子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜中BRAF基因的表達(dá)及意義

褚達(dá)明，王丹波，李妍，劉巋然

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng)110004）

子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜中BRAF基因的表達(dá)及意義

褚達(dá)明，王丹波，李妍，劉巋然

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng)110004）

目的探討B(tài)RAF基因在子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜中的表達(dá)。方法采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)及免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)20例子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜及20例對(duì)照組正常子宮內(nèi)膜中BRAF的表達(dá)。結(jié)果在位內(nèi)膜中BRAFmRNA相對(duì)表達(dá)量（0.000 067 897 0±0.000 114 528 6）明顯高于正常內(nèi)膜（0.000 009 543 1±0.000 006 454 3）（P＜0.05），而異位內(nèi)膜（0.000 029 395 7±0.000 038 046 9）與在位內(nèi)膜之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜中BRAF蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度均明顯高于正常內(nèi)膜（P＜0.05），而異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜之間陽(yáng)性表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論在位內(nèi)膜BRAF基因高表達(dá)可能在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生中起重要作用，而與病情進(jìn)展的相關(guān)性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

子宮內(nèi)膜異位癥；BRAF；子宮內(nèi)膜；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)；免疫組化

子宮內(nèi)膜異位癥是一種多病因引起的慢性炎性疾病，其特征為具有生長(zhǎng)功能的子宮內(nèi)膜（腺體和間質(zhì)）組織出現(xiàn)在子宮腔被覆黏膜以外部位［1］。該病常發(fā)生于生育年齡的婦女，發(fā)病率為10%～20%。慢性盆腔痛、不孕及包塊是其主要臨床特點(diǎn)。其病因及發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，造成治療上的困難。目前研究認(rèn)為子宮內(nèi)膜異位癥是一種病因復(fù)雜的多基因遺傳的疾病［2］。我們選擇了本課題組前期通過(guò)cDNA代表差異性分析技術(shù)篩查出的子宮內(nèi)膜異位癥差異性高表達(dá)基因之一的BRAF基因［3］，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)其在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜中的表達(dá)，為子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

選擇2013年1月至12月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科行開(kāi)腹或腹腔鏡手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜異位癥患者20例為實(shí)驗(yàn)組，手術(shù)同時(shí)行全子宮切除術(shù)，病理學(xué)診斷結(jié)果證實(shí)為子宮內(nèi)膜異位癥，術(shù)后立即留取異位病灶和在位內(nèi)膜。對(duì)照組為同期無(wú)子宮內(nèi)膜異位癥的正常子宮內(nèi)膜標(biāo)本20例。研究對(duì)象年齡23～50歲，實(shí)驗(yàn)組年齡（36.9±8.7）歲，對(duì)照組年齡（38.5±6.4）歲（P＞0.05），具有可比性。全部病例無(wú)其他內(nèi)分泌、免疫及代謝性疾病，手術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未接受激素治療。根據(jù)月經(jīng)周期及病理確認(rèn)標(biāo)本均為分泌期留取。所有標(biāo)本分為兩部分，一部分放入10%甲醛中固定用來(lái)做免疫組化，另一部分放入液氮中冷凍用來(lái)做RT-PCR。實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，均簽署知情同意書。

1.2 RT-PCR檢測(cè)BRAFmRNA表達(dá)

嚴(yán)格按照TaKaRa公司的RNA提取試劑盒（TrizolTMRNA Isolation Reagent）中的說(shuō)明書進(jìn)行操作，從每份冷凍標(biāo)本中提取總RNA。使用Prime-Script?第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA第一鏈，并在-20℃下保存用來(lái)進(jìn)一步擴(kuò)增。按操作說(shuō)明使用TaKaRa公司的SYBR?PrimeScriptTMreal-time PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。應(yīng)用Primer 5.0軟件，參照BRAF基因序列設(shè)計(jì)特異引物，上游引物為5′-GGCAGAGTGCCTCAAAAAGAA-3′，下游引物為5′-AACCAGCCCGATTCAAGGA-3′，以18 s基因作為內(nèi)部對(duì)照。使用LightCycler?2.0 RT-PCR系統(tǒng)進(jìn)行45個(gè)循環(huán)的2步法擴(kuò)增，即95℃20 s，60℃1 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析采用相對(duì)定量方法，即BRAFmRNA的相對(duì)表達(dá)量=2-ΔCt，ΔCt=CtBRAF基因-Ct對(duì)照基因。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)BRFA蛋白表達(dá)

免疫組化采用SP法，石蠟包埋標(biāo)本，4 μm厚切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。一抗為兔抗人BRAF多克隆抗體（美國(guó)Signalway Antibody），用免疫組化SP試劑盒（福州邁新）檢測(cè)BRAF蛋白的表達(dá)。將組織切片放入檸檬酸鹽緩沖劑中加熱至沸騰，持續(xù)5 min，進(jìn)行抗原修復(fù)，后加入1%H2O2阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，隨后在室溫下加入5%的正常羊血清工作液封閉30 min，后加入抗原濃度為1∶200的一抗，4℃冰箱過(guò)夜，后滴加生物素標(biāo)記二抗，在室溫下作用30 min，再滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液作用20 min，DAB染色20 s，蘇木素復(fù)染。以PBS液置換一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：細(xì)胞質(zhì)染色，出現(xiàn)棕褐色、棕黃色或淡黃色顆粒為陽(yáng)性染色。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占面積積分之和進(jìn)行判斷。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：不著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。染色面積評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)細(xì)胞染色為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，≥50%為3分。兩種評(píng)分相加，0～1分為（-），2分為（+），3～4分為（++），5～6分為（+++）。陽(yáng)性表達(dá)率=（+～+++級(jí)的例數(shù)/各組總例數(shù)）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析取得結(jié)果，計(jì)量資料多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料多組間陽(yáng)性率比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料多組間表達(dá)強(qiáng)度比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜BRAFmRNA表達(dá)

以18s基因作為內(nèi)部對(duì)照，子宮內(nèi)膜異位癥組異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜BRAFmRNA表達(dá)量分別為0.000 029 395 7±0.000 038 046 9及0.000 067 897 0± 0.000 114 528 6，二者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；對(duì)照組正常內(nèi)膜表達(dá)量為0.000 009 543 1± 0.000 006 454 3，與子宮內(nèi)膜異位癥組在位內(nèi)膜比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜中BRAF mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression of BRAF mRNA in ectopic，eutopic endometrium of endometriosis

2.2 子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜BRAF蛋白表達(dá)

BRAF蛋白免疫組織化學(xué)染色情況：陽(yáng)性反應(yīng)物呈棕黃色或棕褐色顆粒，主要表達(dá)在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。BRAF蛋白在異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜中均有表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率分為為55%（11/20）、60%（12/20）和10%（2/ 20）。如圖2所示，BRAF在子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜胞質(zhì)內(nèi)大量表達(dá)，可見(jiàn)棕黃色染色顆粒，呈陽(yáng)性反應(yīng)。BRAF在子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜胞質(zhì)內(nèi)大量表達(dá)，可見(jiàn)棕褐色染色顆粒，呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。BRAF在正常分泌期子宮內(nèi)膜胞質(zhì)內(nèi)少量表達(dá)，可見(jiàn)淡黃色染色顆粒，呈弱陽(yáng)性反應(yīng)。子宮內(nèi)膜異位癥組異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜中BRAF蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。而異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜分別與對(duì)照組正常內(nèi)膜比較，陽(yáng)性表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖2 免疫組化SP法檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜中BRAF蛋白的表達(dá)×400Fig.3 The expression of BRAF protein measured by immunohistochemistry in ectopic，eutopic endometrium of endometriosis×400

圖3 BRAF蛋白在各組內(nèi)膜中的表達(dá)強(qiáng)度構(gòu)成Fig.3 The proportion of BRAF protein in groups

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是一種雌激素依賴性的炎性疾病，是育齡婦女的常見(jiàn)病和多發(fā)病，與不孕和慢性盆腔痛關(guān)系密切，近年來(lái)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者的生殖健康和生活質(zhì)量。盡管有眾多解釋子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的學(xué)說(shuō)，但最被廣為接受的是子宮內(nèi)膜種植學(xué)說(shuō)，即月經(jīng)期經(jīng)血逆流，子宮內(nèi)膜細(xì)胞和碎片隨經(jīng)血逆流至腹腔，進(jìn)而種植于卵巢和盆腔腹膜，形成子宮內(nèi)膜異位癥病灶［4］。然而，經(jīng)血逆流在育齡期婦女中的發(fā)生率約為70%～80%，而子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病率只有10%～15%，這說(shuō)明子宮內(nèi)膜的侵襲性種植是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過(guò)程。

越來(lái)越多的證據(jù)表明子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜存在內(nèi)源性異常，使其易于遷徙和種植，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生和發(fā)展［5，6］。而內(nèi)膜的侵襲性種植涉及多條信號(hào)傳導(dǎo)通路的相互協(xié)調(diào)，其中有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路起到重要作用［2］。MAPK是各細(xì)胞信息從細(xì)胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核的重要傳遞者，是刺激細(xì)胞增殖、生存、分化的交匯點(diǎn)或共同通路。其變更會(huì)導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)的不平衡，引起細(xì)胞增殖失控。已有研究證實(shí)，在多種人類腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞系中，MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常表達(dá)或異常活化，提示該通路調(diào)控異常，與腫瘤關(guān)系密切［7］。2004年Yoshino等［8］闡述了MAPK通路與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系。認(rèn)為MAPK通路能夠影響多種細(xì)胞因子的表達(dá)和功能，其上調(diào)對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜的生長(zhǎng)和種植起到重要作用［9，10］。

BRAF基因，全名為鼠類肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌基因同源體B1，是1988年由Ikawa等［11］首先在人類尤文氏肉瘤中發(fā)現(xiàn)并克隆確認(rèn)的，是一個(gè)能轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞且有活性的DNA序列，與ARAF和CRAF（RAF-1）同屬RAF家族，是一種癌基因，其編碼的BRAF蛋白為MAPK激酶的激酶［12］，是MAPK激酶家族里最高效的磷酸化劑，它位于MAPK通路入口處，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。BRAF突變后持續(xù)性激活MAPK通路，使前有絲分裂原有效分裂能力增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和分化。自Davies等［13］報(bào)道約66%的惡性黑色素瘤和15%的結(jié)腸癌中BRAF基因存在體細(xì)胞錯(cuò)義突變后，該基因與腫瘤關(guān)系的研究漸成熱點(diǎn)。本課題組通過(guò)cDNA代表差異性分析技術(shù)篩查出BRAF基因?yàn)樽訉m內(nèi)膜異位癥差異性高表達(dá)基因之一［3］，但其在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)尚不清楚。Yotova等［14］研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜與正常子宮內(nèi)膜中BRAF基因水平相似，但在位內(nèi)膜中BRAF基因的活化率高于正常子宮內(nèi)膜，從而使MAPK信號(hào)通路被異常激活，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶持續(xù)活化，導(dǎo)致在位內(nèi)膜細(xì)胞高速增殖。故即使在相同的外部刺激和環(huán)境下，在位內(nèi)膜更易增殖、遷徙。

本研究也顯示，子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜中BRAFmRNA相對(duì)表達(dá)量、BRAF蛋白陽(yáng)性表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度均明顯高于正常內(nèi)膜，證明子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜BRAF基因表達(dá)及活性均明顯強(qiáng)于正常內(nèi)膜，與Yotova等［14］的研究結(jié)果相似，因此有理由推測(cè)，子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜中BRAF基因的活化率增高，進(jìn)而使其轉(zhuǎn)錄的mRNA水平增高，高水平的BRAFmRNA又使其編碼的BRAF蛋白高表達(dá)，從而持續(xù)激活MAPK信號(hào)通路，使在位內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)和分化調(diào)節(jié)失控，從而導(dǎo)致在位內(nèi)膜細(xì)胞更易增殖、遷徙，形成子宮內(nèi)膜異位癥。BRAF基因有可能是MAPK信號(hào)通路上游調(diào)控基因之一，在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生中起重要作用，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展中，BRAF基因是否在其病情進(jìn)展中持續(xù)發(fā)揮作用，目前少見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜異位癥組異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜比較，BRAFmRNA表達(dá)及蛋白陽(yáng)性表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度均無(wú)差異，似與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)展無(wú)關(guān)，但子宮內(nèi)膜異位癥病變廣泛性、病理多態(tài)性特點(diǎn)［1］導(dǎo)致異位病灶中異位內(nèi)膜細(xì)胞含量不確定因素可能是影響本研究結(jié)果的因素之一，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、增加細(xì)胞模型及動(dòng)物模型等多層次深入研究。

綜上所述，本研究檢測(cè)了BRAF在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)情況及表達(dá)部位，其在異位及在位內(nèi)膜中的高表達(dá)與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生相關(guān)，證明BRAF基因在在位內(nèi)膜的高表達(dá)是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制之一，而其在病情進(jìn)展中的作用及其進(jìn)一步的多層次研究及機(jī)制研究值得關(guān)注。

［1］Bulun SE.Endometriosis［J］.N Engl J Med，2009，360（3）：268-279.

［2］Matsuzaki S，Canis M，Vaurs-Barrière C，et al.DNA microarray analysis of gene expression profiles in deep endometriosis using laser capture microdissection［J］.Mol Hum Reprod，2004，10（10）：719-728.

［3］Chen Q，Zhang C，Chen Y，et al.Identification of endometriosisrelated genes by representational difference analysis of cDNA［J］. Aust N Z J Obstet Gynaecol，2012，52（2）：140-145.

［4］Sampson JA.Peritoneal endometriosis due to the menstrual dissemination of endometrial tissue into the peritoneal cavity［J］.Am J Obstet Gynecol，1927，14：422-469.

［5］Giudice LC，Kao LC.Endometriosis［J］.Lancet，2004，364（9447）：1789-1799.

［6］郎景和.子宮內(nèi)膜異位癥的研究與設(shè)想［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2003，8（38）：478-480.

［7］Bukulmez O，Hardy DB，Carr BR，et al.Androstenedione up-regulation of endometrial aromatase expression via local conversion to estrogen：potential relevance to the pathogenesis of endometriosis［J］. J Clin Endocrinol Metab，2008，93（9）：3471-3477.

［8］Yoshino O，Osuga Y，Hirota Y，et al.Possible pathophysiological roles of mitogen-activated protein kinases（MAPKs）in endometriosis［J］.Am J Reprod Immunol，2004，52（5）：306-311.

［9］Yamauchi N，Harada T，Taniguchi F，et al.Tumor necrosis factoralpha induced the release of interleukin-6 from endometriotic stromal cells by the nuclear factor-kappaB and mitogen activated protein kinase pathways［J］.Fertil Steril，2004，82（Suppl 3）：1023-1028.

［10］Wu Y，Kajdacsy-Balla A，Strawn E，et al.Transcriptional characterizations of differences between eutopic and ectopic endometrium［J］.Endocrinology，2006，147（1）：232-246.

［11］Ikawa S，F(xiàn)ukui M，Ueyama Y，et al.B-raf，a new member of the raf family，is activated by DNA rearrangement［J］.Mol Cell Biol，1988，8（6）：2651-2654.

［12］吳偉，孫文勇.BRAF基因突變與結(jié)直腸癌的研究進(jìn)展［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2011，5（27）：903-905.

［13］Davies H，Bignell GR，Cox C，et al.Mutations of theBRAFgene in human cancer［J］.Nature，2002，27（417）：949-954.

［14］Yotova IY，Quan P，Leditznig N，et al.Abnormal activation of Ras/ Raf/MAPK and RhoA/ROCKⅡsignalling pathways in eutopic endometrial stromal cells of patients with endometriosis［J］.Hum Reprod，2011，26（4）：885-897.

（編輯 陳姜）

Expression and Significance of BRAF Gene in Ectopic Endometrium ofWomen with Endometriosis

CHUDa-ming，WANGDan-bo，LIYan，LIUKui-ran
（DepartmentofObstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the expression ofBRAFin ectopic and eutopic endometrium ofwomen with endometriosis.MethodsQuantitative real-time polymerase chain reaction（RT-PCR）and immunohistochemistry SP method were adopted to measure theBRAFexpression in ectopic and eutopic endometrium（n=20）ofpatientswith endometriosis，as wellas normalendometrium（n=20）ofwomen withoutendometriosis.Re?sultsRelative expression ofBRAFmRNA in eutopic endometrium（0.000 067 897 0±0.000 114 528 6）was significantly higher than that in control group（0.000 009 543 1±0.000 006 454 3）（P＜0.05），but no difference was found between the ectopic（0.000 029 395 7±0.000 038 046 9）and eutopic group（P＞0.05）.The expression rate and intensity of BRAF in ectopic and eutopic endometrium was significantly higher than the control group（P＜0.05）；however，there was no significant difference between ectopic and eutopic endometrium（P＞0.05）.ConclusionThe high expression ofBRAFin eutopic endometrium may play a crucial role in the occurrence of endometriosis，while the correlation with disease progression needsto be furtherverified.

endometriosis；BRAF；endometrium；quantitative real-time polymerase chain reaction；immunohistochemistry

R711.71

A

0258-4646（2014）09-0790-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（81070467，81270675）；“盛京自由研究者”基金（201204）

褚達(dá)明（1985-），男，醫(yī)師，碩士.

王丹波，E-mail：wangdb@sj-hospital.org

2014-06-18

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