九里香醇提物抗膝骨關(guān)節(jié)炎研究

肖月星+劉海清+李林福+吳龍火

摘要：利用Hulth手術(shù)誘導(dǎo)法復(fù)制大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型，利用光學(xué)顯微鏡、組織化學(xué)法觀察關(guān)節(jié)平面損害情況，通過ELISA法測定大鼠血清中的IL-1β、TNF-α、SOD及iNOS含量，研究中藥九里香（Murraya exotica L.）醇提物對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的防治作用。結(jié)果表明，治療組與模型組相比，九里香醇提物對關(guān)節(jié)平面具有顯著的保護(hù)作用，可提高大鼠血清中SOD含量、有效降低IL-1β、TNF-α及iNOS含量。

關(guān)鍵詞：九里香（Murraya exotica L.）；膝骨關(guān)節(jié)炎；IL-1β；TNF-α；SOD；iNOS

中圖分類號：R282；R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）01-0126-04

Studies on Anti-knee Osteoarthritis Activity of the Ethanol Extracts of Murraya exotica L.

XIAO Yue-xing，LIU Hai-qing，LI Lin-fu，WU Long-huo

（College of Pharmacy，Gannan Medical University， Ganzhou 341000，Jiangxi，China）

Abstracts： Rat knee osteoarthritis mode was established by using Hulths operational method. The joint damage was observed by light microscope and histochemical methods. The contents of IL-1β， TNF-α， SOD， and iNOS in the rat serum were determined by ELISA to study the anti-knee osteoarthritis activity of the ethanol extracts of Murraya exotica（L.）. Results showed that the treated group could significantly protect joint from damage， elevate the content of SOD， effectively reduce the contents of IL-1β， TNF-α， and iNOS.

Key words： Murraya exotica L.； knee osteoarthritis； IL-1β； TNF-α； SOD； iNOS

收稿日期：2013-03-29

基金項目：贛南醫(yī)學(xué)院人才引進(jìn)啟動基金項目（201102）；贛南醫(yī)學(xué)院校級課題（YB201012）

作者簡介：肖月星（1965-），男，江西贛州人，實驗師，主要從事中藥藥理學(xué)研究，（電話） 0797-8169634（電子信箱）8269634@163.com；通訊作者，

吳龍火（1980-），男，福建漳州人，副教授，主要從事天然產(chǎn)物活性成分研究，（電話）0797-8169775（電子信箱）longhw@126.com。

九里香（Murraya exotica L.）又稱千里香、滿山香等，為蕓香科九里香屬植物，具有行氣止痛、活血散瘀、祛風(fēng)除濕等功效。骨性關(guān)節(jié)炎（OA）是一種常見的慢性關(guān)節(jié)疾病，1995年骨性關(guān)節(jié)炎專題研究會提出OA是力學(xué)與生物因素的共同作用導(dǎo)致軟骨細(xì)胞、胞外基質(zhì)及軟骨下骨三者的降解和合成失衡的結(jié)果[1，2]。軟骨基質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)與功能依賴于分解性代謝和合成性代謝的平衡，此平衡是通過細(xì)胞因子來調(diào)控的。IL-1β（白介素-1β）、TNF-α（腫瘤壞死因子α）及iNOS（誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶）等均被認(rèn)為與軟骨基質(zhì)的降解和破壞有非常大的關(guān)系，均被認(rèn)為是分解性因子[3，4]。本試驗通過復(fù)制膝骨關(guān)節(jié)炎模型，通過光學(xué)顯微鏡及組織化學(xué)法觀察九里香醇提物對關(guān)節(jié)平面的保護(hù)，并檢測大鼠血清內(nèi)的IL-1β、TNF-α、SOD（超氧化物歧化酶）及iNOS的水平，以探討九里香對骨性關(guān)節(jié)炎的分子防治機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

九里香采自福建省漳州市，經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李加林副教授鑒定為九里香，自然陰干，機(jī)械粉碎過40目篩。昆明大鼠，雄性，（200±20） g，均由江西省贛州市實驗動物中心提供[合格證號：SCXK（贛）2008-0002]。

WK-200B型高速藥物粉碎機(jī)，F(xiàn)A2004型精密電子天平，Leica組織切片機(jī)RM2235，ELISA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。乙醇、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、甲醛、二甲苯等均為分析純。

1.2 試驗方法

取干燥九里香葉粉末1 kg，用70%乙醇進(jìn)行回流提取3次，每次2 h。合并提取液并蒸去溶劑得到浸膏[5]。

1.2.1 大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型 每組6只大鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按照Rogart等[6]的方法復(fù)制大鼠實驗性骨關(guān)節(jié)炎模型。常規(guī)消毒，將大鼠以3%戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰臥于手術(shù)臺上，在無菌條件下在右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切開約2 cm，逐層分離，將臏骨向后向外翻，最大限度彎曲膝關(guān)節(jié)，顯露膝關(guān)節(jié)腔。用顯微器械切斷前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)負(fù)韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板后，逐層縫合傷口，分籠飼養(yǎng)，允許自由活動。術(shù)后給予青霉素10萬U肌肉注射抗炎，連續(xù)注射5 d。治療組術(shù)后進(jìn)行九里香70%乙醇提取物200、100、50 mg/kg劑量灌胃，空白對照組給予相同體積的CMC-Na，連續(xù)8周。在第八周末，將大鼠麻醉后，迅速剖開胸腔進(jìn)行心臟取血5 mL，靜置20～30 min后，3 000 g離心10 min，取上層血清，-20 ℃冰箱保存，待檢測其中的IL-1β、TNF-α、SOD及iNOS等含量。取股骨內(nèi)髁內(nèi)側(cè)軟骨組織，用光學(xué)體式顯微鏡觀察軟骨表面的色澤及光滑情況后，迅速置于10%中性福爾馬林溶液中固定以待進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.2.2 軟骨組織切片的制備 依據(jù)參考文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行大鼠軟骨組織切片的制備。

1.2.3 生化指標(biāo)的測定 IL-1β、TNF-α、SOD及iNOS等含量嚴(yán)格按照ELISA試劑盒提供的方法進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠膝骨關(guān)節(jié)軟骨光學(xué)檢查和組織化學(xué)檢查

在第八周處死大鼠，立即打開關(guān)節(jié)腔分離組織取下股骨，進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察（圖1）。對照組（圖1A）大鼠軟骨表層光滑，呈藍(lán)白色，光澤好，無裂紋及軟化灶；關(guān)節(jié)滑膜表面光滑，無腫脹、增厚。模型組大鼠軟骨表面粗糙，顏色偏白色，可見有一個較大的潰瘍?nèi)睋p（圖1B中箭頭指向），局部變薄，但未見有明顯的骨贅形成；滑膜存在不同程度增生、粘連，關(guān)節(jié)液明顯增多。50 mg/kg九里香70%乙醇提取液治療組（圖1C）中，軟骨表面糜爛較為嚴(yán)重，充血顯著，關(guān)節(jié)滑膜表面增生腫脹，有輕度的粘連現(xiàn)象。100 mg/kg九里香70%乙醇提取液治療組（圖1D）中，大鼠軟骨表面呈現(xiàn)較多的點狀凹陷糜爛，充血較為明顯，無裂紋及軟化灶；關(guān)節(jié)滑膜表面輕度增生腫脹，未見有明顯粘連現(xiàn)象。200 mg/kg九里香70%乙醇提取液治療組（圖1E）中，大鼠軟骨表層有微點凹陷，稍微充血，無裂紋及軟化灶；關(guān)節(jié)滑膜表面輕度增生腫脹，未見有明顯粘連現(xiàn)象。

正常大鼠關(guān)節(jié)軟骨的組織形態(tài)學(xué)分層按Beniinghoff法可分為4層：表層、移行層、輻射層和鈣化層。組織形態(tài)學(xué)變化觀察（HE染色）發(fā)現(xiàn)，由圖2A可見，大鼠關(guān)節(jié)軟骨的4層結(jié)構(gòu)清晰可辨，表層細(xì)胞小而扁平，向下細(xì)胞增大并呈柱狀排列，且排列整齊，潮線完整、明顯。圖2B的局部放大圖為圖2B-1，均為模型組圖，可見大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面不光滑，有較大面積的潰瘍?nèi)睋p，表面軟骨變薄，軟骨細(xì)胞變少，軟骨纖維增生明顯，可見一些軟骨細(xì)胞水腫、固縮，排列紊亂，4層結(jié)構(gòu)不易分辨，潮線不完整，基質(zhì)染色重度減低等。200、100、50 mg/kg九里香70%乙醇提取液治療組（圖2C、D、E ）中可見，大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面由基本平滑至出現(xiàn)有凹陷狀，表面軟骨厚度逐漸變薄，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞腫大，排列逐漸不整齊，在50 mg/kg九里香70%乙醇提取液（圖2E）中，大鼠關(guān)節(jié)軟骨潮線不明顯。

2.2 大鼠膝骨關(guān)節(jié)軟骨的生化指標(biāo)

由圖3A可知，九里香70%乙醇提取物不僅對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎引起的SOD活性降低起到一定的抑制作用，而且可以提高大鼠體內(nèi)SOD活性，并表現(xiàn)出劑量的依賴性。連續(xù)灌胃8周后，200、100、50 mg/kg九里香70%乙醇提取物不同劑量組大鼠血清的SOD活性分別為136.7、130.8、113.6 U/mL，而模型組的SOD活性為101.5 U/mL，低于對照組的SOD活力（104.1 U/mL）。

大鼠血清中的iNOS活性變化中（圖3B），模型組大鼠體內(nèi)的iNOS活性為24.7 U/mL，明顯高于對照組（17.6 U/mL）。與對照組相比，200 mg/kg九里香70%乙醇提取物可顯著降低大鼠體內(nèi)的iNOS活性，為15.9 U/mL。而大鼠血清中的IL-1β及TNF-α（圖3C、D）也表現(xiàn)出對九里香70%乙醇提取物劑量的依賴性，并且各處理組與對照相比差異均達(dá)顯著或極顯著水平。在九里香70%乙醇提取物劑量為200、100、50 mg/kg時，大鼠血清中IL-1β的含量分別為148.2、156.8、195.4 pg/mL，TNF-α的含量分別為51.4、57.9、78.3 pg/mL。而在模型組中，IL-1β、TNF-α的含量分別為239.3、127.4 pg/mL，遠(yuǎn)高于對照組（137.5、62.0 pg/mL）。

3 小結(jié)與討論

九里香作為一種傳統(tǒng)的中藥材，具有廣泛的藥理學(xué)作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[8]，九里香具有抗生育、終止妊娠、抗菌、抗甲狀腺腫大、降血糖、麻醉鎮(zhèn)靜及增強(qiáng)免疫功能等作用，但鮮見關(guān)于九里香抗炎鎮(zhèn)痛及其在骨關(guān)節(jié)炎等方面的研究報道。本研究采用大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型研究了九里香的抗炎鎮(zhèn)痛作用在骨關(guān)節(jié)炎方面的應(yīng)用，結(jié)果表明九里香醇提物對大鼠骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)平面及軟骨細(xì)胞具有保護(hù)作用。

軟骨細(xì)胞的正常表型表達(dá)是軟骨基質(zhì)保持穩(wěn)定的基礎(chǔ)，軟骨細(xì)胞功能的異常是骨關(guān)節(jié)炎變化的開始和關(guān)鍵[9]。OA是軟骨細(xì)胞合成和分解代謝活動的調(diào)節(jié)失衡，導(dǎo)致了細(xì)胞外基質(zhì)成分的進(jìn)行性丟失和軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的破壞。這些主要是軟骨細(xì)胞釋放的一些細(xì)胞因子造成的。如IL-1β不僅能抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成特征性的基質(zhì)成分Ⅱ型膠原，而且還可促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)生反分化[10]。Bulina等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在OA患者的血清及滑液中均檢測到高表達(dá)的IL-1β和TNF-α。利用TNF-α單克隆抗體——Infliximab，不僅可抑制OA中的TNF-α表達(dá)，而且也可抑制iNOS的合成，因此可顯著緩解OA病情的發(fā)展，目前已應(yīng)用于臨床上OA的治療[12]。抑制IL-1β及TNF-α的表達(dá)可促進(jìn)軟骨基質(zhì)的合成，本研究中九里香醇提物（200、100、50 mg/kg）可顯著性降低大鼠血清中IL-1β和TNF-α的含量，緩解其對軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)的抑制作用。IL-1β可介導(dǎo)iNOS等促炎因子的合成，同時iNOS本身也是活性自由基，其可能是通過NF-κB信號途徑從而影響OA軟骨細(xì)胞的生理活動。200 mg/kg九里香醇提物可顯著降低iNOS的表達(dá)水平，同時也提高了SOD的活性水平，可有效抑制促炎因子的破壞作用。

在光學(xué)檢查中，九里香醇提物（200 mg/kg）表現(xiàn)出很好的保護(hù)膝關(guān)節(jié)平面的作用，這可能與其抑制了促炎因子的表達(dá)水平有關(guān)，抑制了骨關(guān)節(jié)炎的炎癥免疫反應(yīng)，從而有效保護(hù)了關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。因此，中藥九里香醇提物具有抗膝骨關(guān)節(jié)炎的藥理學(xué)作用，其可能的機(jī)制是與體內(nèi)的IL-1β、TNF-α、SOD及iNOS的水平調(diào)節(jié)有關(guān)。

IL-1β和TNF-α又可通過NF-κB信號途徑誘發(fā)軟骨細(xì)胞的凋亡，在九里香醇提物治療中劑量逐漸減少，軟骨中軟骨細(xì)胞也逐漸減少，這也可能與凋亡過度有關(guān)。但目前關(guān)于九里香醇提物預(yù)防OA的分子機(jī)制還不是很清楚，有待于進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 趙 娟）

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（責(zé)任編輯 趙 娟）