一種快速聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的探究和法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

董會(huì)，李彩霞，王晶，賈竟，劉超

（1.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣州510515；2.公安部物證鑒定中心，北京市現(xiàn)場物證檢驗(yàn)工程技術(shù)研究中心，法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100038；3.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室，鄭州450000）

·技術(shù)方法·

一種快速聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的探究和法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

董會(huì)1，李彩霞2，王晶2，賈竟3，劉超1

（1.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣州510515；2.公安部物證鑒定中心，北京市現(xiàn)場物證檢驗(yàn)工程技術(shù)研究中心，法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100038；3.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室，鄭州450000）

目的優(yōu)化和建立一套快速聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增體系和程序，縮短擴(kuò)增時(shí)間，提高短串聯(lián)重復(fù)序列分型的速率和辦案效率。方法運(yùn)用AmpFLSTR?Identifiler?Plus試劑盒和7種快速擴(kuò)增酶進(jìn)行篩選和優(yōu)化，最后對篩選出的酶優(yōu)化其擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序，并對幾種常規(guī)檢材中提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，然后對其分型結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證和討論。結(jié)果最終優(yōu)化的擴(kuò)增程序由常規(guī)的3 h左右縮短至24 min，DNA檢驗(yàn)結(jié)果與常規(guī)方法一致。結(jié)論應(yīng)用優(yōu)化后的快速PCR擴(kuò)增體系可以成功準(zhǔn)確擴(kuò)增DNA樣本，顯著提高DNA分型速率。

法醫(yī)學(xué)；快速聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；復(fù)合短串聯(lián)重復(fù)序列

生物物證的DNA檢驗(yàn)在公安辦案實(shí)踐中發(fā)揮著舉足輕重的作用，案（事）件尤其是一些大要案往往要求在極短時(shí)間甚至在現(xiàn)場就提供檢驗(yàn)結(jié)果，為案（事）件的快速處置、偵查訴訟等提供及時(shí)的線索和證據(jù)。目前，生物物證常規(guī)檢測步驟包括DNA提取、定量、復(fù)合短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）擴(kuò)增、電泳檢測等，最終獲得常染色體或Y染色體STR分型，整個(gè)過程大致需要10～12 h。而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）一般需要3 h左右，是生物物證檢驗(yàn)的一個(gè)重要限速過程［1］。如果能將此過程進(jìn)一步縮短，將會(huì)顯著提升物證檢驗(yàn)的速度，提高法醫(yī)檢驗(yàn)的效率，滿足案件偵查和訴訟對于時(shí)效性的要求，提升生物物證的證據(jù)價(jià)值和證明力，為公安機(jī)關(guān)進(jìn)行PCR擴(kuò)增提供便利。

快速PCR就是基于普通PCR的工作原理，在保證PCR反應(yīng)特異性、靈敏度和保真度的前提下，在更短時(shí)間內(nèi)完成對核酸分子的擴(kuò)增［2］。近年來，快速PCR主要從3個(gè)方面分別進(jìn)行了研發(fā)：聚合酶的改進(jìn)、添加劑的研發(fā)以及熱循環(huán)儀的革新創(chuàng)造［3］?？焖贁U(kuò)增DNA聚合酶以及快速升/降溫速率的PCR擴(kuò)增儀［4］的出現(xiàn)，使快速PCR技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中大規(guī)模應(yīng)用成為可能。快速PCR技術(shù)在核基因組DNA和線粒體DNA的相關(guān)研究［5］中均占據(jù)重要位置。本文以當(dāng)前法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室常用的STR復(fù)合擴(kuò)增試劑［6］和快速擴(kuò)增酶為主要研究對象，建立了一套快速擴(kuò)增體系和程序，整個(gè)擴(kuò)增程序只需24 min即可完成，顯著縮短了物證檢驗(yàn)時(shí)間，為公安機(jī)關(guān)及科研院所進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢驗(yàn)提供了便利。

1 材料與方法

1.1 樣本

50份無關(guān)個(gè)體靜脈血由中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，84份案例檢材（血布片10份、血棉簽10份、唾液布片10份、唾液棉簽10份、接觸類檢材10份、骨頭7份、牙齒7份、精斑5份、口腔拭子10份、頭發(fā)毛囊5份）由公安部物證鑒定中心提供。

1.2 主要試劑和儀器

SpeedSTAR?HS DNA酶（日本TaKaRa公司），KAPA2GTM快速PCR試劑盒（美國Kapa Biosystems公司），QIAGEN快速PCR試劑盒和M48 QIAGEN?試劑盒（美國QIAGEN公司），PyroStartTMFast PCR Master Mix（2×）（加拿大Fermentas公司），F(xiàn)astStart Taq DNA酶，dNTPack（德國Roche Applied Science公司），PfuUltraⅡFusion HS DNA酶（美國Agilent公司），F(xiàn)ast HiFidelity PCR試劑盒（TIANGEN公司），AmpFLSTR?Identifiler?Plus試劑盒和ABI 3130XL遺傳分析儀（美國Applied Biosystems公司），蛋白酶K（德國Merck公司），Mastercycler pro Eppendorf?熱循環(huán)儀（德國Eppendorf公司），SpeedCycler2熱循環(huán)儀（德國Analytik Jena公司），NANODROP 2000C分光光度計(jì)（美國Thermo Scientific公司）。

1.3 方法

1.3.1 模板DNA的提?。翰捎么胖榉ǎ?］提取全部的實(shí)驗(yàn)樣本，具體操作參照M48 QIAGEN?試劑盒使用說明。

1.3.2 對模板DNA的定量：使用NANODROP 2000C分光光度計(jì)進(jìn)行DNA定量，操作參照儀器試劑使用說明。

1.4 快速擴(kuò)增酶的篩選和優(yōu)化

1.4.1 擴(kuò)增時(shí)間為1 h左右的快速酶的篩選和優(yōu)化：對以上7種酶和1種常規(guī)擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)間在1 h左右，擴(kuò)增體系為每種酶的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增體系。最終篩選出TaKaRa、Roche、Fermentas這3家公司的3種酶，位點(diǎn)擴(kuò)出較多，可以進(jìn)一步優(yōu)化和篩選［8，9］。7種酶的推薦擴(kuò)增體系如下：（1）TaKaRa 10 μL PCR擴(kuò)增體系：Fast BufferⅠ（10×，含有30 mmol/L MgCl2）1 μ L，Identifiler primer mix 2 μ L，SpeedSTAR?HS DNA酶（5 U/μL）0.1 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）0.8 μL，滅菌水5.1 μL，模板DNA 1 μL。（2）QIAGEN 10 μL PCR擴(kuò)增體系：QIAGEN Fast Cycling PCR Master Mix 5 μL，Identifiler primer mix 2 μL，滅菌水2 μL，模板DNA 1 μL。（3）Roche 10 μL PCR擴(kuò)增體系：PCR reaction buffer（10×，含有20 mmol/L MgCl2）1 μL，Identifiler primer mix 2 μL，F(xiàn)astStart Taq DNA酶（5 U/μL）0.2 μL，MgCl2（25 mmol/L）0.4 μL，PCR Grade Nucleotide Mix 0.2 μL，滅菌水5.2 μL，模板DNA 1 μL。（4）KAPA 10 μL PCR擴(kuò)增體系：5×KAPA2G Buffer A（含有20 mmol/L MgCl2）2 μL，dNTP Mix（10 mmol/L each）0.2 μL，Identifiler primer mix 2 μL，KAPA2G Fast DNA酶（5 U/μL）0.2 μL，滅菌水4.6 μL，模板DNA 1 μL。（5）Aglient 10 μL PCR擴(kuò)增體系：10×PfuUltraⅡreaction buffer 1 μL，dNTP mix（25 mmol/L each）0.2 μ L，Identifiler primer mix 2 μL，PfuUltraⅡfusion HS DNA酶0.2 μL，滅菌水5.6 μL，模板DNA 1 μL。（6）TIANGEN 10 μL PCR擴(kuò)增體系：5×Fast HiFidelity PCR Buffer 2 μL，Identifiler primer mix 2 μL，F(xiàn)ast HiFidelity酶0.4 μL，滅菌水4.6 μL，模板DNA 1 μL。（7）Fermentas 10 μL PCR擴(kuò)增體系：PyroStartTMFast PCR Master Mix（2×）5 μL，Identifiler primer mix 2 μL，滅菌水2 μL，模板DNA 1 μL。

2組篩選擴(kuò)增程序（此程序是綜合擴(kuò)增程序時(shí)間在1 h左右以及根據(jù)每種酶推薦程序推導(dǎo)得出）如下：擴(kuò)增分別在Mastercycler pro Eppendorf?熱循環(huán)儀（擴(kuò)增儀的升降溫速率分別為6℃/s和4.5℃/s）和SpeedCycler2熱循環(huán)儀（擴(kuò)增儀的升降溫速率分別為12℃/s和8℃/s）上進(jìn)行，熱循環(huán)參數(shù)1為：95℃2 min，95℃20 s，59℃20 s，72℃20 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸3 min；25℃保存［10］。擴(kuò)增時(shí)間分別為63 min和43 min。熱循環(huán)參數(shù)2為：95℃4 min，95℃30 s，59℃30 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min；25℃保存。擴(kuò)增時(shí)間分別為78 min和58 min。

1.4.2 擴(kuò)增時(shí)間為30 min左右的快速酶的篩選和優(yōu)化：用Roche、TaKaRa、Fermentas 3種酶分別擴(kuò)增AmpFlSTR?Identifiler?Plus Primer Mix。在Mastercycler pro Eppendorf?熱循環(huán)儀和SpeedCycler2熱循環(huán)儀上進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整。從以下10個(gè)方面對熱循環(huán)程序進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整：（1）酶的用量：0.05、0.10、0.20、0.40 μL；（2）引物的用量：2、3、4 μL；（3）鎂離子終濃度調(diào)整：2、3、4、5 mmol/L；（4）預(yù)變性時(shí)間調(diào)整：1、2、3、4 min；（5）變性時(shí)間調(diào)整：5、10、15、20、30 s；（6）退火時(shí)間調(diào)整：5、10、15、20、30 s；（7）延伸時(shí)間調(diào)整：5、10、15、20、30 s；（8）終延伸時(shí)間調(diào)整：1、3、5、7、10、20 min；（9）退火溫度調(diào)整：56、57、58、59、60、61、62℃；（10）循環(huán)數(shù)調(diào)整：25、28、30、33、35個(gè)循環(huán)［11，12］。

最終優(yōu)化出擴(kuò)增時(shí)間最短、擴(kuò)增效力最好的Ta-KaRa公司的SpeedSTAR酶的10 μL PCR擴(kuò)增體系：Fast BufferⅠ（10×，含有30 mmol/L MgCl2）1 μL，Identifiler primer mix 2 μL，SpeedSTAR?HS DNA酶（5 U/μL）0.05 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）0.8 μL，滅菌水5.15 μL，模板DNA 1 μL。擴(kuò)增在SpeedCycler2熱循環(huán)儀上進(jìn)行，熱循環(huán)參數(shù)為：95℃1 min，95℃10 s，59℃10 s，72℃10 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸1 min；25℃保存。擴(kuò)增時(shí)間為24 min。

1.4.3 對優(yōu)化的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行一致性和樣品適應(yīng)性驗(yàn)證：應(yīng)用優(yōu)化的熱循環(huán)條件對收集的134份樣本進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，將1 μL擴(kuò)增產(chǎn)物和9 μL甲酰胺內(nèi)標(biāo)混合物混合變性后，應(yīng)用ABI 3130XL型遺傳分析儀進(jìn)行電泳檢測，用GeneMapper ID V3.3軟件自動(dòng)分析數(shù)據(jù)。每組均設(shè)置陽性對照和空白試劑陰性對照。甲酰胺內(nèi)標(biāo)混合物配比參照AmpFLSTR?Identifiler?Plus試劑盒使用說明。

1.4.4 對優(yōu)化的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行靈敏度測試：將9947A（陽性標(biāo)準(zhǔn)品）和樣本1、2、3、4、5五份DNA分別稀釋為1、0.750、0.500、0.250、0.125、0.063、0.032 ng/μL［13］，用優(yōu)化的熱循環(huán)條件進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物用ABI 3130XL型遺傳分析儀進(jìn)行電泳檢測。每組均設(shè)置空白試劑陰性對照。

1.4.5 對優(yōu)化的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行穩(wěn)定性檢測：運(yùn)用優(yōu)化后的快速PCR擴(kuò)增程序和擴(kuò)增體系對同一份樣品在同一批次進(jìn)行5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)［14］，擴(kuò)增后用ABI 3130XL型分析儀進(jìn)行電泳檢測。每組均設(shè)置陽性對照和空白試劑陰性對照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得DNA檢測圖譜均與已知分型結(jié)果比對，以各等位基因峰高大于50相對熒光單位（relative fluorescence unit，RFU）者為有效分型結(jié)果［15，16］。檢出率（%）=檢測到的樣本數(shù)/總樣本數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 快速擴(kuò)增酶的篩選和優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 擴(kuò)增時(shí)間為1 h左右的快速酶的篩選和優(yōu)化結(jié)果：圖1為7種酶的商品化試劑盒推薦擴(kuò)增體系和Identifiler plus引物在同一擴(kuò)增程序1下，在Eppendorf熱循環(huán)儀上進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行3130電泳檢測的分型圖，通過綜合分析DNA分型圖譜的準(zhǔn)確性、均衡性等初次篩選出3個(gè)公司的3種酶：Roche、TaKaRa、Fermentas。

圖1 7種快速酶的初次篩選電泳分型圖Fig.1 Classification of the seven fast PCR enzyme for the initial selection

2.1.2 擴(kuò)增時(shí)間為30 min左右的快速酶的篩選和優(yōu)化結(jié)果：通過系統(tǒng)研究和優(yōu)化，以時(shí)間最短和擴(kuò)增效力最好為優(yōu)化選擇條件，最終從Fermentas、 Roche和TaKaRa 3個(gè)公司的3種酶中篩選出TaKaRa公司的酶，擴(kuò)增程序在SpeedCycler2熱循環(huán)儀上進(jìn)行，擴(kuò)增時(shí)間僅為24 min，見圖2。

圖2 3種快速酶的最終優(yōu)化篩選電泳分型圖Fig.2 Classification of the three fast PCR enzyme for the final selection

2.2 一致性與樣品適應(yīng)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用優(yōu)化的熱循環(huán)條件對50份靜脈血DNA和84份案件檢材DNA進(jìn)行擴(kuò)增和電泳，在擴(kuò)增不同類型的檢材時(shí)均獲得完整分型結(jié)果，且所得分型結(jié)果均與常規(guī)擴(kuò)增方法分型結(jié)果一致，見表1和圖3。

表1 快速PCR分型與常規(guī)分型一致性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Classification results of the fast PCR and the standard procedure

2.3 靈敏度測試

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)樣品DNA濃度達(dá)到或超過0.25 ng/μL可以獲得完整基因座分型，且無非特異擴(kuò)增現(xiàn)象，每個(gè)濃度6份樣品平均的峰高即RFU值以散點(diǎn)圖的形式呈現(xiàn)。見表2和圖4。

2.4 體系穩(wěn)定性

運(yùn)用快速PCR程序和體系用AmpFLSTR?Identifiler?Plus試劑盒引物對同一份樣品在同一批次進(jìn)行5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，PCR分型結(jié)果一致，峰面積無較大差異。見圖5和圖6。

3 討論

本文從縮短PCR擴(kuò)增的時(shí)間和快速熱循環(huán)儀參數(shù)的優(yōu)化出發(fā)，針對AmpFLSTR?Identifiler?Plus試劑盒引物和7種快速PCR擴(kuò)增酶，進(jìn)行快速酶的篩選以及擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序的建立和優(yōu)化，構(gòu)建適合法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的快速擴(kuò)增體系和程序。本研究對快速擴(kuò)增酶的篩選、快速PCR擴(kuò)增體系的構(gòu)建和優(yōu)化進(jìn)行了較完整和系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究和匯報(bào)，為快速PCR實(shí)驗(yàn)提供了可供參考的實(shí)驗(yàn)條件和理論依據(jù)。對快速PCR的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化后，擴(kuò)增時(shí)間明顯縮短，平均耗時(shí)僅為24 min，比標(biāo)準(zhǔn)的耗時(shí)3 h左右的熱循環(huán)程序明顯縮短，與Tsukada［13］和Wang［2］的文獻(xiàn)報(bào)道的2 h左右的快速擴(kuò)增時(shí)間相比也明顯縮短。在實(shí)驗(yàn)初篩中，F(xiàn)ermentas和Roche的快速酶在擴(kuò)增時(shí)間為1 h左右時(shí)，擴(kuò)增效力較好，明顯優(yōu)于TaKaRa公司的快速酶，但在擴(kuò)增時(shí)間縮短至30 min內(nèi)時(shí)，F(xiàn)ermentas和Roche的快速酶出現(xiàn)丟點(diǎn)現(xiàn)象，峰高均衡性較差，而TaKaRa公司的快速酶在擴(kuò)增時(shí)間分別為1 h與30 min內(nèi)時(shí)相對保持穩(wěn)定，未出現(xiàn)丟點(diǎn)現(xiàn)象，峰高相對均衡。因此實(shí)驗(yàn)最終針對TaKaRa公司的快速酶進(jìn)行了深度優(yōu)化，最終獲得了擴(kuò)增效力較好、擴(kuò)增時(shí)間僅為24 min的擴(kuò)增體系和程序。

圖3 不同類型的檢材用最終優(yōu)化的TaKaRa酶的快速擴(kuò)增體系擴(kuò)增所得的電泳分型結(jié)果Fig.3 Classification results of the final fast PCR with DNA extracted from different types of samples using AmpFLSTR Identifiler plus PCR amplification kits and the fast PCR enzyme of TaKaRa

表2 靈敏度測試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Experimental results of sensitivity tests

實(shí)驗(yàn)通過134份包含不同種類的檢材，進(jìn)行一致性和樣品適應(yīng)性驗(yàn)證，均獲得良好分型圖譜，從圖3可以得出，此擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序能夠廣泛適用于各種法醫(yī)常規(guī)檢材。對隨機(jī)一份樣品同一條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，PCR分型結(jié)果一致穩(wěn)定，峰高和峰面積無較大差異，從圖5和圖6可以看出，峰高分布集中，5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)無較大差異。表明此擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序不是隨機(jī)性，而是具有良好的穩(wěn)定性且具有峰高均衡性。Vallone等［6］的一些實(shí)驗(yàn)研究中出現(xiàn)大量非特異擴(kuò)增現(xiàn)象和雙尖情況，而使用本研究建立的快速擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)則無此現(xiàn)象，體現(xiàn)了此快速擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序的優(yōu)勢。

圖4 不同濃度時(shí)9947A的各基因座的平均峰高散點(diǎn)圖Fig.4 The scatter diagram of the average peak height of different concentration in all loci of 9947A

圖5 樣品5次重復(fù)的電泳分型圖Fig.5 Classification results of the sample for five repeat

圖6 樣品5次重復(fù)的各基因座的平均峰高散點(diǎn)圖Fig.6 The scatter diagram of the average peak height of different concentration in all loci of the sample for five repeat

針對隨機(jī)5份樣品和9947A進(jìn)行靈敏度驗(yàn)證，結(jié)果顯示只要模板DNA濃度達(dá)到或超過0.250 ng/μL就能保證等位基因不丟失，表明此擴(kuò)增體系和程序?qū)悠妨恳筝^低。從圖4可以得出，樣本在不同濃度擴(kuò)增時(shí)峰高較均衡集中，體現(xiàn)了此擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序的均衡性較好，也從側(cè)面反映了此體系和程序的穩(wěn)定性。常規(guī)擴(kuò)增時(shí)AmpFLSTR?Identifiler?Plus試劑盒的靈敏度為0.125 ng/μL，在Vallone等［6］的一些實(shí)驗(yàn)研究中，其快速檢測體系和程序的靈敏度也均在0.125 ng/μL左右。與常規(guī)擴(kuò)增相比，本研究建立的快速擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序顯著提升了檢測速率，但在一定程度上降低了檢測的靈敏度，其靈敏度為0.250 ng/μL，但是仍能滿足各種常見法醫(yī)檢材檢驗(yàn)的需求，且與目前國際上關(guān)于快速PCR檢測的各項(xiàng)研究中的靈敏度相一致。

在Vallone［6］和Laurin［3］的研究中，其用酶量均消耗較大，本文建立的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序顯著提高了擴(kuò)增效率，10 μL擴(kuò)增體系中酶的用量僅為0.25 U且適用于各種常規(guī)檢材，這為公安機(jī)關(guān)以及科研院所進(jìn)行PCR擴(kuò)增提供了便利。隨著新的快速酶的不斷產(chǎn)生、熱循環(huán)儀的不斷優(yōu)化，PCR擴(kuò)增時(shí)間和擴(kuò)增效力將有望進(jìn)行進(jìn)一步縮短和提高。

綜上所述，本研究建立的快速PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序，擴(kuò)增時(shí)間僅為24 min，比標(biāo)準(zhǔn)的耗時(shí)3 h左右的熱循環(huán)程序明顯縮短，為公安機(jī)構(gòu)和科研院所進(jìn)行快速PCR反應(yīng)提供了便捷方法。

［1］Verheij S，Harteveld J，Sijen T.A protocol for direct and rapid multiplex PCR amplification on forensically relevant samples［J］.Forensic Sci Int Genet，2012，6（2）：167-175.

［2］Wang DY，Chang CW，Hennessy LK.Rapid STR analysis of single source DNA samples in 2 h［J］.Forensic Sci Int Genet Suppl Ser，2009，2（1）：115-116.

［3］Laurin N，F(xiàn)regeau C.Optimization and validation of a fast amplification protocol for AmpFLSTR profiler plus for rapid forensic human identification［J］.Forensic Sci Int Genet，2012，6（1）：47-57.

［4］楊文超，張曉東.快速PCR研究進(jìn)展［J］.中國生物工程雜志，2007，27（4）：99-103.

［5］張明陽，單海燕，徐冬冬，等.PCR-SSCP技術(shù)分析線粒體DNA多態(tài)性及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，40（4）：334-336.

［6］Vallone PM，Hill CR，Podini D，et al.Rapid amplification of commercial STR typing kits［J］.Forensic Sci Int Genet Suppl Ser，2009，2（1）：111-112.

［7］Kishore R，Reef WH，Anderson VJ，et al.Optimization of DNA extraction from low-yield and degraded samples using the BioRobot EZ1 and BioRobot M48［J］.J Forensic Sci，2006，51（5）：1055-1061.

［8］Pavlov AR，Pavlova NV，Kozyavkin SA，et al.Recent developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient applications［J］.Trends Biotechnol，2004，22（5）：253-260.

［9］Collins PJ，Hennessy LK，Leibelt CS，et al.Developmental validation of a single-tube amplification of the 13 CODIS STR loci，D2S1338，D19S433 and amelogenin：the AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification Kit［J］.J Forensic Sci，2004，49（6）：1265-1277.

［10］Vallone PM，Hill CR，Butler JM.Demonstration of rapid multiplex PCR amplification involving 16 genetic loci［J］.Forensic Sci Int Genet，2009，3（1）：42-45.

［11］Bienvenue JM，Legendre LA，F(xiàn)errance JP，et al.An integrated microfluidic device for DNA purification and PCR amplification of STR fragments［J］.Forensic Sci Int Genet，2010，4（3）：178-186.

［12］Wang Y，Prosen DE，LI M，et al.A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro［J］.Nucleic Acids Res，2004，32（3）：1197-1207.

［13］Tsukada K，Harayama Y，Kurasawa Y，et al.Fast PCR amplification AmpFLSTR Identifiler：second report［J］.Forensic Sci Int Genet Suppl Ser，2009，2（1）：108-110.

［14］Choung CM，Lee DS，Park KW，et al.Test of the rapid PCR method using AmpFLSTR Identifiler Kit［J］.Forensic Sci Int Genet Suppl Ser，2011，3（1）：475-476.

［15］Butler JM.Forensic DNA typing［M］.2nd ed.New York：Elsevier，2005：410-420.

［16］Butler JM.Genetics and genomics of core STR loci used in human identity testing［J］.J Forensic Sci，2006，51（2）：253-265.

［17］韓俊萍，李彩霞，嚴(yán)紅，等.低體積PCR擴(kuò)增用于單細(xì)胞分離和檢驗(yàn)［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（2）：123-125.

（編輯 陳姜）

An Exploration ofthe Rapid Polymerase Chain Reaction Method and Its Application in Forensic Science

DONGHui1，LICai-xia2，WANGJing2，JIAJing3，LIUChao1
（1.DepartmentofForensic Science，Basic Medicine College，Southern MedicalUniversity，Guangzhou 510515，China；2.Institute ofForensic Science，Key Laboratory ofForensic Genetics，Beijing Engineering Research CenterofCrime Scene Evidence Examination，Ministry ofPublic Security，Beijing 100038，China；3.Institute ofGenetics，Basic Medicine College，Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，China）

ObjectiveTo establish a rapid polymerase chain reaction（PCR）cycling protocol，so as to help shorten amplification time and improve generating short tandem repeats profiles and working efficiency.MethodsDNA extracted from the common samples were amplified with the optimized PCR method and cycling protocol using AmpFLSTR?Identifiler?Plus PCR Amplification Kits and the fast PCR enzyme filtrated from seven fastPCRenzyme.The genotyping results were then validated and discussed.ResultsThe developed PCRmethod，using filtrated fastPCRenzyme，shortened the time from 3 h of standard procedure to 24 min，and the genotyping results were in accord with the results generated by standard procedure.ConclusionWe successfully amplified the STR loci of several routine forensic specimens using the established rapid cycling protocol.Rapid thermalcycling conditions can significantly improve the rate ofDNA profiling.Moreover，unbalanced amplification ofthe loci，which may occurusing commercialkitsassingle primerconcentration cannotbe adjusted，now can be overcame with the established system.

forensic medicine；rapid polymerase chain reaction；multiplex short tandem repeat

R89

A

0258-4646（2014）10-0931-07

國家自然科學(xué)基金（81202384）；中央公益類基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（2012JB012）

董會(huì)（1990-），女，碩士研究生.

劉超，E-mail：liuchaogaj@21cn.com

2014-07-05

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