家蠅伴侶蛋白TCP-1基因的序列分析、克隆及誘導(dǎo)表達

趙學(xué)軍 國果 吳沁怡 陶如玉 吳建偉

（貴陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004）

家蠅伴侶蛋白TCP-1基因的序列分析、克隆及誘導(dǎo)表達

趙學(xué)軍 國果 吳沁怡 陶如玉 吳建偉

（貴陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004）

旨在對EST篩選得到的家蠅伴侶蛋白TCP-1（MD-TCPⅠ）基因進行序列分析，克隆其cDNA序列并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達。采用EST測序技術(shù)從已構(gòu)建的家蠅幼蟲cDNA質(zhì)粒文庫中篩選到MD-TCP Ⅰ基因，對其進行序列測定和分析。以該基因的cDNA文庫質(zhì)粒為模板，通過PCR的方法進行擴增，以pET-28a（+）為載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化到表達宿主大腸桿菌BL21（DE3）中，IPTG誘導(dǎo)表達。表達產(chǎn)物通過SDS-PAGE進行鑒定。結(jié)果顯示，MD-TCP Ⅰ基因ORF全長753 bp，編碼250個氨基酸，理論分子量27.07 kD；等電點5.92，該序列編碼的蛋白屬于熱休克蛋白60家族的TCP。構(gòu)建了正確基因序列MD-TCP Ⅰ重組表達質(zhì)粒，重組蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達。

家蠅 TCP 序列分析 基因克隆 表達

伴侶蛋白是一大類在生物大分子折疊、組裝及降解過程中起著重要的協(xié)同作用，但自身并不發(fā)生任何變化的存在于生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)分子［1］。熱休克蛋白60（HSP60）是HSPs類分子伴侶，是一種與細胞應(yīng)激損傷關(guān)系密切的蛋白質(zhì)，廣泛存在于原核及真核細胞中。HSP60在正常細胞中表達很低，但是在高溫、缺氧、感染、創(chuàng)傷等因素刺激下表達增強，對提高細胞耐受應(yīng)激的能力，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用［2］。TCP屬于HSP60家族，是一種廣泛存在于細胞漿中的異型寡聚蛋白，也是迄今為止真核細胞胞漿中發(fā)現(xiàn)的唯一一個伴侶素［3］。研究發(fā)現(xiàn)正常條件下，HSP60以穩(wěn)定狀態(tài)存在于細胞質(zhì)

和線粒體基質(zhì)中；應(yīng)激條件下，HSP60 迅速從胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到線粒體基質(zhì)以修復(fù)線粒體基質(zhì)中的變性蛋白［4］，并且TCP能與蛋白因子結(jié)合形成目標蛋白［5］。

家蠅Musca domesitca是世界性廣泛分布的衛(wèi)生昆蟲，從幼蟲到成蟲均生活在骯臟的環(huán)境中，表現(xiàn)出較強的環(huán)境適應(yīng)能力，所以家蠅必然具有完善而高效的免疫防御機制，我們對此產(chǎn)生了極大的興趣。目前對家蠅熱休克蛋白的研究報道主要是熱休克蛋白70［6］和小分子量熱休克蛋白［7］，對其TCP蛋白的研究尚未見報道。本研究克隆MD-TCPⅠ基因，并對其序列進行生物信息學(xué)的分析，同時建立MD-TCPⅠ體外表達系統(tǒng)，旨在為進一步研究MDTCPⅠ特性和有效利用功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 文庫、菌種及質(zhì)粒 家蠅3齡幼蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建和EST測序及Unigene 分析由北京華大合作完成。原核表達質(zhì)粒pET-28a（+）和大腸桿菌BL21（DE3）由中山大學(xué)引進本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑及工具酶 Ex Taq酶（含dNTP），EcoRⅠ、HindⅢ、T4 DNA連接酶，DNA 標準（DL 2 000 Marker）均購自大連寶生物工程公司；異丙硫代β-D半乳糖苷（IPTG）購自美國Promega公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒購自北京鼎國生物。

1.1.3 引物合成和DNA測序 基因擴增引物合成由Invitrogen上海生物技術(shù)有限公司完成，重組質(zhì)粒DNA測序上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 家蠅TCP基因Ⅰ（MD-TCPⅠ）的識別及序列測定 對測定得到的家蠅3齡幼蟲EST序列進行Blastx分析，從中篩選獲得編碼家蠅TCPⅠ基因的文庫質(zhì)粒（編號為004-E08），命名為MD-TCPⅠ。

1.2.2 MD-TCPⅠ基因的生物信息學(xué)分析 利用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)（Expert protein analysis system，ExPASy）提供的生物信息學(xué)工具，分析預(yù)測蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、信號肽、跨膜區(qū)、二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)。

1.2.3 MD-TCPⅠ基因的擴增 根據(jù)已獲得的MDTCPⅠ編碼序列，利用DNA Club和Primer5.0設(shè)計引物。上游引物：5'-GCGGAATTCATGGCTTCAATT AGTTTATTGAATC-3'（下劃線為EcoRⅠ酶切位點）；下游引物：5'-CCGAAGCTTTTATAGAAGAAACCCAG AGTT-3'（下劃線為Hind Ⅲ酶切位點）。

以家蠅3齡幼蟲cDNA文庫中MD-TCPⅠ基因的質(zhì)粒為模板，PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收。

1.2.4 重組原核表達質(zhì)粒（pET-28a（+）-MD-TCPⅠ）的構(gòu)建及鑒定 將PCR產(chǎn)物和原核表達質(zhì)粒pET 28a（+）經(jīng)EcoRⅠ、HindⅢ 雙酶切后回收，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21/DE3感受態(tài)細胞，卡那霉素篩選陽性克隆，對陽性克隆提取質(zhì)粒進行PCR，雙酶切和測序鑒定。

1.2.5 MD-TCPⅠ基因在大腸桿菌BL21/DE3中的誘導(dǎo)表達 取1 mL培養(yǎng)過夜的陽性克隆菌液，加入含有卡那霉素的100 mL LB培養(yǎng)基中（菌液/培養(yǎng)基為1/100），37℃ 220 r/min振搖至OD600=0.4-0.6時，加入IPTG至終濃度4 mmol/L，誘導(dǎo)表達6 h。離心收集菌體，進行超聲破碎。超聲破碎沉淀和上清各自取20 μL，各加入50 μL 1×SDS- PAGE上樣緩沖液，煮沸5 min，13 000 r/min離心1 min，取沉淀和上清5 μL進行SDS -PAGE電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 序列分析

MD-TCPⅠ基因與蔥蠅的同源基因氨基酸序列的一致性可達89%，ORF全長753 bp，編碼250個氨基酸（圖1），預(yù)測分子量為27.07 kD，理論等電點（pI值）5.92。Inter ProScan 分析顯示其具有TCP-1家族的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域（圖2）。

信號肽預(yù)測 將MD-TCPⅠ氨基酸序列在丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心（CBS）的網(wǎng)站（http：//www. cbs.dtu.dk/servies/SingnaIP/）進行在線分析，結(jié)果顯示，氨基酸序列無信號肽。

TMHMM（Http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0）預(yù)測MD-TCPⅠ基因無跨膜區(qū)。

圖1 MD-TCPⅠ開放閱讀框cDNA序列及對應(yīng)編碼的氨基酸序列

圖2 MD-TCPⅠ結(jié)構(gòu)域預(yù)測

利用SOPMA網(wǎng)站預(yù)測MD-TCPⅠ基因編碼蛋

白的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其二級結(jié)構(gòu)主要有4種類型，分別為α-螺旋占42.40%，β-折疊占7.20%，延伸鏈占21.60%，無規(guī)則卷曲占28.80%（圖3）。利用ExPASy網(wǎng)站上提供的SWISS-MODEL對該基因的編碼蛋白進行三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，可清楚地看到該蛋白具有豐富的α-螺旋結(jié)構(gòu)，延伸鏈和無規(guī)則卷曲也較明顯（圖4），從而驗證了SOPMA網(wǎng)站對其二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。

圖3 MD-TCPⅠ二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

圖4 MD-TCPⅠ的三級結(jié)構(gòu)

2.2 MD-TCPⅠ基因擴增及原核重組質(zhì)粒的鑒定

MD-TCPⅠ基因經(jīng)PCR擴增后，獲得了750 bp左右的特異條帶（圖5泳道1）。將重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果（圖5泳道3）顯示，重組質(zhì)粒雙酶切后，在750 bp左右有一清晰的條帶，與目的基因的大小基本相符，提示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將挑選的陽性克隆子送上海生工生物工程有限公司，進一步以pET-28a（+）的通用引物對重組質(zhì)粒測序，結(jié)果表明相應(yīng)的插入序列與目的基因cDNA序列一致，證明MD-TCPⅠ基因原核表達重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖5 MD-TCPⅠ的克隆及酶切簽定

2.3 目的基因表達產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定

取重組菌誘導(dǎo)前后的表達產(chǎn)物和超聲破碎沉淀、上清進行SDS-PAGE，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)的重組菌約在31 kD左右出現(xiàn)表達條帶，與目的蛋白預(yù)測的分子量（27.07 kD）加上所帶His標簽分子量（約3 kD）基本相符，而未誘導(dǎo)菌無此條帶。超聲破細胞后顯示該蛋白在包涵體大量表達箭頭所指（圖6）。

圖6 重組質(zhì)粒pET-28a（+）- MD-TCPⅠ在大腸桿菌的表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析

3 討論

分子伴侶不僅使胞內(nèi)蛋白折疊、組裝與轉(zhuǎn)運幫助蛋白［8］，還可以成為感染性疾病中的免疫優(yōu)勢抗原，激發(fā)宿主體內(nèi)的體液免疫反應(yīng)和細胞免疫反應(yīng)，已經(jīng)證實在細菌或寄生蟲感染中具有免疫保護作用，表明分子伴侶有可能用作疫苗來抵抗微生物感染，或者用來治療腫瘤和自身免疫性疾病［9］。分子伴侶與腫瘤有著密切的聯(lián)系，在腫瘤發(fā)生中扮演著很重要的角色，既可以促進腫瘤細胞的自主增殖，又可以抑制細胞的凋亡［10］。食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移了能力與HSP27呈負相關(guān)，HSP27高表達的食管癌其侵襲轉(zhuǎn)移能力受到抑制［11］。研究發(fā)現(xiàn)，TCP伴侶蛋白

是進化上最為保守的蛋白質(zhì)之一，由“背靠背”堆疊的雙環(huán)狀亞基構(gòu)成，每個環(huán)有8個不同的亞基［5］。TCP伴侶蛋白在肌動蛋白、微管蛋白的組裝和折疊中發(fā)揮著重要的作用，TCP伴侶蛋白翻譯機制中的促進其它蛋白正確折疊，為細胞環(huán)境如細胞信號介導(dǎo)、細胞增殖等密切關(guān)系提供了佐證［12］。TCP的異常會導(dǎo)致細胞骨架蛋白發(fā)生改變，甚至影響細胞骨架的形成與聚集［13］。蔥蠅的蛹期冷馴化，TCP-1基因會明顯的上調(diào)，使蛹對環(huán)境溫度有更高的耐受性，增強昆蟲的抗寒的能力［14］。對二化螟幼蟲熱脅迫時，可引起二化螟幼蟲體內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，顯著提高子幼蟲血淋巴細胞內(nèi)熱休克蛋白水平［15］。CCT6A下調(diào)表達能顯著抑制結(jié)腸腫瘤細胞的遷移和侵襲能力［16］。此外，TCP伴侶蛋白在視網(wǎng)膜感覺神經(jīng)元的形成和生成扮演著重要的功能，是神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的一個潛在的因素［17］。TCP伴侶蛋白在卵泡生長發(fā)育中也起著重要的作用［18］。

4 結(jié)論

將家蠅TCPⅠ基因片段克隆到原核表達載體pET-28a（+）中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a（+）/ MD-TCPⅠ，獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)過酶切、PCR和測序鑒定，證實含有目的基因片段，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21/DE3，IPTG誘導(dǎo)表達，電泳顯示重組蛋白條帶清晰，表明重組蛋白得到了高效表達。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Sequence Analysis，Cloning and Induced Expression of Chaperonin Gene in Housefly（Musca domesitca）

Zhao Xuejun Guo Guo Wu Qinyi Tao Ruyu Wu Jianwei
（School of Basic Medical Sciences，Guiyang Medical College，Guiyang 550004）

The aim of this study is to analyze and predict the structural and characteristics of genes and encoding proteins of MD-TCPⅠ（Musca domesitca Chaperonin TCP- 1（MD-TCPⅠ））, with the methods of cloning and expressing that gene. Sequence analysis indicated that the open reading frame was 753 bp, encoding a putative protein consisting of 250-amino acids, which no signal sequence and NCBI-BLAST showed acid sequence identify with other insect TCP-1 were 89%. The protein, with a predicted molecular weight of 27.07 kD, and pI of 5.92, which acid sequence as tcp-1 belong to HSP60 family. The gene coding for MD-TCP Ⅰwas amplified by polymerase chain reaction（PCR）, and then was ligated into vector pET-28a（+）and transformed into Escherichia coli BL21（DE3）competent cell, induced with IPTG. The fusion protein in the expression vector was analyzed by SDA-PAGE. The results indicated that the recombinant plasmid with the correct target gene was constructed, and the fusion protein was expressed in E. coli BL21（DE3）.

Musca domestic TCP Sequence analysis Gene cloning Express

2014-02-20

國家自然科學(xué)基金項目（81160204，81360254），貴州省科技廳基金項目（黔科合［2010］3160），高校博士點學(xué)科專項科研基金項目（20105215120001）

趙學(xué)軍，男，碩士研究生，研究方向：醫(yī)學(xué)寄生蟲的分子免疫；E-mail：383657226@qq.com

國果，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：昆蟲免疫；E-mail：guoguojsc@163.com