而定。除高溫處理外，低溫處理也可破除硬實(shí)、結(jié)束休眠；具體方法包括冷凍處理和低溫層積。冷凍處理后可改變種皮透性，也可用液態(tài)氮處理；低溫層積是將種子在較低溫度下置于濕潤(rùn)的發(fā)芽床或其他基質(zhì)中層積處理，可在豆科牧草打破硬實(shí)過程中應(yīng)用，鄭月萍對(duì)野生大豆研究也發(fā)現(xiàn)，4℃的層積處理80d可顯著破除種子硬實(shí)，萌發(fā)率顯著上升。

2.3 干濕交錯(cuò)處理

將浸泡和干燥交錯(cuò)進(jìn)行，多次反復(fù)后種皮既吸脹又收縮，可破壞種皮結(jié)構(gòu)，提高種皮透性，適于處理大粒種皮較薄的硬實(shí)大豆種子。生產(chǎn)上通常是將硬實(shí)種子置于水中浸泡，白天放在太陽(yáng)下曝曬，夜間轉(zhuǎn)至涼爽處，多次反復(fù)，當(dāng)大部分種子膨脹時(shí)根據(jù)墑情播種。

2.4 化學(xué)處理

濃硫酸和高濃度NaOH可以腐蝕局部種皮，增大種皮的透性，有效打破種子休眠，其中濃硫酸處理較為常用?；瘜W(xué)處理方法經(jīng)濟(jì)有效，但由于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿對(duì)種胚的腐蝕傷害，應(yīng)用此方法存在3點(diǎn)問題：（1）不同硬實(shí)種子耐受酸堿能力不同，特別是濃硫酸處理速度較快，對(duì)于種皮較薄的種子處理時(shí)間較難控制；（2）化學(xué)殘留對(duì)種子危害大，處理后的沖洗要徹底；（3）蟲害較嚴(yán)重但仍有萌發(fā)能力的種子，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿容易通過傷口傷害種子，不適用此方法。所以在批量處理種子前，一定要進(jìn)行預(yù)備試驗(yàn)，確定合適的處理時(shí)間和使用濃度，避免達(dá)不到預(yù)期效果或者傷害種子本身[12,16]。

3 大豆硬實(shí)的應(yīng)用潛力

在農(nóng)業(yè)實(shí)踐上，硬實(shí)種子堅(jiān)硬的種皮有利于種子在很長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)保持較強(qiáng)的活力，對(duì)于控制種子的休眠萌發(fā)和延長(zhǎng)種子壽命具有重要的指導(dǎo)意義。

種皮阻礙了水分和空氣的擴(kuò)散，在成熟收獲之前，遇到不良天氣情況，硬實(shí)可防止種子循環(huán)吸水和干燥；在開放貯存情況下，硬實(shí)延緩了吸取周圍環(huán)境中的水汽，而且還可以抵抗貯存時(shí)溫度和濕度的波動(dòng)對(duì)種子的損傷[30]。Heatherly等針對(duì)經(jīng)歷高溫高濕等不利存放條件[31]，普通大豆種子發(fā)芽率下降的情況，對(duì)兩地硬實(shí)大豆種子和非硬實(shí)種子試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，置于同等不利條件下20d后，非硬實(shí)種子發(fā)芽率下降超過70%，但硬實(shí)種子發(fā)芽率僅下降20%左右，證明硬實(shí)大豆種子在自然環(huán)境下可更好的保持發(fā)芽率。王金龍等試驗(yàn)驗(yàn)證了大豆種子的儲(chǔ)存壽命，證明為保證生活力非硬實(shí)種子僅可在室溫下保存2a，但硬實(shí)種子室溫貯存4a仍可保持發(fā)芽率。且硬實(shí)種子遺傳基礎(chǔ)未發(fā)生改變，不影響后代植株的植物學(xué)性狀。

因此硬實(shí)對(duì)種質(zhì)的保存是有利的，有目的地選育具有部分程度硬實(shí)的品種，可以提高種子的生活力；同時(shí)可以通過制造干燥和低溫環(huán)境形成硬實(shí)，貯藏珍貴大豆材料。

4 小結(jié)與展望

硬實(shí)是大豆種子中常見的休眠特性，種皮缺乏透性是硬實(shí)大豆形成的主因。硬實(shí)是種子處于逆境下的一種自我保護(hù)，在不同遺傳條件、大豆生長(zhǎng)后期的環(huán)境條件以及貯藏條件下有不同表現(xiàn)。在多數(shù)情況下硬實(shí)并非人們所需，加工產(chǎn)業(yè)可選用非硬實(shí)品種提高產(chǎn)品品質(zhì)并降低成本；生產(chǎn)實(shí)踐上為獲得高出苗率，除利用育種手段選育非硬實(shí)品種外，還可使用機(jī)械、溫度、干濕交錯(cuò)和化學(xué)等處理方法打破硬實(shí)大豆種子的休眠。但在種質(zhì)保存過程中可對(duì)種子硬實(shí)特性加以利用，發(fā)揮堅(jiān)硬種皮的保水作用。

在大豆研究中對(duì)硬實(shí)特性有清晰、深入的認(rèn)識(shí)可更好的解決生產(chǎn)實(shí)踐、加工和種質(zhì)保存上的諸多問題。但目前對(duì)硬實(shí)的應(yīng)用性研究多于基礎(chǔ)理論研究，而且對(duì)硬實(shí)形成的研究主要針對(duì)種子及種皮的形態(tài)結(jié)構(gòu)，對(duì)硬實(shí)的遺傳研究開展較少且結(jié)論爭(zhēng)議較大。未來的研究還需進(jìn)一步解析硬實(shí)復(fù)雜的遺傳機(jī)制，為選育硬實(shí)和非硬實(shí)品種提供更多的理論依據(jù)，更好的控制并利用這一特性。

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