• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    溶藻弧菌dldh基因突變株的構(gòu)建及其生物學功能研究

    2014-03-21 06:56:52龐歡瑛陳立明黃郁蔥簡紀常魯義善吳灶和
    生物技術(shù)通報 2014年10期
    關(guān)鍵詞:溶藻弧菌生物膜

    龐歡瑛陳立明黃郁蔥簡紀常魯義善吳灶和

    (1. 廣東海洋大學 水產(chǎn)學院,湛江 524088;2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室,湛江 524088;3.廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制重點實驗室,湛江 524088;4. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學院,廣州 510225)

    溶藻弧菌dldh基因突變株的構(gòu)建及其生物學功能研究

    龐歡瑛1,2,3陳立明1,2,3黃郁蔥1,2,3簡紀常1,2,3魯義善1,2,3吳灶和2,3,4

    (1. 廣東海洋大學 水產(chǎn)學院,湛江 524088;2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室,湛江 524088;3.廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制重點實驗室,湛江 524088;4. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學院,廣州 510225)

    為揭示二氫硫辛酰胺脫氫酶(Dihydrolipoamide dehydrogenase,DLDH)在溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)致病中的作用,以pRE112自殺質(zhì)粒為載體,應(yīng)用插入失活突變法構(gòu)建dldh基因插入突變株,比較分析了野生株ZJ03與缺失株ZJ03Δdldh在生長、泳動能力、酶活性、生物膜形成、致病性的表現(xiàn)。結(jié)果表明,dldh基因的突變,使溶藻弧菌生長的遲緩期延長、泳動能力顯著減弱(P<0.05),酶活性顯著降低(P <0.05),生物膜生成顯著減少(P <0.05),對石斑魚(Epinephelus coioides)的致病性也明顯減弱(P <0.05)。本研究為從細菌能量代謝角度研究弧菌的致病機制提供理論依據(jù)。

    溶藻弧菌 dldh 缺失株 生物特性

    二氫硫辛酰胺脫氫酶(Dihydrolipoamide dehydrogenase,DLDH)又稱硫辛酰胺脫氫酶或二氫硫辛酸脫氫酶,它廣泛存在于各種生物中,主要分布在生物的線粒體或質(zhì)膜中[1]。DLDH是3種a丙酮酸

    脫氫酶復合體不可或缺的組成部分,它與谷光甘肽還原酶、汞還原酶[2]、硫氧還蛋白和錐蟲胱甘肽還原酶(Trypanothione reductase)[3]同屬黃素蛋白氧化還原酶家族[4],在能量代謝中起重要作用。然而,近年來的研究發(fā)現(xiàn)DLDH不僅行使氧化還原酶的功能,在細菌感染過程中也起重要作用。在豬鏈球菌(Streptococcus suis)中,DLDH為膜蛋白,是介導細菌粘附的重要成分之一[5],參與感染的發(fā)生。在雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum)中,DLDH 是毒力決定因子之一[6]。DLDH在肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)中與幾種糖類的運輸有關(guān),dldh的缺失導致肺炎鏈球菌不能輸入和利用半乳糖、綿子糖和水蘇糖,而且?guī)缀鯁适Ц腥緞游锏哪芰Γ?]。由此可見DLDH雖然不編碼毒力因子,但在細菌感染中起重要作用。

    溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一種革蘭氏陰性短桿菌,廣泛存在于海水中,是水生動物弧菌病的主要病原菌之一[8-10],給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。此外,該菌可導致人類的腹瀉、中耳炎以及敗血癥等多種疾?。?1-12],嚴重危害人類健康。

    與其他病原菌一樣,弧菌的致病性主要取決于其與宿主之間的相互作用。弧菌通過黏附侵襲,在宿主體內(nèi)增殖,產(chǎn)生毒素等過程,造成宿主正常功能紊亂而引起死亡等。目前對溶藻弧菌致病機制的研究主要集中在毒力因子的研究上,但是現(xiàn)已證明,一些弧菌的毒力相關(guān)基因被敲除后,細菌仍然具有感染力[13]??梢姡【母腥臼怯蓮碗s的調(diào)控機制控制的,不僅僅取決于毒力因子。本研究以溶藻弧菌強毒株ZJ03為對象,通過基因重組技術(shù)構(gòu)建dldh基因插入缺失突變株,并通過與野生株的對比研究,探討DLDH的生物學功能的改變,為從能量代謝角度研究弧菌的致病機制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株和質(zhì)粒 溶藻弧菌野生株ZJ03,由本試驗室從廣東省湛江港海域患病紅笛鯛(Lutjanus erythopterus)魚體中分離并保存[14];大腸桿菌MC1061(λpir)和S17-1(λpir)自殺質(zhì)粒pRE112由中國科學院水生生物研究所謝海俠老師惠贈。

    1.1.2 試劑 TIANamp Bacteria DNA Kit購自北京天根生化科技有限公司。Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司。Easy Pfu DNA聚合酶、Easy PureTMQuick Gel Extraction Kit、Easy PureTMPlasmid MiniPrep Kit t購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。所有的引物合成和序列分析均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

    1.2 方法

    1.2.1 溶藻弧菌總DNA的提取 將溶藻弧菌ZJ03菌株涂布于TSA平板,挑選單菌落接種于TSB(2% NaCl)培養(yǎng)基,28℃振蕩培養(yǎng)18 h。取1 mL菌液于離心管中,10 000 r/min離心5 min收集菌體,參照試劑盒說明書提取基因組DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 溶藻弧菌dldh基因片段的克隆 根據(jù)GenBank上登錄的溶藻弧菌dldh基因序列(登錄號為AGK62253)設(shè)計1對引物:上游引物P1:CGGGGTACCTTTGGGACTCTACTGACGCTCT(下劃線為Kpn I位點),下游引物P2:CGAGCTCCGCTTCTTTTTCAGTCTTACCAAC(下劃線為Sac I位點),以提取的溶藻弧菌總DNA為模板進行PCR擴增,擴增包含部分NADH及FAD結(jié)合區(qū)域的片段,預計片段長度為615 bp。反應(yīng)條件為:94℃預變性4 min;94℃40 s,65℃ 40 s,72℃ 60 s,共31個循環(huán),再72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢驗后,用DNA 膠回收試劑盒切膠回收。

    1.2.3 自殺質(zhì)粒PRE112的提取 使用全士金公司的Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit試劑盒提取pRE112質(zhì)粒,-20℃保存。

    1.2.4 酶切及產(chǎn)物純化回收、連接 將回收擴增片段及提取質(zhì)粒,利用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Sac I分別進行酶切。將酶切回收后的dldh缺失片段與pRE112質(zhì)粒載體通過T4連接酶連接構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒pRE-Δdldh,并轉(zhuǎn)化入E. coli MC1061感受態(tài)細胞。

    1.2.5 溶藻弧菌突變株的構(gòu)建 (1)分別培養(yǎng)含有pRE-△dldh質(zhì)粒的大腸桿菌S17-1和野生型溶藻弧菌ZJ03至OD600達到0.5。(2)分別取200 μL大腸桿菌S17-1和50 μL溶藻弧菌混勻,6 000 r/min離心5 min,徹底去上清,加入60 μL TSB 液體培養(yǎng)

    基重懸菌體,將細菌按30 μL/spot接種于無抗性的TSA固體培養(yǎng)基平板上,置于28℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。(3)將TSA平板上的菌落用TSB液體培養(yǎng)基沖洗下來,并稀釋接種于含有氯霉素(Cm終濃度為25 μg/mL)的平板上,28℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h。(4)挑取單菌落,以dldh片段引物P1、P2,氯霉素基因引物Cm1(GGCCCTAA TACCTGTGACGGAAGAT)、Cm2(CGGGCCCTATCACTTATTCAGGCGT)以及Cm1、P2進行PCR,反應(yīng)條件為:94℃預變性4 min;94℃ 40 s,61℃ 40 s,63℃ 40s,72℃ 60 s,共31個循環(huán),再72℃延伸 10 min,篩選插入突變株并命名為ZJ03△dldh。

    1.2.6 突變株的遺傳穩(wěn)定性檢驗 將插入突變株△dldh在TSA培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)40代,利用引物Cm1、Cm2和Cm1、P2,PCR檢測突變株第40代的插入片段的遺傳穩(wěn)定性。

    1.2.7 突變株與野生株生長曲線的比較 將插入突變株ZJ03△dldh與野生株ZJ03分別接種于新鮮TSB培養(yǎng)基,28℃過夜培養(yǎng),將吸光值調(diào)至0.5(OD600),按照1∶100的比例分別接種到含有新鮮培養(yǎng)基的干凈試管中(各18支),28℃震蕩培養(yǎng),每隔1 h將對應(yīng)試管取出測定OD600值。以時間為橫坐標,以吸光值為縱坐標,繪制生長曲線,試驗重復3次。

    1.2.8 細菌泳動檢測 挑取野生株溶藻弧菌及插入突變株ZJ03△dldh的單菌落,接種于含瓊脂0.3%的TSA的平板上。28℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng),測定泳動圈直徑,試驗重復3次。

    1.2.9 酶活測定 二氫硫辛酰胺脫氫酶活性測定參照文獻[15]進行,具體方法如下。

    (1)分別培養(yǎng)野生株溶藻弧菌及插入突變株△dldh至OD600為0.5,然后分別進行超聲波破碎,取等量上清。(2)按照以下混合反應(yīng)液,首先在試管中加入 50 mmol/L、pH7.0 的磷酸鹽緩沖液 2.7 mL,于 37 ℃水浴保溫 10 min,依次加入0.6 mmol/L硫辛酰胺0.1 mL、1 mmol/L NADH 0.1 mL和蛋白液0.1 mL,立即混勻,使用紫外分光光度計于 340 nm 處檢測吸光值,每 5 min 讀數(shù)1次,連續(xù)測定 15 min。每組試驗重復3次,取平均值。二氫硫辛酰胺脫氫酶活性單位定義為:在上述反應(yīng)條件下每 min 氧化1 μmol NADH所需的酶量,為一個酶活性單位(U)。試驗重復3次。

    1.2.10 生物膜檢測 生物膜檢測方法參照文獻[16]。將溶藻弧菌野生株及突變株單菌落劃線接種于TSA平板上,28℃恒溫培養(yǎng)過夜。用2 mL新鮮液體TSB培養(yǎng)基沖洗平板,調(diào)OD600至0.5。用新鮮液體培養(yǎng)基將菌液以1∶20的比例稀釋,然后接種到96孔板中,每孔300 μL,每菌種設(shè)6個平行。陰性對照為等量TSB液體培養(yǎng)基。將96孔板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱,靜置培養(yǎng)48 h。無菌去離子水洗滌96孔板,每孔加300 μL,每次洗滌輕敲并倒置晾干,連續(xù)3次。每孔加150 μL甲醇,進行20 min固定,室溫晾干,倒置30 min。每孔加150 μL結(jié)晶紫草酸銨染液室溫染色15 min,自來水小心沖洗,直至流水澄清,室溫晾干。每孔小心加入150 μL 95%的酒精,室溫放置30 min,測定OD570。試驗重復3次。

    1.2.11 半致死率(LD50)檢測 利用斜帶石斑魚考察ZJ03和ZJ03Δdldh的致病力,具體操作如下:分別接種ZJ03和Δdldh的單菌落至TSB液體培養(yǎng)基中28℃,200 r/min搖床培養(yǎng)18 h,10 000×g離心5 min,收集菌液沉淀,用pH7.2的PBS清洗沉淀3次。用PBS調(diào)OD600至0.5,菌液的濃度約為108CFU/mL。將兩株細菌菌液分別用PBS稀釋至0、104、105、106、107、108CFU/mL,每個濃度注射20尾,每尾魚腹腔注射0.1 mL。記錄15 d內(nèi)魚體死亡數(shù)目。觀察死魚癥狀,并分離死魚體內(nèi)的細菌于TSA平板上培養(yǎng),PCR檢測16S rDNA,測序后確認死于溶藻弧菌感染。參照改進寇氏法計算半數(shù)致死量:

    lgLD50=Xk-d(∑Pi-0.5)

    其中,Xk為最大對數(shù)劑量,d為相鄰的兩組對數(shù)劑量之差數(shù),Pi為死亡率,i為組號。

    2 結(jié)果

    2.1 插入突變株的構(gòu)建

    利用引物P1、P2克隆dldh基因615 bp片段(圖1-A),將其插入自殺質(zhì)粒載體pRE112中,并通過同源重組插入溶藻弧菌基因組DNA中。利用引物Cm1、Cm2通過菌落PCR檢測,可以在溶藻弧菌中擴出936 bp的氯霉素條帶(圖1-B),而利用Cm1、P2引物可以擴增得到長度為1 596 bp的目的條帶,

    說明插入突變株構(gòu)建成功(圖1-C)。

    圖1 插入突變株ZJ03△dldh構(gòu)建過程

    2.2 插入失活突變株遺傳穩(wěn)定性檢測

    將突變株ZJ03△dldh在TSA平板上連續(xù)傳代培養(yǎng)40代,利用引物Cm1、Cm2和Cm1、P2檢測突變株的遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果表明,突變株在培養(yǎng)40代后仍能能擴出936 bp氯霉素條帶(圖2-A)和1 596 bp的插入片段(圖2-B),表明插入片段可以在溶藻弧菌中穩(wěn)定遺傳。

    圖2 ZJ03△dldh的遺傳穩(wěn)定性分析

    2.3 生長曲線的測定

    通過對溶藻弧菌野生株及插入突變株△dldh在TSB培養(yǎng)基中的生長曲線進行比較可以看出,dldh基因的突變對溶藻弧菌的生長具有一定的影響。在遲緩期,野生株經(jīng)過5 h生長后 OD600達0.5,而突變株OD600達0.5時需要7 h;在指數(shù)期,野生株經(jīng)過10 h生長后 OD600達2,而突變株OD600達2時需要11 h;在穩(wěn)定期,兩株細菌在經(jīng)過27 h生長后菌體濃度OD600均在2.7左右(圖3)。從生長曲線可以看出,dldh基因的突變對細菌生長的影響主要表現(xiàn)在遲緩期,進入指數(shù)期后生長情況與野生株差別不大。

    圖3 野生株和突變株的生長曲線

    2.4 細菌泳動試驗

    將野生溶藻弧菌ZJ03與突變株ZJ03△dldh接種于泳動平板上,其泳動結(jié)果如圖4所示。野生株泳動圈為3.51±0.15,突變株為2.11±0.22,根據(jù)泳動圈直徑統(tǒng)計分析可知dldh缺失后溶藻弧菌的泳動能力顯著降低(P<0.05)。

    2.5 酶活測定

    通過酶活性測定發(fā)現(xiàn),突變株ZJ03△dldh單位活性為(0.091±0.005)U/mg,而野生株單位酶活

    性為(0.316 ±0.008)U/mg,可見敲除株酶活性顯著降低(P<0.05),dldh的突變會影響溶藻弧菌的二氫硫辛酰胺脫氫酶活性。

    圖4 野生株和突變株的泳動能力

    2.6 生物膜檢測

    通過檢測發(fā)現(xiàn),溶藻弧菌野生株與突變株的生物膜形成能力如圖5所示。兩株弧菌的生物膜形成有顯著差異(P<0.05),說明dldh的缺失會影響溶藻弧菌生物膜的形成。

    圖5 野生株和突變株的生物膜

    2.7 LD50檢測結(jié)果

    將ZJ03和ZJ03Δdldh分別注射斜帶石斑魚,攻毒結(jié)果如表1所示。由試驗結(jié)果可知,dldh的缺失使野生型溶藻弧菌的毒力下降約兩個數(shù)量級。LD50檢測結(jié)果表明,dldh影響了溶藻弧菌的致病力。毒力下降的原因可能是由于缺失株在魚體內(nèi)的能量代謝受阻,對魚體內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)性降低,增值能力減弱,從而導致感染力下降。

    3 討論

    突變株的構(gòu)建方法主要有一次同源重組和二次同源重組方法[17]。本試驗采用一步同源重組法構(gòu)建dldh插入失活突變株,將dldh內(nèi)部包含部分NADH及FAD結(jié)合區(qū)域的片段克隆到自殺載體pRE112上,通過接合轉(zhuǎn)移,利用同源重組將載體質(zhì)粒整合于溶藻弧菌染色體上,構(gòu)建插入失活突變株ZJ03Δdldh,并對其相關(guān)的生物學變化進行了比較研究。

    表1 不同菌株的LD50

    dldh作為能量代謝關(guān)鍵酶類,對生物的生長起著重要的作用。在對肺炎鏈球菌的研究中發(fā)現(xiàn),dldh的缺失使細菌在棉子糖和水蘇糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上的生長顯著下降[18]。在本研究中dldh基因的突變對細菌生長的影響主要表現(xiàn)在遲緩期的延長上,這可能是由于dldh的缺失造成初始期的能量代謝障礙所致[7]。

    端生鞭毛以及眾多的周生鞭毛都會影響弧菌的泳動力。而細菌的鞭毛泳動能力與黏附力和侵襲力相關(guān)[19]。在豬鏈球菌的研究中發(fā)現(xiàn),dldh在豬鏈球菌黏附細胞的過程中發(fā)揮重要作用[5]。在布氏錐體蟲中,研究者發(fā)現(xiàn)dldh基因在鞭毛區(qū)域大量分布[20]。在本研究中,ZJ03Δdldh的泳動力顯著減弱,表明dldh與溶藻弧菌的泳動能力相關(guān)聯(lián)。

    生物膜的形成是細菌定植在宿主細胞膜表面,從而導致耐藥性和免疫防御的一種多細胞行為[21]?;【锬さ男纬膳c一些特定的結(jié)構(gòu)(纖毛、鞭毛和胞外多糖等)以及復雜的調(diào)控系統(tǒng)息息相關(guān)[22]。對葉緣焦枯病菌(Xylella fastidiosa)體外生物膜形成過程研究發(fā)現(xiàn),dldh基因的表達量顯著提高[23]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)ZJ03Δdldh缺失株和野生株的生物膜形成差異顯著(P<0.05),提示dldh參與了溶藻弧菌生物膜的形成過程。

    對肺炎鏈球菌研究表明dldh的缺失使DLDH酶活性完全喪失[18],本研究也發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌dldh的NADH及FAD結(jié)合區(qū)域突變后顯著影響細菌DLDH酶活性(P<0.05)。此外,dldh缺失的肺炎鏈球菌還喪失了對小鼠的感染力[18],本研究發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌dldh的缺失顯著影響細菌的致病性,表現(xiàn)為對斜帶石斑魚的LD50下降約100倍??傊?,本研究初步表

    明dldh作為能量代謝基因在溶藻弧菌的致病中起一定作用,但后續(xù)仍需要補充更多的致病相關(guān)試驗來闡明其致病機理。

    4 結(jié)論

    本研究成功構(gòu)建dldh基因插入突變株ZJ03Δdldh。與野生株的對比研究表明,該突變株生長的遲緩期延長、泳動能力顯著減弱(P<0.05),酶活性顯著降低(P<0.05),生物膜生成顯著減少(P<0.05),對石斑魚的致病性也明顯減弱(P<0.05)。

    [1]Moran JF, Sun Z, Sarath G, et al. Molecular cloning, functional characterization, and subcellular localization of soybean nodule dihydrolipoamide reductase[J]. Plant Physiology, 2002, 28 (1):300- 313.

    [2]Fox B, Walsh CT. Mercuric reductase. Purification and characterization of a transposon -encoded flavoprotein containing an oxidationreduction-active disulfide[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1982, 257(5):2498-2503.

    [3]Shames SL, Fairlamb AH, Cerami A, et al. Purification and characterization of trypanothione reductase from Crithidia fasciculata, a newly discovered member of the family of disulfidecontaining flavoprotein reductases[J]. Biochemistry, 1986, 25(12):3519-3526.

    [4]Williams CH Jr, Zanetti G, Arscott LD, et al. Lipoamide dehydrogenase, glutathione reductase, thioredoxin reductase, and thioredoxin [J]. The Journal of Biological Chemistry, 1967, 242(22):5226-5231.

    [5]張靜, 孫建和. 豬鏈球菌二氫硫辛酰胺脫氫酶的原核表達及其粘附相關(guān)功能初探[J]. 上海交通大學學報:農(nóng)業(yè)科學版, 2012, 29(2):34-40.

    [6]Hudson P, Gorton TS, Papazisi L, et al. Identification of a virulenceassociated determinant, dihydrolipoamide dehydrogenase (lpd), in Mycoplasma gallisepticum through in vivo screening of transposon mutants [J]. Infection and Immunity, 2006, 74(2):931-939.

    [7]Tyx RE, Roche-Hakansson H, Hakansson AP. Role of dihydrolipoamide dehydrogenase in regulation of raffinose transport in Streptococcus pneumoniae[J]. Journal of Bacteriology, 2011, 193(14):3512-3524.

    [8]Sadok K, Mejdi S, Nourhen S, et al. Phenotypic characterization and RAPD fingerprinting of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus isolated during Tunisian fish farm outbreaks[J]. Folia Microbiol (Praha), 2013, 58(1):17-26.

    [9]Chang CC, Yeh MS, Lin HK, et al. The effect of Vibrio alginolyticus infection on caspase-3 expression and activity in white shrimp Litopenaeus vannamei[J]. Fish and Shellfish Immunology, 2008, 25(5):672-678.

    [10]Ben Kahla-Nakbi A, Chaieb K, Bakhrouf A. Investigation of several virulence properties among Vibrio alginolyticus strains isolated from diseased cultured fish in Tunisia[J]. Diseases of Aquatic Organisms, 2009, 86(1):21-28.

    [11]Campanelli A, Sanchez-Politta S, Saurat JH. Cutaneous ulceration after an octopus bite:infection due to Vibrio alginolyticus, an emerging pathogen[J]. Annales de Dermatologie et de Venereologie, 2008, 135(3):225-227.

    [12]Sganga G, Cozza V, Spanu T, et al. Global climate change and wound care:case study of an off-season Vibrio alginolyticus infection in a healthy man [J]. Ostomy Wound Manage, 2009, 55(4):60-62.

    [13]Le Roux F, Binesse J, Saulnier D, et al. Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicide vector[J]. Applied and Environmental Microbiology , 2007 , 73(3):777-784.

    [14]Cai SH, Lu YS, Wu ZH, et al. Loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of Vibrio alginolyticus, the causative agent of vibriosis in mariculture fish[J]. Letters in Applied Microbiology, 2010, 50(5):480-485.

    [15]Yan LJ, Thangthaeng N, Forster MJ. Changes in dihydrolipoamide dehydrogenase expression and activity during postnatal development and aging in the rat brain [J]. Mechanisms of Ageing and Development, 2008, 129(5):282-290.

    [16]狄慧玲, 陳償, 石磊. 溶藻弧菌OP/Tr變體生物被膜形成能力及其相關(guān)因素的比較研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2010, 26(11):1177-1180.

    [17]李今煜, 陳健銘, 彭振坤. 幾種常用的基因敲除技術(shù)[J]. 武夷科學, 2008, 23(1):187-190.

    [18]Smith AW, Roche H, Trombe MC, et al. Characterization of the dihydrolipoamide dehydrogenase from Streptococcus pneumoniae and its role in pneumococcal infection. Molecular Microbiology,

    2002, 44(2):431-448.

    [19]Meadows PS. The attachment of bacteria to solid surfaces[J]. Archiv für Mikrobiologie, 1971, 75(4):374-381.

    [20]Jackman SA. Dihydrolipoamide dehydrogenase in Trypanosoma brucei [D]. University of Bath (United Kingdom), 2009.

    [21]于丹. 金黃色葡萄球菌Al-2群體感應(yīng)以icaR依賴的方式減弱生物膜形成[D].合肥:中國科學技術(shù)大學, 2013.

    [22]Yildiz FH, Visick KL. Vibrio biofilms:so much the same yet so different [J]. Trends in Microbiology, 2009, 17(3):109-118.

    [23]Souza AA, Takita MA, Coletta-Filho H D, et al. Gene expression profile of the plant pathogen Xylella fastidiosa during biofilm formation in vitro[J]. FEMS Microbiology Letters, 2004, 237(2):341-353.

    (責任編輯 李楠)

    Construction and Characterization of a Mutant of Vibrio alginolyticus ZJ03 Δdldh Strain

    Pang Huanying1,2,3Chen Liming1,2,3Huang Yucong1,2,3Jian Jichang1,2,3Lu Yishan1,2,3Wu Zaohe2,3,4
    (1. Fisheries College of Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088;2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals,Zhanjiang 524088;3. Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutions,Zhanjiang 524088;4. Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225)

    Vibrio alginolyticus, a gram-negative bacterium has been described to be among the most common and economically important aquatic pathogen of fish and shellfish. Dihydrolipoamide dehydrogenase (DLDH)is homodimeric flavoproteins that catalyse the NAD+dependent reoxidation of dihydrolipoamide in a number of multienzyme complexes. This enzyme classically involved in energy metabolism. To identify DLDH’s role during infection, dldh gene deletion strain (ZJ03Δdldh)were constructed using the insertion mutation method. With the pRE112 suicide plasmid as the carrier, the Overlap PCR and homologous recombination technology were used to construct the mutant strains. Furthermore, the changes of the physiology and pathogenicity of ZJ03Δdldh mutant strains compared with the strain ZJ03, such as growth, swarming ability, biofilm and LD50 were investigated. The growth curve showed that the mutant grew slowly in lag phase compared to the wildtype strain, and the swarming ability, enzyme activity and biofilm formation of ZJ03Δdldh mutant strains showed significant reduced(P<0.05). The fish lethal test showed that the virulence of the ZJ03Δdldh mutant strains was 102times lower than the ZJ03 strain. In conclusion, the ZJ03Δdldh mutant strains were constructed successfully, and this study showed that enzymes classically involved in energy metabolism may play an important role in pathogenic mechanism of V. alginolyticus.

    Vibrio alginolyticus dldh mutant Biological characteristics

    2014-05-30

    國家科技支撐計劃(2012BAD17B02,2012 BAD17B03),廣東省自然科學基金項目(S2013040014562)

    龐歡瑛,女,博士,講師,研究方向:水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害;E-mail:phying1218@163.com

    簡紀常,男,博士,教授,研究方向:水產(chǎn)經(jīng)濟動物免疫學及病害控制;E-mail:jianjc@gmail.com

    猜你喜歡
    溶藻弧菌生物膜
    銷量增長200倍!“弧菌克星”風靡行業(yè),3天殺滅98%弧菌
    幽門螺桿菌生物膜的研究進展
    副溶血弧菌檢測方法的研究進展
    生物膜胞外聚合物研究進展
    如何有效防控對蝦養(yǎng)殖中的弧菌病
    小麥內(nèi)生溶藻細菌ZB1的分離鑒定及其溶藻特性
    溶藻細菌及其溶藻活性物研究進展*
    溶藻細菌FS1的溶藻效果與機制初探
    副溶血弧菌噬菌體微膠囊的制備及在餌料中的應(yīng)用
    光動力對細菌生物膜的作用研究進展
    欧美精品啪啪一区二区三区 | 亚洲精品国产一区二区精华液| 永久免费av网站大全| 亚洲av美国av| 国产xxxxx性猛交| 蜜桃国产av成人99| av不卡在线播放| 五月天丁香电影| 热99国产精品久久久久久7| 无限看片的www在线观看| 午夜91福利影院| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久 成人 亚洲| 午夜两性在线视频| 成年av动漫网址| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久久久国产精品人妻一区二区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 日日夜夜操网爽| 亚洲欧洲日产国产| 精品欧美一区二区三区在线| 各种免费的搞黄视频| 777米奇影视久久| 亚洲伊人久久精品综合| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 一级毛片电影观看| 亚洲伊人久久精品综合| 捣出白浆h1v1| 免费在线观看完整版高清| 岛国毛片在线播放| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久精品国产a三级三级三级| 老司机在亚洲福利影院| 精品少妇内射三级| 色视频在线一区二区三区| 国产一区二区 视频在线| 国产成人啪精品午夜网站| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 女人精品久久久久毛片| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 中文字幕色久视频| 国产成人影院久久av| 久久毛片免费看一区二区三区| 大香蕉久久网| 免费在线观看完整版高清| 日本欧美视频一区| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久国产精品影院| 不卡一级毛片| 中文字幕制服av| 成人国产一区最新在线观看| 999久久久国产精品视频| 国产又爽黄色视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产欧美日韩一区二区三 | 国产伦人伦偷精品视频| 久久免费观看电影| 美女大奶头黄色视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 99精品久久久久人妻精品| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲国产欧美在线一区| 丰满迷人的少妇在线观看| 在线观看舔阴道视频| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲伊人久久精品综合| 性少妇av在线| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 宅男免费午夜| 日本91视频免费播放| 日本五十路高清| 乱人伦中国视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 97精品久久久久久久久久精品| 激情视频va一区二区三区| 久久久精品区二区三区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 成人国产一区最新在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 久久久久精品人妻al黑| 国产精品一区二区在线观看99| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲第一av免费看| 999精品在线视频| videos熟女内射| 欧美黑人精品巨大| 欧美日韩精品网址| 欧美日韩一级在线毛片| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲伊人久久精品综合| 中国国产av一级| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | a 毛片基地| 亚洲成人手机| 国产主播在线观看一区二区| 水蜜桃什么品种好| 亚洲精品中文字幕在线视频| 午夜激情av网站| 国产一级毛片在线| 国产一级毛片在线| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲成人免费电影在线观看| 成年av动漫网址| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 1024香蕉在线观看| 国产精品.久久久| 成年美女黄网站色视频大全免费| 男女边摸边吃奶| 亚洲一码二码三码区别大吗| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 激情视频va一区二区三区| 成年人午夜在线观看视频| av在线播放精品| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 女性生殖器流出的白浆| xxxhd国产人妻xxx| av天堂久久9| 欧美久久黑人一区二区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 波多野结衣一区麻豆| 国产成人av教育| 99热国产这里只有精品6| 一进一出抽搐动态| 日韩中文字幕视频在线看片| 91老司机精品| 不卡av一区二区三区| 一区二区三区激情视频| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 老司机福利观看| 免费在线观看日本一区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产一区有黄有色的免费视频| 91精品三级在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产色视频综合| 男女免费视频国产| 超色免费av| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲av成人一区二区三| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲全国av大片| 午夜精品国产一区二区电影| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久毛片免费看一区二区三区| 捣出白浆h1v1| 天天操日日干夜夜撸| 最新在线观看一区二区三区| 一级片'在线观看视频| 午夜福利视频精品| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 男女午夜视频在线观看| 在线天堂中文资源库| 国产伦人伦偷精品视频| 麻豆av在线久日| 婷婷丁香在线五月| 亚洲精品国产av成人精品| av电影中文网址| 欧美午夜高清在线| 国产真人三级小视频在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| www.自偷自拍.com| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲av电影在线进入| 亚洲五月婷婷丁香| 最黄视频免费看| 国产男女内射视频| 高清欧美精品videossex| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美黑人欧美精品刺激| 免费看十八禁软件| 2018国产大陆天天弄谢| www日本在线高清视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 日韩大码丰满熟妇| 国产男女内射视频| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲精品中文字幕在线视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 久久香蕉激情| 欧美大码av| 超碰成人久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久久久精品人妻al黑| 国产免费福利视频在线观看| tocl精华| 老司机福利观看| 我的亚洲天堂| 老司机深夜福利视频在线观看 | 精品亚洲成a人片在线观看| 国产精品.久久久| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 老司机午夜福利在线观看视频 | 久久人人97超碰香蕉20202| 国产亚洲欧美精品永久| 久久中文字幕一级| 黑人操中国人逼视频| 国产一区二区 视频在线| 午夜福利,免费看| 18在线观看网站| 婷婷丁香在线五月| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 天天影视国产精品| 男人添女人高潮全过程视频| 999久久久精品免费观看国产| 久久av网站| 亚洲久久久国产精品| 两人在一起打扑克的视频| 中文字幕高清在线视频| 欧美在线黄色| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 午夜福利视频精品| 日本五十路高清| 伊人亚洲综合成人网| 午夜久久久在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 人妻一区二区av| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品熟女少妇八av免费久了| 9热在线视频观看99| 亚洲国产日韩一区二区| 欧美另类一区| 淫妇啪啪啪对白视频 | 日本一区二区免费在线视频| 我要看黄色一级片免费的| 少妇精品久久久久久久| a在线观看视频网站| 成人影院久久| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 操出白浆在线播放| 人妻人人澡人人爽人人| 一二三四社区在线视频社区8| 在线看a的网站| 高潮久久久久久久久久久不卡| 下体分泌物呈黄色| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 午夜老司机福利片| av国产精品久久久久影院| 天天影视国产精品| 久久久久久久久久久久大奶| 精品国产国语对白av| 精品人妻1区二区| 18在线观看网站| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 婷婷色av中文字幕| 黑丝袜美女国产一区| 99精品久久久久人妻精品| 男人爽女人下面视频在线观看| 成年动漫av网址| 黄色片一级片一级黄色片| 99久久综合免费| 精品视频人人做人人爽| 欧美日韩一级在线毛片| 999久久久精品免费观看国产| www.av在线官网国产| 国产激情久久老熟女| a级毛片黄视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 黄片播放在线免费| 午夜免费观看性视频| a级毛片在线看网站| 精品国产国语对白av| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 爱豆传媒免费全集在线观看| av电影中文网址| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产成人精品无人区| 一级片'在线观看视频| 亚洲一区中文字幕在线| 欧美午夜高清在线| 成人手机av| 久久久久网色| 免费观看人在逋| 久久ye,这里只有精品| 一个人免费看片子| 这个男人来自地球电影免费观看| 成年人午夜在线观看视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 日韩大片免费观看网站| 日韩视频一区二区在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 热re99久久精品国产66热6| av有码第一页| 亚洲情色 制服丝袜| 999久久久国产精品视频| 十八禁人妻一区二区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 午夜福利在线免费观看网站| 大片免费播放器 马上看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 久久精品久久久久久噜噜老黄| 一本久久精品| 90打野战视频偷拍视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产1区2区3区精品| 久久久欧美国产精品| 国产欧美日韩一区二区精品| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 999精品在线视频| a在线观看视频网站| 美女福利国产在线| 人妻一区二区av| 少妇人妻久久综合中文| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲中文av在线| 久久热在线av| 18禁观看日本| 男人操女人黄网站| 热re99久久国产66热| 捣出白浆h1v1| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产亚洲一区二区精品| 久久久久久人人人人人| 国产欧美日韩一区二区精品| 美女国产高潮福利片在线看| 精品国产乱码久久久久久男人| 美女福利国产在线| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 在线十欧美十亚洲十日本专区| 天天添夜夜摸| 精品一区在线观看国产| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 一区二区三区激情视频| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲成人手机| 久久狼人影院| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 在线观看www视频免费| 色精品久久人妻99蜜桃| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲第一青青草原| 99久久精品国产亚洲精品| 嫩草影视91久久| 精品国产乱码久久久久久男人| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲中文字幕日韩| 男女免费视频国产| 女性被躁到高潮视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 精品欧美一区二区三区在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 在线精品无人区一区二区三| 日本av手机在线免费观看| 蜜桃在线观看..| 久久久久精品国产欧美久久久 | 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲九九香蕉| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 精品久久蜜臀av无| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲激情五月婷婷啪啪| xxxhd国产人妻xxx| 青春草视频在线免费观看| 精品欧美一区二区三区在线| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 制服诱惑二区| a 毛片基地| 美女大奶头黄色视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| videosex国产| 中文字幕最新亚洲高清| 国产欧美日韩一区二区三 | 美国免费a级毛片| 热99久久久久精品小说推荐| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 飞空精品影院首页| 美女主播在线视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 一本综合久久免费| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲国产欧美一区二区综合| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲性夜色夜夜综合| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 少妇精品久久久久久久| 午夜成年电影在线免费观看| 国产成人欧美| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 在线观看www视频免费| 欧美在线一区亚洲| 久久人人爽人人片av| 性色av乱码一区二区三区2| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产成人精品无人区| 欧美乱码精品一区二区三区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 欧美黄色片欧美黄色片| www.熟女人妻精品国产| 久久中文看片网| 高潮久久久久久久久久久不卡| 啦啦啦 在线观看视频| 十八禁人妻一区二区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 一进一出抽搐动态| av在线app专区| 国产有黄有色有爽视频| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲中文日韩欧美视频| 大陆偷拍与自拍| 欧美中文综合在线视频| 午夜影院在线不卡| 777米奇影视久久| 91精品国产国语对白视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 美女扒开内裤让男人捅视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产有黄有色有爽视频| 成人影院久久| 国产一区二区激情短视频 | 麻豆乱淫一区二区| 在线 av 中文字幕| 国产成人精品无人区| 国产视频一区二区在线看| 国产黄色免费在线视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久精品成人免费网站| 三上悠亚av全集在线观看| 电影成人av| 妹子高潮喷水视频| 一区在线观看完整版| 九色亚洲精品在线播放| 在线看a的网站| 丰满少妇做爰视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 五月天丁香电影| 久久99一区二区三区| 欧美日韩精品网址| 精品国产乱码久久久久久男人| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产熟女午夜一区二区三区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美日韩视频精品一区| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲天堂av无毛| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美激情 高清一区二区三区| 9色porny在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲色图综合在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 两人在一起打扑克的视频| 国产又爽黄色视频| 黄色片一级片一级黄色片| 自线自在国产av| 两性夫妻黄色片| 老熟女久久久| 婷婷丁香在线五月| videos熟女内射| 国产精品免费大片| 99久久人妻综合| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲成国产人片在线观看| 一区福利在线观看| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲第一青青草原| 亚洲av成人一区二区三| 国产成人精品在线电影| 不卡av一区二区三区| 国产成人精品无人区| 美女国产高潮福利片在线看| 久久久国产成人免费| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 美女主播在线视频| 天天影视国产精品| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久av网站| www.熟女人妻精品国产| 欧美日本中文国产一区发布| 国产在视频线精品| 成在线人永久免费视频| 精品福利观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久久精品区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲综合色网址| 国产精品影院久久| bbb黄色大片| 好男人电影高清在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 国产99久久九九免费精品| 亚洲视频免费观看视频| 久久久久久久精品精品| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 俄罗斯特黄特色一大片| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 欧美精品一区二区大全| 国产精品久久久久久精品古装| 精品一区二区三区四区五区乱码| 黄色视频在线播放观看不卡| 啦啦啦免费观看视频1| 各种免费的搞黄视频| 久久亚洲国产成人精品v| 真人做人爱边吃奶动态| 久久女婷五月综合色啪小说| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 精品人妻熟女毛片av久久网站| 青青草视频在线视频观看| 天天添夜夜摸| 亚洲av成人一区二区三| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲全国av大片| 最黄视频免费看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品第一国产精品| 一二三四社区在线视频社区8| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 成人手机av| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产成人啪精品午夜网站| 啦啦啦 在线观看视频| 女性被躁到高潮视频| av网站免费在线观看视频| 黄色 视频免费看| 老司机午夜福利在线观看视频 | 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 日韩有码中文字幕| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久久久国产精品人妻一区二区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 欧美 日韩 精品 国产| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 97在线人人人人妻| 搡老乐熟女国产| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲中文日韩欧美视频| 又大又爽又粗| 成年av动漫网址| 国产区一区二久久| 99精品欧美一区二区三区四区| 老司机深夜福利视频在线观看 | 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 色视频在线一区二区三区| 欧美xxⅹ黑人| 少妇 在线观看| 日本wwww免费看| 精品人妻在线不人妻| 一级毛片电影观看| 天天添夜夜摸| 美国免费a级毛片| 国产精品偷伦视频观看了| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 午夜老司机福利片| 午夜福利,免费看| 国产精品熟女久久久久浪| 久久人妻熟女aⅴ| 欧美日韩精品网址| 久久久国产成人免费| 国产深夜福利视频在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 久久中文字幕一级| 下体分泌物呈黄色| 操美女的视频在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 波多野结衣av一区二区av| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 五月开心婷婷网| 亚洲精品成人av观看孕妇| 首页视频小说图片口味搜索| 国产xxxxx性猛交| 色播在线永久视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 男女午夜视频在线观看|