傷寒沙門(mén)菌線性質(zhì)粒pBSSB1的p17基因的生物學(xué)功能分析

朱云霞吳佳龔明玉侯書(shū)寧張綺思陳敏潔張海方，2

（1.江蘇大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物化學(xué)系，鎮(zhèn)江 212013；2.蘇州大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，蘇州 215004）

傷寒沙門(mén)菌線性質(zhì)粒pBSSB1的p17基因的生物學(xué)功能分析

朱云霞1吳佳1龔明玉1侯書(shū)寧1張綺思1陳敏潔1張海方1，2

（1.江蘇大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物化學(xué)系，鎮(zhèn)江 212013；2.蘇州大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，蘇州 215004）

H：z66陽(yáng)性傷寒沙門(mén)菌含有一特有的介導(dǎo)鞭毛單向相變換的線性質(zhì)粒pBSSB1，其上第17號(hào)基因（p17）編碼一未知功能蛋白（P17）。利用λ-Red系統(tǒng)制備p17基因缺陷變異株，測(cè)定變異株和野生株的生長(zhǎng)曲線，比較其生長(zhǎng)差異，同時(shí)通過(guò)半固體LB培養(yǎng)基進(jìn)行動(dòng)力試驗(yàn)比較其動(dòng)力差異。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得p17基因，構(gòu)建其重組表達(dá)載體pET28a（+）-p17，通過(guò)鎳柱純化目的蛋白P17-His6，純化后蛋白作為抗原免疫兔子以制備多克隆抗體。結(jié)果顯示，制備了p17基因缺陷變異株，變異株的生長(zhǎng)明顯遲緩于野生株（P＜0.05），變異株的動(dòng)力明顯減弱。構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET28a（+）-p17，純化獲得了高純度的目的蛋白P17-His6并制得相應(yīng)的多克隆抗體。

傷寒沙門(mén)菌 線性質(zhì)粒 pBSSB1 p17

傷寒沙門(mén)菌是一種重要的人類(lèi)病原菌，且已成為原核生物基因表達(dá)調(diào)控研究的模式菌之一［1，2］。pBSSB1是H∶z66陽(yáng)性傷寒沙門(mén)菌所特有的一線性質(zhì)粒，該質(zhì)粒是腸桿菌科中目前為止發(fā)現(xiàn)的首個(gè)線

性質(zhì)粒，其介導(dǎo)了H∶z66陽(yáng)性傷寒沙門(mén)菌鞭毛的單向相變換［3-6］。pBSSB1全長(zhǎng)27 kb，共編碼33個(gè)基因，其中包括二相鞭毛素編碼基因fljBz66和fljA樣基因［3，7，8］。Baker等［3］報(bào)道pBSSB1可能的雙向復(fù)制起始點(diǎn)位于該質(zhì)粒編碼的第17號(hào)基因（p17）的上游?；騪17經(jīng)生物信息學(xué)分析和預(yù)測(cè)，其編碼蛋白P17含有特征性同源序列，該序列存在于參與調(diào)控DNA復(fù)制等生物學(xué)功能的DNA結(jié)合蛋白如ParA和Soj等蛋白中［9］。另外，蛋白P17具有與RepABC質(zhì)粒編碼的RepA蛋白同源的ATP酶結(jié)構(gòu)域［10］。但目前為止，關(guān)于基因p17的確切生物學(xué)功能還不甚清楚。

本研究通過(guò)制備p17基因缺陷變異株，測(cè)定缺陷株和野生株的生長(zhǎng)曲線，對(duì)p17基因可能的生物學(xué)功能進(jìn)行初步探討；另外，通過(guò)原核表達(dá)蛋白P17，并制備其相應(yīng)的多克隆抗體，利用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)抗體的特異性以及p17基因的表達(dá)情況，旨為深入研究p17基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 傷寒沙門(mén)菌GIFU10007由日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物室惠贈(zèng)；質(zhì)粒pKD46（溫度敏感型，含有受阿拉伯糖啟動(dòng)子調(diào)控的gam，bet和exo基因，Apr）由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所惠贈(zèng)；質(zhì)粒pET28a（+）、E. coli DH5α、E. coli BL21（DE3）等均由本室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 DNA聚合酶pfu、DNA聚合酶rTaq、限制性核酸內(nèi)切酶Nco I、Xho I、T4 DNA連接酶均購(gòu)自寶生物工程有限公司（大連，TaKaRa），質(zhì)粒提取試劑購(gòu)自Axygen公司。其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。Gene Pulsero Ⅱ電轉(zhuǎn)化儀（Bio-Rad），核酸紫外檢測(cè)儀（Eppendorf Biophotometer），PCR儀（AB I 2720），蛋白電泳儀（Bio-Rad），凝膠成像系統(tǒng)（Gene Genius BIO IMAGING SYSTEM），蛋白電泳儀（Bio-Rad），離心機(jī)，超聲破碎儀。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)線性質(zhì)粒pBSSB1的序列和pET28a（+）的序列信息，設(shè)計(jì)基因p17缺陷株制備、缺陷株驗(yàn)證及構(gòu)建p17編碼蛋白P17的重組表達(dá)載體pET28a（+）-p17等引物。制備p17基因缺陷株引物設(shè)計(jì)：p17基因的ORF全長(zhǎng)641 bp，分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物L(fēng)1-Kl/R1-Kr和L2/R2，擴(kuò)增含有長(zhǎng)度為79 bp的p17ORF上下游同源臂的卡那霉素抗性基因片段，用來(lái)敲除p17全部的ORF。p17缺陷株驗(yàn)證引物V-L/V-R設(shè)計(jì)：V-L來(lái)自基因序列中上游同源臂外側(cè)一段16 bp的序列，V-R來(lái)自卡那霉素抗性基因中一段16 bp的序列。重組表達(dá)載體pET28a（+）-p17引物設(shè)計(jì)：在p17基因上下游設(shè)計(jì)引物PA/PB，在5'端分別加上Nco I及Xho I酶切位點(diǎn)用以酶切后連接pET28a（+）載體。引物均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列如表1所示 。

表1 引物序列

1.2.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備及Red重組功能的誘導(dǎo) 將編碼Red重組系統(tǒng)的質(zhì)粒pKD46電轉(zhuǎn)至傷寒沙門(mén)菌GIFU10007中，篩選陽(yáng)性克隆，作為下一步轉(zhuǎn)化的宿主菌，即007-pKD46。挑取007-pKD46單菌落接種于2 mL LB培養(yǎng)基中37℃、250 r/min振搖過(guò)夜；然后1∶100轉(zhuǎn)接至20 mL等滲LB培養(yǎng)基中，

37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)早期（OD600：0.4）；加入L-阿拉伯糖（終濃度為1 mmol/L），誘導(dǎo)1 h后冰上靜置30 min，離心棄上清；沉淀用預(yù)冷的滅菌水漂洗3次，再用4 mL預(yù)冷的10%甘油洗1次，最后用80 μL預(yù)冷的10%甘油懸浮，每40 μL分裝于EP管中放于冰上備用。

1.2.3 基因p17缺陷株的制備 在參考文獻(xiàn)［11］的基礎(chǔ)上稍作改動(dòng)，主要步驟如下：以環(huán)狀質(zhì)粒pET28a（Kanr）為模板，用特異性引物L(fēng)1-Kl/R1-Kr擴(kuò)增出帶有p17基因上下游同源臂的卡那霉素抗性基因片段F1。然后以第1輪PCR產(chǎn)物為模板，用L2/R2做引物擴(kuò)增出延長(zhǎng)了同源臂的片段F2。用酚-氯仿抽提純化PCR產(chǎn)物F2。將007-pKD46的感受態(tài)細(xì)胞、電極杯和PCR產(chǎn)物均放于冰上，保持低溫狀態(tài)。打開(kāi)電轉(zhuǎn)儀，調(diào)節(jié)參數(shù)：電阻200 Ω，電容25 μF，電壓2.0 kV。取2 μg PCR產(chǎn)物F2加入40 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，轉(zhuǎn)入電極杯中，迅速放到電轉(zhuǎn)儀上，啟動(dòng)電擊。聽(tīng)到“滴”聲后，取出電極杯，加入1 mL 37℃預(yù)溫的LB液體培養(yǎng)基輕輕混勻，轉(zhuǎn)移至EP管中，置于37℃金屬浴1 h。然后25℃、4 000 r/min，離心10 min，棄去900 μL上清液，將剩余液體重懸細(xì)菌后涂布于含有卡那霉素的LB平板37℃過(guò)夜，挑取長(zhǎng)出的若干菌落通過(guò)驗(yàn)證引物V-L/V-R進(jìn)行PCR篩選，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子最后經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，即為p17基因缺陷株，命名為Δp17。

1.2.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 分別挑取傷寒沙門(mén)菌GIFU10007和Δp17單菌落于2 mL LB培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；過(guò)夜細(xì)菌以1∶100轉(zhuǎn)接于新鮮等滲（pH 7.0）LB培養(yǎng)液中（野生株和缺陷株的OD600值一致），37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔1 h用分光光度計(jì)檢測(cè)OD600值并記錄，直至12 h。試驗(yàn)經(jīng)3次生物學(xué)重復(fù)后，以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)制作生長(zhǎng)曲線，比較野生株和p17缺陷株的生長(zhǎng)情況。

1.2.5 動(dòng)力試驗(yàn) 分別挑取傷寒沙門(mén)菌GIFU10007和Δp17單菌落進(jìn)行四區(qū)劃線，用滅菌后的牙簽挑取劃線后的大小均勻的野生株和Δp17單菌落接種于0.3%的半固體LB培養(yǎng)板上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。

1.2.6 重組載體的構(gòu)建與鑒定 參考文獻(xiàn)［12］的方法，用DNA膠回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物，NcoⅠ和Xho Ⅰ同時(shí)雙酶切PCR回收產(chǎn)物和表達(dá)載體pET28a（+），酶切產(chǎn)物用酚/氯仿抽提、乙醇沉淀純化后，用T4 DNA連接酶4℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。挑取若干連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化菌單菌落，分別增菌于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)6 h后，收集上述菌體于30 μL 雙蒸水中，加等體積的酚/氯仿漩渦震蕩，離心取上清15 μL上樣，1 %瓊脂糖凝膠電泳觀察質(zhì)粒大小，篩選可疑的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒。提取可疑的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，采用雙酶切和PCR方法鑒定陽(yáng)性克隆，再通過(guò)DNA測(cè)序分析最終確認(rèn)。陽(yáng)性克隆質(zhì)粒熱激法轉(zhuǎn)化至E. coli BL21（DE3）。

1.2.7 P17蛋白的表達(dá) 挑取新鮮的含重組質(zhì)粒pET28a（+）-p17的大腸桿菌BL21（DE3）單菌落及含空質(zhì)粒pET28a（+）的對(duì)照大腸桿菌BL21（DE3）單菌落分別置于2 mL LB 培養(yǎng)液中（卡那霉素終濃度50 μg/mL），37℃振搖過(guò)夜，次日以1∶100加入20 mL LB 培養(yǎng)液中37℃振搖2-3 h后長(zhǎng)至OD600nm為0.5-0.8，加入IPTG 至終濃度分別為0.1 mmol/L，于20℃繼續(xù)振搖5 h進(jìn)行誘導(dǎo)，離心取沉淀，4℃超聲破碎后離心取上清液進(jìn)行SDS-PAGE。

1.2.8 P17蛋白的純化 在上述表達(dá)的優(yōu)化條件下用1 000 mL LB培養(yǎng)基大批量誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心收集菌體后，用PBS（pH7.2）洗滌3次，按照每克菌（濕重）加入15 mL 過(guò)柱緩沖液的比例重懸菌體，超聲破碎后離心收集上清液。以15 mL/h流速上樣于Ni柱中之后用20 倍柱體積的洗滌緩沖液沖洗Ni柱，移除未結(jié)合的蛋白；用洗脫緩沖液洗脫結(jié)合于Ni柱的蛋白。收集洗脫液，加入到處理后的透析袋中進(jìn)行透析，透析后的蛋白取出離心取上清，并進(jìn)行SDS-PAGE。

1.2.9 兔抗P17蛋白的多克隆抗體的制備 首次免疫取上述純化獲得的目的蛋白P17與弗氏完全佐劑1∶1乳化，按每只兔50 μg/mL抗原劑量，于背部皮下多點(diǎn)注射共計(jì)1 mL的方式進(jìn)行免疫，之后每隔1周用弗氏不完全佐劑與純化獲得的目的蛋白P17以1∶1乳化，共免疫5次，末次免疫1周后頸動(dòng)脈取血制備抗血清?？寡褰?jīng)初步純化后獲得兔抗P17蛋白的多克隆抗體，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆?。用抗體與傷寒沙門(mén)菌GIFU10007全菌蛋白進(jìn)行Western-

blotting以檢測(cè)抗體的特異性，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［12］。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以 P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 傷寒沙門(mén)菌pBSSB1-17基因缺陷變異株的制備

如圖1所示，PCR擴(kuò)增得到1 165 bp的F1片段，以F1片段為模板，PCR擴(kuò)增獲得含同源臂的1 243 bp的片段F2；將F2片段電擊轉(zhuǎn)化入含有pKD46的傷寒沙門(mén)菌野生株感受態(tài)細(xì)胞中，在含卡那霉素（終濃度為50 μg/mL）的LB平板篩選到了陽(yáng)性克隆，用V-L/V-R作引物通過(guò)PCR驗(yàn)證8個(gè)陽(yáng)性克隆，均獲得了272 bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果一致，證明p17基因缺陷株制備成功，命名為Δp17。

圖1 傷寒沙門(mén)菌pBSSB1的p17基因缺陷變異株的制備

2.2 p17基因缺陷株生長(zhǎng)特性分析

p17基因缺陷株和傷寒沙門(mén)菌GIFU10007野生株在普通培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線如圖2所示，結(jié)果表明Δp17的生長(zhǎng)能力明顯遲緩于野生株（P＜0.05），提示p17基因可能參與調(diào)控細(xì)菌的生長(zhǎng)。

圖2 傷寒沙門(mén)菌GIFU10007野生株和p17基因缺陷株的生長(zhǎng)曲線

2.3 野生株和缺陷株的動(dòng)力比較

傷寒沙門(mén)菌GIFU10007野生株和p17基因缺陷株在0.3%的半固體培養(yǎng)基上的動(dòng)力比較如圖3所示，p17基因缺失后其動(dòng)力明顯減弱，說(shuō)明p17基因參與調(diào)控細(xì)菌的動(dòng)力。

圖3 傷寒沙門(mén)菌GIFU10007野生株和p17基因缺陷株的動(dòng)力圖

2.4 傷寒沙門(mén)菌P17蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

如圖4所示，PCR擴(kuò)增獲得了與預(yù)期大小相符的646 bp的p17基因片段。該片段經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切后克隆到表達(dá)載體pET28a（＋）上，將重組質(zhì)粒pET28a（＋）-p17轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α得到了陽(yáng)性克隆 。提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，經(jīng)Nco I和Xho Ⅰ雙酶切獲得約646 bp的片段，大小與PCR 產(chǎn)物一致，證明P17蛋白表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖4 重組表達(dá)載體ET28a（+）-p17的鑒定

2.5 P17-His6重組蛋白的表達(dá)與純化

在最佳的條件即20℃，IPTG終濃度為0.1 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)5 h，上清經(jīng)Ni柱純化獲得P17-His6蛋白，結(jié)果如圖5所示。

圖5 重組蛋白P17-His6的表達(dá)與純化

2.6 兔抗P17-His6多克隆抗體的鑒定及應(yīng)用

將重組蛋白P17-His6免疫兔子制備了兔抗P17的多克隆抗血清，純化后的多克隆抗體與傷寒沙門(mén)菌GIFU10007野生株和p17基因缺陷株的全菌蛋白經(jīng)Western blotting鑒定，如圖6所示，在缺陷株中未鑒定到p17基因的編碼蛋白P17，說(shuō)明所制備的抗體與抗原反應(yīng)的特異性良好，同時(shí)也說(shuō)明p17基因在正常生長(zhǎng)條件下有一定的表達(dá)，提示該基因具有一定的生物學(xué)功能。

3 討論

質(zhì)粒是指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子，它們能為宿主提供抗藥性等一些額外的功能［13］。絕大多數(shù)的細(xì)菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA分子，1979年在婁徹霉菌中發(fā)現(xiàn)了第一例原核生物線性質(zhì)粒，該發(fā)現(xiàn)糾正了所有細(xì)菌質(zhì)粒都是環(huán)狀結(jié)構(gòu)這一傳統(tǒng)觀點(diǎn)［14］。

圖6 抗體特異性的免疫印跡鑒定

線性質(zhì)粒pBSSB1介導(dǎo)H∶z66陽(yáng)性傷寒沙門(mén)菌的鞭毛單向相變換，該質(zhì)粒全長(zhǎng)27 kb，共編碼33個(gè)基因，其表達(dá)特性已由本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道，特別是其中二相鞭毛素編碼基因fljBz66和fljA樣基因功能已明確［3-8，15，16］。另外，我們發(fā)現(xiàn) Fis蛋白可以影響pBSSB1的穩(wěn)定性［17］。通過(guò)對(duì)其序列比對(duì)分析和GC含量偏移分析發(fā)現(xiàn)，緊鄰基因p17的上游可能是該質(zhì)粒的一個(gè)雙向復(fù)制起始位點(diǎn)。基因p17編碼蛋白（P17），具有ParA和Soj蛋白的高度同源結(jié)構(gòu)域序列。研究表明，ParA和Soj蛋白參與許多質(zhì)粒、噬菌體和細(xì)菌基因組染色體DNA的復(fù)制和分配［9］。另外，P17具有與RepABC質(zhì)粒編碼的RepA蛋白同源的ATP酶結(jié)構(gòu)域，在17號(hào)基因的編碼區(qū)上游含有GANTC序列，該序列是RepABC質(zhì)粒編碼的repABC操縱子所具有的特征性序列［10］。另外，Zhang等［18］在研究鏈霉菌屬線性質(zhì)粒pFRL1時(shí)發(fā)現(xiàn)編碼的rlr基因可以幫助啟動(dòng)該質(zhì)粒的復(fù)制，由于rlr基因也緊鄰線性質(zhì)粒pFRL1的復(fù)制起始區(qū)，我們推測(cè)線性質(zhì)粒pBSSB1編碼的17號(hào)基因可能和鏈霉菌線性質(zhì)粒pFRL1的rlr基因具有類(lèi)似的功能。但是，P17蛋白在傷寒沙門(mén)菌中發(fā)揮作用的分子機(jī)制還有待于深入研究。

4 結(jié)論

本研究首次制備了傷寒沙門(mén)菌pBSSB1的p17基因缺陷株，發(fā)現(xiàn)缺陷株的生長(zhǎng)明顯遲緩于野生株，且p17基因缺失后細(xì)菌的動(dòng)力明顯減弱，這提示基因p17可能具有調(diào)控細(xì)菌的生長(zhǎng)和動(dòng)力等功能；另外，克隆表達(dá)了基因p17，純化獲得了重組蛋白P17-His6及其多克隆抗體，為進(jìn)一步深入研究基因p17的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

A Preliminary Study on the Biological Function of a Gene p17 Located on a Linear Plasmid pBSSB1 of Salmonella enterica serovar Typhi

Zhu Yunxia1Wu Jia1Gong Mingyu1Hou Shuning1Zhang Qisi1Chen Minjie1Zhang Haifang1，2
（1. Department of Biochemistry and Molecular Biology，School of Medical Science and Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang 212013；2. Department of Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou 215004）

pBSSB1 is a linear plasmid which mediates the flagellar phase variation in H：z66 positive Salmonella enterica serovar Typhi（S. Typhi）. The gene named p17 is located on pBSSB1 and it encodes the protein P17 whose function is unknown. The p17 deleted mutant of S. Typhi was prepared through the λ-Red recombination system. The growth curves of wild type and p17 mutant strain were detected to compare their growth ability. The motility of wild type and p17 mutant strains was compared through the experiments on the semi-solid LB plates. The specific primers were designed to amplify the gene p17 by PCR. The amplicon was inserted into the expression vector pET28a（+）to construct recombinant vector pET28a（+）-p17, which was then transferred to E. coli BL21（DE3）to be expressed. The recombinant protein P17-His6was purified with Ni-TED packed column and was used as immunogen to prepare the rabbit anti-P17 polyclonal antibody. The results showed that p17 deleted mutant of S. Typhi was constructed successfully. It was showed that the growth of p17 mutant strain was significantly slower compared with the wild type strain（P＜0.05）. The motility of p17 mutant strain was decreased obviously compared to the wild type strain. The gene p17 of S. Typhi was inserted into the vector pET-28a（+）and was expressed in E. coli BL21（DE3）. The rabbit anti-P17 polyclonal antibody was prepared.

Salmonella enterica serovar Typhi Linear plasmid pBSSB1 p17

2014-02-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31000076），中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2013M531278），江蘇省博士后科研資助計(jì)劃項(xiàng)目（1202011B），江蘇大學(xué)大學(xué)生科研立項(xiàng)資助項(xiàng)目（12A123，13A239）

朱云霞，女，碩士研究生，研究方向：病原菌分子致病機(jī)制；E-mail：zhuyunxia3032@163.com

張海方，男，博士，副教授，研究方向：分子細(xì)菌學(xué)；E-mail：haifangzhang@sina.com