土壤中微生物DNA高效提取方法的篩選

2014-03-22 19:11:50周偉黃進(jìn)勇李新偉

湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年1期

周偉+黃進(jìn)勇+李新偉

摘要：設(shè)計了3種從土壤中直接提取微生物DNA的方法，并通過PCR擴增和DGGE電泳比較了不同方法所提取DNA的質(zhì)量以及對后期分子生物學(xué)研究的適用性。結(jié)果表明，化學(xué)法和酶法相結(jié)合的提取方法所獲得的DNA完整性最好，適用于PCR擴增，并且通過DGGE電泳分離出最豐富的條帶，是一種高效的提取土壤微生物DNA的方法。

關(guān)鍵詞：土壤微生物；DNA提??；PCR；DGGE

中圖分類號：Q939.96；Q523 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）01-0216-04

Screening the Extracting Method of Total Microbial DNA from Soil

ZHOU Wei1，HUANG Jin-yong2，LI Xin-wei1

（1. Luohe Medical College of Higher Education， Luohe 462002， Henan， China；

2. Bioengineering Department， Zhengzhou University， Zhenzhou 450001， China）

Abstract： Three methods were designed to extract microbial DNA directly from the soil， and the different extraction methods were evaluated comprehensively for the DNA quality and applicability of the molecular biology by PCR and DGGE. The results suggested that the combination of enzymatic and chemical methods could obtain the highest DNA yield and integrity， which was suitable for PCR， and the most abundant bands could be obtained by DGGE. This development of the highly effective DNA extraction method provided a foundation for studying in molecular ecology of soil microbes.

Key words： soil microbe； DNA extraction； PCR； DGGE

收稿日期：2013-05-10

作者簡介：周偉（1981-），男，河南南陽人，講師，主要從事遺傳學(xué)方面的研究，（電話）13938025634（電子信箱）luohezhouwei@126.com。

微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化過程中起重要作用，目前通過純培養(yǎng)技術(shù)只能獲得土壤中僅極少數(shù)的微生物種類，不能充分體現(xiàn)微生物群落的真實組成[1]。而基于DNA分析的分子生物學(xué)技術(shù)的引入，降低了對培養(yǎng)技術(shù)的依賴性，可以直接對土壤中微生物進(jìn)行研究[2]。由于土壤中含有大量理化性質(zhì)復(fù)雜的物質(zhì)，而且微生物與土壤顆粒吸附緊密，不易從中提取DNA；同時土壤中微量的腐殖酸和重金屬可能抑制分子生物學(xué)操作過程中酶的活性、降低轉(zhuǎn)化效率以及DNA的雜交特異性[3，4]等。因此，從土壤樣品中高效地獲得高質(zhì)量的DNA是后期土壤微生物分子生物學(xué)研究的前提。

土壤中微生物DNA提取的關(guān)鍵在于細(xì)胞的裂解，本研究通過對不同的裂解手段進(jìn)行組合，設(shè)計了3種從土壤中直接提取微生物總基因組DNA的方法并對后期擴增效果進(jìn)行比較分析，以期建立一種高效、簡便的土壤微生物DNA提取方法，為分子水平上研究土壤微生物提供參考。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

2011年在河南省漯河市孟廟鎮(zhèn)進(jìn)行取樣。供試土壤取自常年以冬小麥-春玉米茬口種植的農(nóng)田，秸稈全部還田，采用五點取樣法取土樣，取樣深度為0～20 cm，混勻后于-20 ℃保存。

1.2 試劑與儀器

溶菌酶、蛋白酶K購自Sigma公司，所用maker（λ-HindⅢ digested Marke，DNA Marker DL 2000）、凝膠回收試劑盒、PCR Kit購自TaKaRa公司。TGRADIENT溫度梯度PCR儀為德國Biometra公司生產(chǎn)，全自動數(shù)碼凝膠成像與分析系統(tǒng)由天能科技（上海）有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

對提取土壤微生物DNA方法中不同的細(xì)胞裂解方式進(jìn)行組合，設(shè)計3種土壤基因組DNA的提取方法。

方法a：酶法與化學(xué)法相結(jié)合[5]。5 g土壤中加入25 μL蛋白酶K、13.5 mL TENC（50 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl、1% CTAB），混勻后置于37 ℃搖床225 r/min震蕩30 min；然后加入1.5 mL SDS混勻，65 ℃水浴震蕩2 h；6 000 r/min離心15 min，取上清液。原離心管中加入9 mL TENC、1 mL SDS，混勻后水浴1 h，6 000 r/min離心15 min，取上清液。合并所得上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇，充分混勻后10 000 r/min離心15 min，取上清液，等體積加入異丙醇，混勻后放入冰箱中4 ℃過夜，10 000 r/min離心15 min，棄上清，加入2 mL預(yù)冷的70%乙醇洗滌2次，干燥后加入500 μL TE溶解。

方法b：化學(xué)法和凍融法結(jié)合使用[6]。5 g土壤中加入20 mL TENS（50 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl、1% SDS），70 ℃水浴1 h，6 000 r/min離心10 min，取上清液。在沉淀中加入1.5 mL TEN（50 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl），放置在-20 ℃冰浴和65 ℃水浴中反復(fù)凍融，循環(huán)5次。10 000 r/min離心10 min，取上清液。合并所得上清液，后續(xù)DNA溶解步驟與方法a相同。

方法c：酶法、化學(xué)法及凍融法配合使用[7]。5 g土壤中加入10 mL PBS，混勻后置于30 ℃搖床150 r/min震蕩15 min，10 000 r/min離心20 min，棄上清液。取沉淀加裂解液Ⅰ（50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、100 mmol/L EDTA）7.5 mL，50 mg/mL溶菌酶2.5 mL，37 ℃水浴2 h，10 000 r/min離心15 min取上清液。沉淀加裂解液Ⅱ（0.15 mol/L NaCl、0.5 mol/L Tris-HCl、10% SDS）10 mL，循環(huán)放置在 -20 ℃冰浴和65 ℃水浴中反復(fù)凍融，循環(huán)3次，10 000 r/min離心15 min取上清液。合并上清液，后續(xù)DNA溶解步驟與方法a相同。

1.4 DNA質(zhì)量與純度的檢測

提取的DNA通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，120 V電泳45 min，凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照。DNA純度采用紫外分光光度計法進(jìn)行比較，將所溶解的DNA溶液分別在230、260、280 nm波長下的吸光值進(jìn)行測定。

1.5 不同提取方法對后期試驗適用性的分析

對細(xì)菌保守的16 S rDNA基因以及其V3可變區(qū)進(jìn)行擴增，并對V3可變區(qū)進(jìn)行DGGE電泳，根據(jù)PCR擴增效果以及DGGE電泳分離結(jié)果進(jìn)行比較，分析3種提取方法所獲得的DNA是否適合后期分子生物學(xué)試驗。

1.5.1 PCR擴增及電泳本試驗所用16S rDNA引物為BR8-27（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）和BL1541-1522（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA

-3′），V3可變區(qū)引物為338L（5′-CTACGGGAGGCA

GCAG-3′）/518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′），可對所有真細(xì)菌及大部分古細(xì)菌的相應(yīng)目的片段進(jìn)行有效擴增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10×PCR Buffer（含Mg+）5 μL，dNTP （2.5 mmol/L） 4 μL，引物（10 mmol/L）各1 μL，Taq酶（5 U/μL） 1 μL，土壤 DNA 1 μL，超純水定容至50 μL。16 S rDNA按以下循環(huán)程序擴增：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35次循環(huán)；72 ℃延伸5 min。V3可變區(qū)按以下循環(huán)程序擴增：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35次循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，分別取5 μL PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠上，80 V電壓下電泳15 min，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.5.2 目的片段檢測用Bio-Rad公司的D-Code system基因突變檢測系統(tǒng)對V3可變區(qū)進(jìn)行DGGE電泳分離，采用10%聚丙烯酰胺凝膠，變性劑梯度為40%～60%，加30 μL PCR產(chǎn)物，60 ℃，1×TAE，130 V電泳5 h，電泳凝膠采用銀染方法顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組總DNA提取效果

利用3種方法提取土壤微生物DNA，電泳結(jié)果顯示（圖1）：方法a所得基因組DNA在23 130 bp左右出現(xiàn)一條較亮條帶，說明提取的DNA較完整；方法b所得產(chǎn)物出現(xiàn)較大范圍的彌散，表明DNA在提取過程中發(fā)生部分?jǐn)嗔?，影響了DNA的完整性和質(zhì)量；而方法c得到的產(chǎn)物分子量低于4 000 bp，且較為分散，表明DNA在提取過程斷裂較為嚴(yán)重。

從土壤中提取的微生物DNA常含有蛋白質(zhì)和腐殖酸，影響DNA的質(zhì)量。OD260 nm/OD280 nm和OD260 nm/OD230 nm的值可分別檢測DNA中蛋白質(zhì)和腐殖酸的污染程度，一般認(rèn)為OD260 nm/OD280 nm在1.5～2.1之間，OD260 nm/OD230 nm大于2.0時說明所獲得的DNA具有較高純度。表1中結(jié)果表明，方法a提取的土壤微生物DNA OD260 nm/OD280 nm比值與理論值接近，蛋白質(zhì)污染較輕，而OD260 nm/OD230 nm偏低，說明所提取的DNA存在一定程度的腐殖酸污染。方法b和方法c所得DNA的兩項比值均低于正常值，表明提取的土壤微生物DNA中腐殖酸含量較高，蛋白污染較嚴(yán)重。另外，OD260 nm數(shù)據(jù)顯示方法a所得DNA有最大吸收值。結(jié)果表明，3種提取方法中方法a所得土壤微生物DNA的純度和含量最高。

2.2 不同方法提取的DNA擴增效果檢測

用16 S rDNA基因以及其V3區(qū)通用引物進(jìn)行PCR擴增，3種提取方法所得DNA對目的基因的擴增效果如圖2、圖3所示，方法a所提土壤微生物DNA擴增得到的PCR產(chǎn)物亮度較高，表明其產(chǎn)量及濃度較高，而方法b所提DNA擴增得到的產(chǎn)物亮度要比方法a弱很多，表明產(chǎn)物的量較少，擴增效果稍差，而方法c所得DNA擴增得到目的產(chǎn)物并沒有在電泳中觀察到，可能是由于產(chǎn)物的量過低，或沒有得到擴增，說明該方法提取的DNA質(zhì)量較差。

2.3 PCR產(chǎn)物的DGGE電泳

通過DGGE電泳對擴增得到的16 S rDNA V3可變區(qū)進(jìn)行分離，結(jié)果如圖4所示。由方法a所獲得的土壤微生物DNA經(jīng)過PCR-DGGE電泳分離，能夠得到13條不同強度的條帶，而方法b所獲得的DNA只分離出7條。通過比較可以看出，方法a所獲得的分離條帶明顯較多，且分離結(jié)果清晰，通過DGGE電泳能夠較好地體現(xiàn)土壤中細(xì)菌組成的豐富程度以及種群分布的差異，而方法b所體現(xiàn)的微生物種類相對較少，但相應(yīng)條帶所對應(yīng)的種群密度與方法a保持一致。另外，方法b提取的DNA能夠分離出方法a沒有擴增到的條帶，說明這2種提取方法對部分細(xì)菌的裂解能力存在差異。由此可以推測，不同方法對細(xì)菌DNA的提取存在一定程度的選擇性，不可能完全體現(xiàn)出土壤中所有細(xì)菌的組成。

3 小結(jié)與討論

土壤微生物DNA提取方法主要可分為細(xì)胞提取法[8]和原位裂解法[9]。細(xì)胞提取法是先將細(xì)胞從土壤中分離出來，然后通過細(xì)胞裂解提取DNA。該方法雖然可得到純度較高的DNA，但由于絕大部分細(xì)菌與土壤顆粒吸附牢固，不宜洗脫，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)量低，提取的DNA量少，反映的微生物群落具有片面性。原位裂解法是直接對土壤樣品進(jìn)行裂解提取基因組DNA，該方法提取的DNA一般產(chǎn)量較高，能夠更好地反映土壤中微生物的群落組成，但是由于在提取過程中會有一些土壤有機成分被提取出來，從而影響后期的分子生物學(xué)分析[10，11]。常用的原位裂解方法包括化學(xué)法、酶法或物理法，各種方法的作用原理不同，因而其提取效果也各有差異?；瘜W(xué)法主要通過化學(xué)試劑對細(xì)胞進(jìn)行破碎和DNA抽提，酶法主要通過酶的作用造成細(xì)胞裂解，而物理法則是通過外力作用使細(xì)胞破裂，本試驗采用的3種方法分別基于不同的裂解原理進(jìn)行組合。

在這3種裂解原理中，化學(xué)法相對溫和，但對不同類型細(xì)胞裂解能力不同；酶法對細(xì)胞破裂具有專一性，但活性易受土壤中化學(xué)成分的影響；物理方法能徹底破碎細(xì)胞，但裂解時對DNA剪切程度比較大[12，13]，本試驗的結(jié)果也證實了以上結(jié)論。化學(xué)試劑與酶的聯(lián)合使用，能夠?qū)ν寥乐械腄NA進(jìn)行有效的裂解。由于化學(xué)裂解過程比較溫和，蛋白酶不但提高了對細(xì)胞的破碎能力，又降解了部分蛋白質(zhì)，從而較好地保證了整個基因組DNA的完整性和純度。而在化學(xué)裂解過程中進(jìn)行凍融，能夠使細(xì)胞充分破碎，DNA得率較高，但同時造成DNA斷裂?；瘜W(xué)、物理和酶法聯(lián)合使用，雖然對細(xì)胞裂解效果較好，但同時使DNA片段大量斷裂，造成DNA的質(zhì)量與提取效率過低。另外，CTAB法對去除蛋白質(zhì)和其他污染物有較好的效果，使方法a所獲得的DNA純度較其他兩種方法要高。DNA質(zhì)量的差異造成了以方法a為模板的擴增效果明顯優(yōu)于其他兩種方法，擴增產(chǎn)物含量和質(zhì)量均比較高，有利于后期分析試驗的進(jìn)行。通過對3種方法提取土壤微生物DNA效果的電泳檢測比較，用2種不同引物對PCR擴增結(jié)果以及DGGE電泳結(jié)果進(jìn)行比較，表明化學(xué)法和酶法聯(lián)合使用適宜提取土壤微生物的DNA。

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（責(zé)任編輯趙娟）

2.3 PCR產(chǎn)物的DGGE電泳

3 小結(jié)與討論

在這3種裂解原理中，化學(xué)法相對溫和，但對不同類型細(xì)胞裂解能力不同；酶法對細(xì)胞破裂具有專一性，但活性易受土壤中化學(xué)成分的影響；物理方法能徹底破碎細(xì)胞，但裂解時對DNA剪切程度比較大[12，13]，本試驗的結(jié)果也證實了以上結(jié)論?；瘜W(xué)試劑與酶的聯(lián)合使用，能夠?qū)ν寥乐械腄NA進(jìn)行有效的裂解。由于化學(xué)裂解過程比較溫和，蛋白酶不但提高了對細(xì)胞的破碎能力，又降解了部分蛋白質(zhì)，從而較好地保證了整個基因組DNA的完整性和純度。而在化學(xué)裂解過程中進(jìn)行凍融，能夠使細(xì)胞充分破碎，DNA得率較高，但同時造成DNA斷裂?；瘜W(xué)、物理和酶法聯(lián)合使用，雖然對細(xì)胞裂解效果較好，但同時使DNA片段大量斷裂，造成DNA的質(zhì)量與提取效率過低。另外，CTAB法對去除蛋白質(zhì)和其他污染物有較好的效果，使方法a所獲得的DNA純度較其他兩種方法要高。DNA質(zhì)量的差異造成了以方法a為模板的擴增效果明顯優(yōu)于其他兩種方法，擴增產(chǎn)物含量和質(zhì)量均比較高，有利于后期分析試驗的進(jìn)行。通過對3種方法提取土壤微生物DNA效果的電泳檢測比較，用2種不同引物對PCR擴增結(jié)果以及DGGE電泳結(jié)果進(jìn)行比較，表明化學(xué)法和酶法聯(lián)合使用適宜提取土壤微生物的DNA。