煙草黑脛病菌的分離及培養(yǎng)性狀研究

楊順強(qiáng)+楊煥文+吳銀梅+周杰+趙琴

摘要：煙草黑脛病是煙草（Nicotiana tabacum）的一種毀滅性病害。試驗(yàn)采集云南省昭通市的煙草黑脛病病株，采用組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離、純化，對(duì)其培養(yǎng)性狀進(jìn)行研究。結(jié)果表明，燕麥培養(yǎng)基適合煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica）的培養(yǎng)，菌絲生長(zhǎng)旺盛；煙草黑脛病菌菌絲粗細(xì)不均勻，無(wú)隔膜，具有膨大體；孢子囊頂生，具脫落性，具1個(gè)或2個(gè)乳突。這些培養(yǎng)性狀與前人研究結(jié)果相似，表明煙草黑脛病菌的培養(yǎng)性狀較為穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：煙草（Nicotiana tabacum）；煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica）；培養(yǎng)性狀

中圖分類號(hào)：S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）01-0081-02

Isolation and Cultural Characteristics of Phytophthora Nicotianae，

Pathogen of Tobacco Blank Shank

YANG Shun-qiang1，2，YANG Huan-wen3，WU Yin-mei1，ZHOU Jie1，ZHAO Qin1

（1. Department of Chemistry， Zhaotong College， Zhaotong 657000，Yunnan， China； 2. Yunnan Agricultural University，a.College of Agronomy and Biotechnology； b.College of tobacco， Kunming 650201，China）

Abstract： Tobacco Black Shank is a destructive disease of tobacco. The pathogen were obtained from diseased tobacco stem tissues collected in Zhaotong city， Yunnan province. Cultural characteristics of the isolates were studied by means of tissue isolation. The results showed that Oatmeal medium was suitable for Tobacco Black Shank. The mycelium were diverse in thick and number， hyphal swellings and without membrane. The sporangium was acrogenous and deciduous had one or two mastoid. The characteristics similar with previous researches indicated that the characteristics of the pathogen was stable.

Key words： Nicotiana tabacum； Phytophthora parasitica； Culture characteristics

收稿日期：2012-11-30

基金項(xiàng)目：保山煙區(qū)特色品種煙葉生產(chǎn)優(yōu)化布局及綜合技術(shù)研究項(xiàng)目（KX140906）

作者簡(jiǎn)介：楊順強(qiáng)（1980-），男，四川雷波人，講師，在讀博士研究生，主要從事植物資源開(kāi)發(fā)與利用研究，（電話）15969027660（電子信箱）

ysq6666@163.com。

煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica）是一種在煙草（Nicotiana tabacum）上分布廣泛、為害嚴(yán)重的重要病害之一。目前除東北煙區(qū)零星發(fā)生外，全國(guó)其他煙區(qū)均普遍發(fā)生。每年因該病給煙草生產(chǎn)造成極大的損失，其危害程度僅次于煙草病毒病[1，2]。煙草黑脛病可以危害烤煙、晾煙、曬煙、香料煙、白肋煙等所有栽培煙草，發(fā)病后，往往是成片凋萎，整株死亡，且發(fā)病率高，破壞性極強(qiáng)。在自然條件下，寄主除煙草外，還可侵染草莓、辣椒、茄子、黃瓜等[3]。馬國(guó)勝等[4]對(duì)不同地理來(lái)源的煙草黑脛病菌培養(yǎng)性狀進(jìn)行了研究。蘇振剛等[5]研究了煙草黑脛病菌在不同培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)特性。昭通市是云南省的主要煙區(qū)之一，也是煙草黑脛病危害較為嚴(yán)重的煙區(qū)，但針對(duì)此區(qū)煙草黑脛病菌培養(yǎng)特性的研究鮮有報(bào)道。為此，試驗(yàn)從昭通主要烤煙種植區(qū)的昭陽(yáng)區(qū)布嘎鄉(xiāng)迎水村烤煙種植大田中選擇發(fā)病的煙草黑脛病煙株，研究其分離方法和培養(yǎng)性狀，以期進(jìn)一步了解煙草黑脛病菌的分離、培養(yǎng)特性，為煙草黑脛病的相關(guān)研究和綜合防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 病株的采集

2012年9月從昭通市昭陽(yáng)區(qū)布嘎鄉(xiāng)迎水村烤煙田中采集煙草黑脛病典型病株，去掉葉片，用自來(lái)水沖洗干凈，帶回實(shí)驗(yàn)室，備用。

1.2 培養(yǎng)基的配制

燕麥培養(yǎng)基：燕麥片30 g，瓊脂18 g，去離子水1 000 mL。

1.3 菌株的分離

參照馬國(guó)勝等[4]的方法，將帶回實(shí)驗(yàn)室的烤煙病株莖稈剖開(kāi)，從碟片狀的病健交界處取3 mm×3 mm的髓部組織接種于燕麥培養(yǎng)基上，在氣候箱中，25 ℃黑暗培養(yǎng)2～3 d后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色及菌絲形態(tài)進(jìn)行反復(fù)純化培養(yǎng)。

1.4 菌絲、孢子囊及有性器官的觀察

參照文獻(xiàn)[5，6]的方法，將純化培養(yǎng)已完成的煙草黑脛病菌絲挑取少許均勻分散于滴有席爾固定液的載玻片上，在10×40倍顯微鏡下觀察煙草黑脛病菌絲、孢子囊、孢囊梗及有性器官的形態(tài)與大小，重復(fù)30次。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落及菌絲形態(tài)特征

分離的煙草黑脛病菌株在燕麥培養(yǎng)基上氣生菌絲生長(zhǎng)旺盛，呈白色絮狀，菌落質(zhì)地均勻。在顯微鏡下鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲粗細(xì)不均勻，菌絲寬度2.67～14.52 μm，平均寬度5.48 μm，無(wú)隔膜，有分支，局部有菌絲膨大體，在膨大體上常有若干放射狀菌絲，其內(nèi)部近乎中空（圖1）。

2.2 孢子及孢子囊形態(tài)特征

孢子橢圓形或圓形，具有游動(dòng)性；孢子囊頂生，具脫落性，呈腎形、橢圓形或不規(guī)則形，成熟脫落后孢囊柄不明顯，大小通常為24.83～112.06 μm×16.35～52.46 μm，平均33.18 μm×47.05 μm；孢子囊長(zhǎng)寬比1.24～1.53，平均1.44；孢子囊多為單乳突，少數(shù)具2個(gè)乳突，乳突有的明顯，有的模糊；部分孢子囊上有絲狀附著物；孢子囊內(nèi)部含有顆粒狀的游動(dòng)孢子，發(fā)育成熟后，在適當(dāng)條件下孢子囊破裂，釋放游動(dòng)孢子；卵孢子呈球形，壁光滑，藏卵器較小，呈半球形，壁光滑，基部呈柱狀（圖2）。

3 小結(jié)與討論

對(duì)煙草黑脛病病菌培養(yǎng)性狀的研究已有較多報(bào)道[1，3-5]，近年來(lái)，隨著環(huán)境條件、耕作制度、栽培管理等條件的變化，煙草黑脛病菌的培養(yǎng)特性是否也發(fā)生了變化。本研究表明，煙草黑脛病菌在燕麥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，氣生菌絲生長(zhǎng)旺盛，菌絲質(zhì)地均勻；菌絲粗細(xì)不均勻，有分支，具膨大體，無(wú)隔膜；孢子大都呈球形；孢子囊頂生，形狀不一，具有乳突等，這些結(jié)果與馬國(guó)勝等[4]、蘇振剛等[5]的研究結(jié)果一致。表明煙草黑脛病菌的這些培養(yǎng)特性比較穩(wěn)定，受環(huán)境變化影響不大，地區(qū)間差異較小，這可能與煙草黑脛病菌是通過(guò)異宗配合有關(guān)[4，5]。

燕麥培養(yǎng)基較適合于煙草黑脛病菌的生長(zhǎng)[7-9]。李梅云等[10]、周志成[11]的研究表明，在燕麥培養(yǎng)基上的煙草黑脛病菌生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)孢量多。本研究表明，煙草黑脛病菌的培養(yǎng)可通過(guò)采集田間病株，切取髓部組織接種到平板燕麥培養(yǎng)基上進(jìn)行分離后，再采用燕麥斜面培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)，可取得較好的分離培養(yǎng)效果。

參考文獻(xiàn)：

[1] 馬國(guó)勝，高智謀，陳 娟.煙草黑脛病研究進(jìn)展[J].煙草科技，2001（9）：44-48.

[2] 孫計(jì)平，李雪君，朱景偉.煙草黑脛病及其抗性鑒定方法研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（8）：36-39.

[3] 馬國(guó)勝，高智謀，陳 娟. 煙草黑脛病研究進(jìn)展[J].煙草科技，2003（4）：35-42.

[4] 馬國(guó)勝，高智謀.煙草黑脛病菌培養(yǎng)性狀的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40（3）：512-517.

[5] 蘇振剛，王 靜，周 佳，等.煙草黑脛病菌0號(hào)生理小種不同條件下培養(yǎng)特性的研究[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2011，32（1）：56-60.

[6] 鄭小波.疫霉菌及其研究技術(shù)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1997.

[7] GAO Z M， ZHENG X B， LU J Y. Effect of culture media on antheridial configuration in Phytophthora boehmeriae[J]. Canadian Journal of Botany，1998，76：2177-2179.

[8] HO H H， ANN P J， CHANG T T. The genus Phytophthora in Taiwan[M].Taipei： Institute of Botany Academy Press，1995.

[9] 李梅云.不同培養(yǎng)基對(duì)煙草黑脛病菌生長(zhǎng)的影響[J].植物保護(hù)科學(xué)，2006，22（7）：434-436.

[10] 李梅云，盧秀萍，李永平. 煙草黑脛病菌培養(yǎng)特性的研究[J].植物保護(hù)，2006，32（6）：81-84.

[11] 周志成.煙草黑脛病菌產(chǎn)孢性狀的研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（2）：60-62.

（責(zé)任編輯 童志婷）

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落及菌絲形態(tài)特征

分離的煙草黑脛病菌株在燕麥培養(yǎng)基上氣生菌絲生長(zhǎng)旺盛，呈白色絮狀，菌落質(zhì)地均勻。在顯微鏡下鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲粗細(xì)不均勻，菌絲寬度2.67～14.52 μm，平均寬度5.48 μm，無(wú)隔膜，有分支，局部有菌絲膨大體，在膨大體上常有若干放射狀菌絲，其內(nèi)部近乎中空（圖1）。

2.2 孢子及孢子囊形態(tài)特征

孢子橢圓形或圓形，具有游動(dòng)性；孢子囊頂生，具脫落性，呈腎形、橢圓形或不規(guī)則形，成熟脫落后孢囊柄不明顯，大小通常為24.83～112.06 μm×16.35～52.46 μm，平均33.18 μm×47.05 μm；孢子囊長(zhǎng)寬比1.24～1.53，平均1.44；孢子囊多為單乳突，少數(shù)具2個(gè)乳突，乳突有的明顯，有的模糊；部分孢子囊上有絲狀附著物；孢子囊內(nèi)部含有顆粒狀的游動(dòng)孢子，發(fā)育成熟后，在適當(dāng)條件下孢子囊破裂，釋放游動(dòng)孢子；卵孢子呈球形，壁光滑，藏卵器較小，呈半球形，壁光滑，基部呈柱狀（圖2）。

3 小結(jié)與討論

對(duì)煙草黑脛病病菌培養(yǎng)性狀的研究已有較多報(bào)道[1，3-5]，近年來(lái)，隨著環(huán)境條件、耕作制度、栽培管理等條件的變化，煙草黑脛病菌的培養(yǎng)特性是否也發(fā)生了變化。本研究表明，煙草黑脛病菌在燕麥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，氣生菌絲生長(zhǎng)旺盛，菌絲質(zhì)地均勻；菌絲粗細(xì)不均勻，有分支，具膨大體，無(wú)隔膜；孢子大都呈球形；孢子囊頂生，形狀不一，具有乳突等，這些結(jié)果與馬國(guó)勝等[4]、蘇振剛等[5]的研究結(jié)果一致。表明煙草黑脛病菌的這些培養(yǎng)特性比較穩(wěn)定，受環(huán)境變化影響不大，地區(qū)間差異較小，這可能與煙草黑脛病菌是通過(guò)異宗配合有關(guān)[4，5]。

燕麥培養(yǎng)基較適合于煙草黑脛病菌的生長(zhǎng)[7-9]。李梅云等[10]、周志成[11]的研究表明，在燕麥培養(yǎng)基上的煙草黑脛病菌生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)孢量多。本研究表明，煙草黑脛病菌的培養(yǎng)可通過(guò)采集田間病株，切取髓部組織接種到平板燕麥培養(yǎng)基上進(jìn)行分離后，再采用燕麥斜面培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)，可取得較好的分離培養(yǎng)效果。

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[3] 馬國(guó)勝，高智謀，陳 娟. 煙草黑脛病研究進(jìn)展[J].煙草科技，2003（4）：35-42.

[4] 馬國(guó)勝，高智謀.煙草黑脛病菌培養(yǎng)性狀的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40（3）：512-517.

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[10] 李梅云，盧秀萍，李永平. 煙草黑脛病菌培養(yǎng)特性的研究[J].植物保護(hù)，2006，32（6）：81-84.

[11] 周志成.煙草黑脛病菌產(chǎn)孢性狀的研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（2）：60-62.

（責(zé)任編輯 童志婷）

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落及菌絲形態(tài)特征

分離的煙草黑脛病菌株在燕麥培養(yǎng)基上氣生菌絲生長(zhǎng)旺盛，呈白色絮狀，菌落質(zhì)地均勻。在顯微鏡下鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲粗細(xì)不均勻，菌絲寬度2.67～14.52 μm，平均寬度5.48 μm，無(wú)隔膜，有分支，局部有菌絲膨大體，在膨大體上常有若干放射狀菌絲，其內(nèi)部近乎中空（圖1）。

2.2 孢子及孢子囊形態(tài)特征

孢子橢圓形或圓形，具有游動(dòng)性；孢子囊頂生，具脫落性，呈腎形、橢圓形或不規(guī)則形，成熟脫落后孢囊柄不明顯，大小通常為24.83～112.06 μm×16.35～52.46 μm，平均33.18 μm×47.05 μm；孢子囊長(zhǎng)寬比1.24～1.53，平均1.44；孢子囊多為單乳突，少數(shù)具2個(gè)乳突，乳突有的明顯，有的模糊；部分孢子囊上有絲狀附著物；孢子囊內(nèi)部含有顆粒狀的游動(dòng)孢子，發(fā)育成熟后，在適當(dāng)條件下孢子囊破裂，釋放游動(dòng)孢子；卵孢子呈球形，壁光滑，藏卵器較小，呈半球形，壁光滑，基部呈柱狀（圖2）。

3 小結(jié)與討論

對(duì)煙草黑脛病病菌培養(yǎng)性狀的研究已有較多報(bào)道[1，3-5]，近年來(lái)，隨著環(huán)境條件、耕作制度、栽培管理等條件的變化，煙草黑脛病菌的培養(yǎng)特性是否也發(fā)生了變化。本研究表明，煙草黑脛病菌在燕麥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，氣生菌絲生長(zhǎng)旺盛，菌絲質(zhì)地均勻；菌絲粗細(xì)不均勻，有分支，具膨大體，無(wú)隔膜；孢子大都呈球形；孢子囊頂生，形狀不一，具有乳突等，這些結(jié)果與馬國(guó)勝等[4]、蘇振剛等[5]的研究結(jié)果一致。表明煙草黑脛病菌的這些培養(yǎng)特性比較穩(wěn)定，受環(huán)境變化影響不大，地區(qū)間差異較小，這可能與煙草黑脛病菌是通過(guò)異宗配合有關(guān)[4，5]。

燕麥培養(yǎng)基較適合于煙草黑脛病菌的生長(zhǎng)[7-9]。李梅云等[10]、周志成[11]的研究表明，在燕麥培養(yǎng)基上的煙草黑脛病菌生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)孢量多。本研究表明，煙草黑脛病菌的培養(yǎng)可通過(guò)采集田間病株，切取髓部組織接種到平板燕麥培養(yǎng)基上進(jìn)行分離后，再采用燕麥斜面培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)，可取得較好的分離培養(yǎng)效果。

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[10] 李梅云，盧秀萍，李永平. 煙草黑脛病菌培養(yǎng)特性的研究[J].植物保護(hù)，2006，32（6）：81-84.

[11] 周志成.煙草黑脛病菌產(chǎn)孢性狀的研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（2）：60-62.

（責(zé)任編輯 童志婷）