β?欖香烯對腫瘤細胞上清液誘導的大鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細胞VEGF及VEGFR?2表達的影響

宋穎，孟曉，劉云鵬，楊向紅

（1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院病理科，沈陽110004；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院病理學教研室，河南新鄉(xiāng)453000；3.中國醫(yī)科大學附屬一院腫瘤內(nèi)科，沈陽110004）

β?欖香烯對腫瘤細胞上清液誘導的大鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細胞VEGF及VEGFR?2表達的影響

宋穎1，2，孟曉1，劉云鵬3，楊向紅1

（1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院病理科，沈陽110004；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院病理學教研室，河南新鄉(xiāng)453000；3.中國醫(yī)科大學附屬一院腫瘤內(nèi)科，沈陽110004）

目的觀察β-欖香烯對腫瘤細胞上清液誘導的大鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細胞（EPCs）血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體mRNA表達的影響，進一步探討β-欖香烯在抑制腫瘤血管形成過程中的作用。方法原代培養(yǎng)大鼠EPCs。胃腺癌細胞株SGC-7901培養(yǎng)上清液誘導EPCs 12 h后，分別用0、5、10、20 μg/mL β-欖香烯干預48 h，用20 μg/mL β-欖香烯干預0、12、24、48 h。采用RT-PCR法檢測各組EPCsVEGF和VEGFR-2的mRNA表達水平。結(jié)果隨著β-欖香烯濃度及作用時間的增加，EPCsVEGFR-2的表達明顯下降；當β-欖香烯濃度增加至10 μg/mL及作用時間延長至24 h，EPCsVEGF的表達水平較對照組明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論β-欖香烯可降低EPCsVEGF及VEGFR-2mRNA的表達水平，從而減少EPCs的動員，進一步抑制EPCs參與腫瘤血管的形成。

內(nèi)皮祖細胞；腫瘤細胞上清液；β-欖香烯；血管內(nèi)皮生長因子；血管內(nèi)皮生長因子受體2

欖香烯是從中藥溫郁金揮發(fā)油中提取的倍半萜類化合物，含β、γ、δ 3種成分，其中β-欖香烯是最主要的抗癌活性成分［1］。研究顯示，β-欖香烯對胃癌、肺癌、卵巢癌及腎癌等腫瘤具有很好的抗腫瘤性及放療增敏性［2～4］。

腫瘤細胞可分泌多種細胞因子動員內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）從骨髓進入外周血，并增殖形成血管網(wǎng)，對腫瘤細胞的生長及轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵作用。而血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體參與EPCs的動員。

本研究擬探討β-欖香烯對EPCs VEGF及血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）表達的影響，研究其能否部分抑制EPCs參與的腫瘤血管的形成。

1 材料與方法

1.1 EPCs的提取及鑒定

取4周齡Wistar大鼠（中國醫(yī)科大學動物部提供，雌雄不限），無菌條件下抽取PBS液沖洗骨髓腔，收集細胞懸液，將細胞懸液緩慢加至5 mL大鼠淋巴細胞分離液，保持兩者界面清晰，差速離心（2 000 r/min，25 min）后，吸取交界處云霧狀灰白色單核細胞層；用含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后觀察細胞貼壁狀態(tài)，棄貼壁細胞，將剩余細胞換新培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，將EPCs接種于鋪有0.2%明膠的玻片上，加入含胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d后，4%多聚甲醛固定30 min；滴加0.2% Triton，置室溫20 min；滴加一抗AC133和vWF，4℃過夜；PBS沖洗3遍，分別加入FITC和羅丹明，避光37℃孵育1 h；PBS沖洗后封片，檢測。

1.2 腫瘤細胞上清液的收集

用含5%FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)胃腺癌細胞株SGC-7901，當細胞融合達80%時，更換為無血清DMEM培養(yǎng)液，24 h后收集上清液，0.22 μ m濾膜過濾，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗分組

EPCs培養(yǎng)3 d后，加入40%體積分數(shù)腫瘤細胞上清液誘導12 h，將細胞隨機分為：（1）濃度效應組：不同濃度的β-欖香烯（0、5、10、20 μg/mL）作用48 h；（2）時間效應組：20 μg/mL β-欖香烯作用不同時間（0、12、24、48 h）。

1.4 RT-PCR法檢測EPCsVEGF及VEGFR-2mRNA的表達

用TaKaRa公司Trizol試劑盒提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計引物（表1），行RT-PCR：95℃5 min；95℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，共35個循環(huán)；最后72℃5 min。反應結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。采用凝膠成像分析系統(tǒng)進行半定量分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 EPCs的培養(yǎng)和鑒定

EPCs貼壁后3 d，細胞呈梭形，7 d形成細胞集落，14 d呈鋪路石樣形態(tài)。免疫熒光鑒定：AC133陽性細胞被標記上綠色熒光，vWF陽性細胞被標記上紅色熒光，vWF和AC133雙重標記染色陽性為黃色熒光，為正在分化的EPCs（圖1）。

圖1 AC133、vWF雙重熒光染色陽性的正在分化的EPCs×400Fig.1 Double positive staining of AC133 and vWF in differentiating EPCs×400

2.2 β-欖香烯對腫瘤細胞上清液誘導的EPCsVEGFmRNA表達的影響

RT-PCR檢測結(jié)果如圖2所示：當5 μg/mL β-欖香烯作用48 h及20 μg/mL β-欖香烯作用12 h時，VEGF的表達水平與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義；當β-欖香烯濃度增加到10 μg/mL，作用時間延長至24 h時，VEGFmRNA表達明顯下降，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.3 β-欖香烯對腫瘤細胞上清液誘導的EPCsVEGFR-2mRNA表達的影響

RT-PCR檢測結(jié)果如圖3所示：隨著β-欖香烯濃度及作用時間的增加，EPCsVEGFR-2mRNA的表達明顯下降，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 β?欖香烯對腫瘤細胞上清液誘導的EPCs VEGF mRNA表達的影響Fig.2 The effect of β?elemene on the VEGF mRNA expression of EPCs induced by tumor cells supernatant

圖3 β?欖香烯對腫瘤細胞上清液誘導的EPCs VEGFR?2mRNA表達的影響Fig.3 The effect of β?elemene on the VEGFR?2mRNA expression of EPCs induced by tumor cells supernatant

3 討論

EPCs又稱為內(nèi)皮前體細胞，可分化成為血管內(nèi)皮細胞，具有游走特性。目前認為表達CD34、VEGFR-2及AC133的細胞為EPCs。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠、家兔和人的骨髓、臍帶血及外周血中均能提取到EPCs。生理情況下，EPCs可以參與胚胎血管形成。在機體缺血或血管損傷時，EPCs可從骨髓被動員至相應部位參與血管新生，研究發(fā)現(xiàn)新生血管中約25%的內(nèi)皮細胞由EPCs分化而來［5］。隨著對EPCs在缺血性疾病中作用研究的深入，越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)EPCs除對動脈粥樣硬化以及某些缺血性疾病具有良好的治療作用外，還參與了腫瘤新生血管的形成［6～8］。

腫瘤在生長過程中，會以自分泌和旁分泌的方式分泌多種細胞因子如：血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、促血管生成素和VEGF等，這些細胞因子均可動員EPCs從骨髓遷至外周血并參與腫瘤血管的生成，為腫瘤細胞的生長提供營養(yǎng)。其中，VEGF對腫瘤血管的生成起重要的作用，通過與受體的結(jié)合可激活RAS/Raf/MAPK和PI3K/Akt等途徑調(diào)控細胞的增殖及生長、凋亡和侵襲等生物學行為［9～11］。腫瘤組織中VEGF的表達水平與腫瘤微血管密度、惡性程度及轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)，與患者預后呈負相關(guān)，以VEGF和VEGFR為靶點治療惡性腫瘤是現(xiàn)在研究的熱點。EPCs與成熟的內(nèi)皮細胞具有部分相同的表面標志，如VEGFR-2、CD34、鈣黏素等，VEGF通過與EPCs表面的VEGFR-2結(jié)合可動員EPCs從骨髓進入外周血參與血管新生。本研究采用RT-PCR方法通過檢測β-欖香烯作用下腫瘤上清液誘導的EPCsVEGF及VEGFR-2mRNA表達的變化情況，明確β-欖香烯對EPCs參與的腫瘤血管形成的影響的部分機制。結(jié)果顯示，隨著β-欖香烯濃度及作用時間的增加，EPCsVEGFR-2的表達明顯下降；當β-欖香烯濃度增加至10 μg/mL及作用時間延長至24 h，EPCsVEGF的表達與對照組相比明顯下降（P＜0.05）。因此，可以推測β-欖香烯通過下調(diào)EPCsVEGF及VEGFR-2mRNA的表達減少EPCs的動員，從而抑制EPCs在腫瘤血管形成中的作用。

β-欖香烯是一種新型的抗腫瘤中藥，具有廣譜抗腫瘤作用，而且毒性反應輕微，對熱化療和放療具有協(xié)同增敏作用，因其效果好、不良反應小，被作為惡性腫瘤治療中的重要輔助手段應用于臨床［12］。本研究為β-欖香烯的抗腫瘤機制又提供了一個有力的依據(jù)，但是與EPCs被動員的具體信號通路還有待進一步研究。

［1］Li Q，Wang G，Zhang M，et al.β-Elemene，a novel plant-derived antineoplastic agent，increases cisplatin chemosensitivity of lung tumor cells by triggering apoptosis［J］.Oncol Rep，2009，22（1）：161-170.

［2］Li X，Wang G，Zhao J，et al.Antiproliferative effect of beta-elemene in chemoresistant ovarian carcinoma cells is mediated through arrest of the cell cycle at the G2-M phase［J］.Cell Mol Life Sci，2005，62（7-8）：894-904.

［3］周昆，崔黎，閆焱，等.欖香烯對人肺腺癌SPC-A-1細胞VEGF-C及VEGFR-3表達的影響［J］.中國老年學雜志，2008，28（6）：551-553.

［4］程偉，李建平，王子明，等.β-欖香烯對腎癌放療增敏相關(guān)基因表達譜的影響［J］.中華泌尿外科雜志，2007，28（2）：87-90.

［5］Peichev M，Naiyer AJ，Pereira D，et al.Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34+cells identifies a population of functional endothelial precursors［J］.Blood，2000，95（3）：952-958.

［6］Gao D，Nolan D，Mcdonnell K，et al.Bone marrow-derived endothelial progenitor cells contribute to the angiogenic switch in tumor growth and metastatic progression［J］.Biochem Biophys Acta，2009，1796（1）：33-40.

［7］Sun X，Yuan X，Zhu H，et al.Endothelial precursor cells promote angiogenesis in hepatocellular carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2012，21（35）：4925-4933.

［8］Yu D，Sun X，Qiu Y，et al.Identification and clinical significance of mobilized endothelial progenitor cells in tumor vasculogenesis of hepatocellular carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2007，13（13）：3814-3824.

［9］Lu K，Chang J，Parachonlak C，et al.VEGF inhibits tumor cell invasion and mesenchymal transition through a MET/VEGFR2 complex［J］.Cancer Cell，2012，10（1）：21-35.

［10］Martelli AM，Tazzari PL，Evandelisti C，et al.Targeting the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/mammalian target of rapamycinmodule for acutemyelogenous leukemia therapy：from bench to bedside［J］.Curr Med Chem，2007，14（19）：2009-2023.

［11］Xu C，Wu X，Zhu J.VEGF promotes proliferation of human glioblastoma multiforme stem-like cells through VEGF receptor 2［J］.Scientific World Journal，2013，2013：417413.

［12］周蕾，劉福全，張紅梅，等.欖香烯聯(lián)合化療治療中晚期非小細胞肺癌的臨床療效觀察［J］.中藥藥理與臨床，2009，25（2）：113-115.

（編輯 王又冬）

2008年8月8日不應表示為2008-8-8

GB/T 15835-2011《出版物上數(shù)字用法》5.1.4中，對示例2008年8月8日說：“‘年’‘月’可按GB/T 7408-2005的5.2.1.1中的擴展格式，用‘-’替代”，寫成“2008-8-8”。雖然后文中說“月和日是一位數(shù)時，可在數(shù)字前補‘0’”，但這里用了助動詞“可”，仍暗示不補“0”也正確。很遺憾，這種表示法和說法都是不正確的，完全不符合GB/T 7408-2005的5.2.1.1中的規(guī)定：日歷日期表達式，“其完全表示法應該為8位數(shù)字組成的一個純數(shù)字型數(shù)據(jù)元，其中［YYYY］表示一個日歷年，［MM］表示日歷年中日歷月的順序數(shù)，［DD］表示日月中日歷日的順序數(shù)”，“擴展格式：YYYY-MM-DD”，“舉例1985-04-12”。敬請編輯同人注意：務必執(zhí)行專項國家標準GB/T7408-2005的規(guī)定，不要將“2008年8月8日”寫成“2008-8-8”。

（陳浩元）

Effectofβ-elemene on the Expression of VEGF and VEGFR-2 in Rat Bone Marrow Derived Endothelial Progenitor Cells Induced by SupernatantofTumor CellCultures

SONG Ying1，2，MENGXiao1，LIUYun-peng3，YANGXiang-hong1
（1.DepartmentofPathology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China；2.DepartmentofPathology，Xinxiang MedicalUniversity，Xinxiang 453000，China；3.DepartmentofOncology，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the effectofβ-elemene on the mRNAexpression ofVEGFin endothelialprogenitorcells（EPCs）induced by tumor cells supernatant，and discuss the effects of β-elemene on EPCs mobilization participated in tumor angiogenesis.MethodsEPCs were primarily cultured.EPCs were pretreated with SGC-7901 tumor cell supernatant for 12 h and then administrated with different concentration of β-elemene（0 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL）for 48 h，or treated with 20 μg/mL β-elemene for different time（0 h，12 h，24 h，48 h）.TheVEGFandVEGFR-2mRNAexpression ofEPCs were determined by RT-PCR.ResultsWith the increasing ofthe dose and the extension oftime，the expression of EPCsVEGFR-2mRNA were decreased obviously；when the dose increased to 10 μg/mL or the time extended to 12 h，the expression ofEPCsVEGFmRNA were decreased（compare to the controlgroup，P＜0.05）.Conclusionβ-elemene can decrease the expression ofEPCsVEGFandVEGFR-2mRNA，and reduce the mobilization ofEPCs，and restrain participation ofEPCs in tumorangiogenesis.

endothelial progenitor cells；tumor cells supernatant；β-elemene；VEGF；VEGFR-2

R329.2

A

0258-4646（2014）10-0917-04

宋穎（1985-），女，助教，碩士.

楊向紅，E-mail：xhyang4933@vip.sina.com

2013-04-19

網(wǎng)絡(luò)出版時間：