巴豆醛對(duì)水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

劉悅萍郭蓓胡昊張國慶

（1.北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；2.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 102206）

巴豆醛對(duì)水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

劉悅萍1郭蓓1胡昊2張國慶1

（1.北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；2.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 102206）

對(duì)巴豆醛處理水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞后蛋白質(zhì)組水平的變化進(jìn)行了研究，以期發(fā)現(xiàn)在調(diào)控水稻細(xì)胞周期活動(dòng)中起重要作用的蛋白。采用雙向電泳分離蛋白，PDQuest軟件分析凝膠圖譜確定差異蛋白點(diǎn)，LCQ-Fleet ion trap系統(tǒng)鑒定蛋白，相關(guān)數(shù)據(jù)庫檢索分析差異蛋白點(diǎn)，獲得了45個(gè)差異蛋白點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫分析得到26個(gè)可信蛋白，集中在脅迫反應(yīng)、蛋白質(zhì)命運(yùn)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，物質(zhì)與能量代謝和膜功能等。在這些蛋白中，小分子量熱激蛋白、Skp1蛋白和26S蛋白酶，CDC48，6-磷酸葡萄糖胺乙酰基轉(zhuǎn)移酶以及蔗糖合酶等蛋白已有文獻(xiàn)報(bào)告其在植物細(xì)胞周期調(diào)控中的作用，其它一些鑒定的蛋白參與了細(xì)胞的生理活動(dòng)，其與細(xì)胞周期間的相互關(guān)系需進(jìn)一步的研究。巴豆醛處理影響了水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞正常的細(xì)胞周期活動(dòng)，鑒定出部分蛋白與細(xì)胞周期的調(diào)控具有密切關(guān)系，而一些與水稻細(xì)胞分化、發(fā)育相關(guān)蛋白也得到了鑒定，其在細(xì)胞周期上的作用尚未有文獻(xiàn)報(bào)告，這些蛋白的進(jìn)一步研究將有助于揭示水稻細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制。

巴豆醛 水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞 差異蛋白質(zhì)組 細(xì)胞周期

細(xì)胞分化是生物體生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)。植物細(xì)胞連續(xù)的分化能力，細(xì)胞的周期活動(dòng)與植物新器官的產(chǎn)生、植物的形態(tài)建成、生長(zhǎng)發(fā)育乃至物種的繁衍有著密切的關(guān)系。水稻是我國重要的糧食作物，研究水稻細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制對(duì)于有目的的改善水稻的農(nóng)藝性狀，進(jìn)而提高水稻產(chǎn)量有著重要的意義。近年來，細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制逐漸為人們所關(guān)注。在雙子葉模式植物擬南芥中，細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子已經(jīng)被系統(tǒng)分析［1-4］。細(xì)胞周期蛋白間的互作已有相關(guān)研究［5］，但在單子葉模式植物水

稻（Oryza sativa）中研究則較少。根據(jù)序列的同源性，目前在水稻基因組中已經(jīng)分離到90個(gè)細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)控基因［6］，這些基因分別屬于細(xì)胞周期蛋白（cyclin）、E2F轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（Cyclin-dependent kinases，CDKs）、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑（Kip-related protein，KRPs）和成視網(wǎng)膜瘤蛋白（Retinoblastomas，Rbs）等。蛋白質(zhì)組是指由一種生物、一個(gè)基因組、一種組織或細(xì)胞表達(dá)的所有蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組學(xué)不但可定性也可定量分析在特定條件下蛋白質(zhì)水平的改變。通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法在微生物方面鑒定了與細(xì)胞周期相關(guān)的調(diào)控因子［7］。水稻基因組測(cè)序的完成及大量信息學(xué)數(shù)據(jù)的出現(xiàn)為水稻蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供了可能，目前已有相關(guān)的綜述報(bào)告［8］。巴豆醛（Crotonaldehyde）是一種4碳α，β-不飽和醛酮化合物，具有毒性，其容易與許多蛋白質(zhì)的殘基及DNA發(fā)生反應(yīng)形成共價(jià)性的螯合物，結(jié)果會(huì)導(dǎo)致基因突變，染色體斷裂，細(xì)胞信號(hào)通路異常，嚴(yán)重的損害將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死，正常的細(xì)胞周期及調(diào)控受到影響［9-11］。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對(duì)比分析巴豆醛處理水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞引起的蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，從蛋白質(zhì)水平揭示水稻細(xì)胞周期及調(diào)控的相關(guān)因子，旨在為進(jìn)一步研究水稻的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 水稻（Oryza sativa cv. Nipponbare）。

1.1.2 化學(xué)試劑和主要設(shè)備 pH3-10非線性固相IPG干膠條，IPG覆蓋液，瓊脂糖覆蓋液，40%的丙烯酰胺，PDA（piperazine diacrylyl），pH3-10NL兩性電解質(zhì)，碘乙酰胺，10倍的電泳緩沖液（TGS緩沖液）和SPYRO Ruby試劑均購自Bio-Rad公司。Bio-Rad公司ReadyPrepTM2-DCleanup 試劑盒，Calbiochem公司Non-Interfering Protein AssayTM試劑盒。尿素、硫脲、CHAPS和cocktail蛋白酶抑制劑購自Sigma公司，DTT和TEMED購自Merck公司。

Bio-Rad公司的PROTEAN IEF System水平電泳系統(tǒng)，PROTEAN IEF XL Cell垂直電泳系統(tǒng)和Versa-Doc Model 4000MP IMAGING SYSTEM成像系統(tǒng)。

1.1.3 溶液配制 樣品液A：20 mmol/L HEPES（pH7.5），1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA和蛋白酶抑制劑復(fù)合物。

IPG泡漲液（裂解液）貯液：尿素7 mol/L，硫脲2 mol/L，CHAPS 4%和少量溴酚藍(lán)，-20℃保存，用前加DTT（最終濃度為50 mmol/L）和0.5%或1.5%（V/V）的兩性電解質(zhì)。

平衡液貯液：尿素6 mol/L，甘油30%（V/V），Tris-HCl 37.5 mmol/L（pH8.8），SDS 5%（W/V），室溫保存。平衡液A：用前向平衡液貯液中加入DTT，終濃度為2%，并加入少量的溴酚藍(lán)。平衡液B：用前向平衡液貯液中加入碘乙酰胺，終濃度為5%，并加入少量的溴酚藍(lán)。

凝膠貯液：29%丙烯酰胺和1% PDA，4℃保存。凝膠緩沖液：1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)材料處理 水稻（Oryza sativa cv. Nipponbare）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的獲得參照J(rèn)enes［12］的方法，在附加2 mg/L的2，4-D的AA培養(yǎng)液中每周繼代培養(yǎng)一次。

正常細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入0.6 mol/L的巴豆醛處理3 h，其它條件與正常生長(zhǎng)細(xì)胞一致。處理后離心除去巴豆醛的培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，保存于-80℃冰箱中。

1.2.2 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞蛋白的提取及蛋白的定量 取一定量的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，加入少量石英砂，在液氮中進(jìn)行研磨，取適量的研碎粉末，裝入1.5 mL的Eppendorf管中，加入樣品液（20 mmol/L HEPES，pH7.5；1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA和cocktail蛋白酶抑制劑復(fù)合物），充分混合。4℃下，13 000×g離心15 min，取上清液，采用甲醇/氯仿［13］方法進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀和除鹽處理，沉淀用IPG泡漲液溶解。

采用Non-Interfering Protein AssayTM試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)定量，本方法用廣泛使用的沉淀劑UPPATM去除干擾，其與蛋白溶液混合后，迅速沉淀固定蛋白，顯色劑與游離的銅離子結(jié)合，顏色生成與蛋白的含量成反比，以牛血清蛋白（BSA）作為參照蛋白，

在0.5-50 mg的范圍內(nèi)，顯色與斜度一致，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算未知蛋白的含量。

1.2.3 雙向電泳分析 采用PROTEAN IEF cell等電聚焦系統(tǒng)，17 cm膠條，每根膠條的上樣液為350 μL。水化和聚焦溫度為20℃，每根膠條的限制電流為50 μA，被動(dòng)水化12-15 h后進(jìn)行等電聚焦，應(yīng)用的運(yùn)行程序?yàn)椋?50 V，20 min；10 000 V，2.5 h；80 000 Vh。等電聚焦完成后，放在平衡液A和平衡液B中各平衡30 min，每次15 min。采用8%-16%的梯度膠進(jìn)行第二向電泳，每塊膠恒流16 mA條件下30 min，接著恒流24 mA條件下5-6 h。取出膠進(jìn)行固定，依據(jù)Bio-Rad公司SYPRO? Ruby 染色手冊(cè)進(jìn)行染色。

1.2.4 凝膠圖譜分析 采用VersaDoc Model 4000MP IMAGING SYSTEM進(jìn)行圖像采集。用PDQuest軟件分析凝膠圖譜，3次重復(fù)，確定差異蛋白點(diǎn)，然后用膠體考馬斯亮藍(lán)染色，從膠上挖取差異蛋白點(diǎn)。

1.2.5 質(zhì)譜蛋白鑒定和數(shù)據(jù)庫搜索 用槍頭切取差異蛋白點(diǎn)，使用Roche 蛋白質(zhì)組級(jí)胰蛋白酶（Trypsin）參照說明對(duì)蛋白點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶解。ESI-MS/MS分析在匈牙利科學(xué)院蛋白質(zhì)組研究中心進(jìn)行，采用HPLC串聯(lián)離子阱質(zhì)譜儀LCQ-Fleet ion trap系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific）分析鑒定多肽。上樣前，色譜柱Waters Atlantis C18、100 mm×0.75 mm（Thermo）用流動(dòng)相A（Milli-QH2O+0.1%甲酸）平衡，流動(dòng)相B（乙氰+0.1%甲酸）300 nL/min線性梯度洗脫。采用數(shù)據(jù)依賴模式，質(zhì)譜掃描范圍m/z 400-2 000，3 個(gè)信號(hào)最強(qiáng)的肽段被選擇用于二級(jí)質(zhì)譜分析，5 min內(nèi)，質(zhì)量相同的肽段將不再被選擇用于二級(jí)質(zhì)譜分析。圖譜用Mascot Distiller軟件（v.2.1.1.0.）識(shí)別信號(hào)峰，用Mascot軟件（v.2.2.）搜索NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（版本是20080515）。檢索參數(shù)為：胰酶消化，物種來源設(shè)置為水稻，遺漏的酶切位點(diǎn)為0-2個(gè)，母離子與子離子的允許誤差均為±0.6 Da，固定修飾為酰胺甲基化（Carbamidomethyl），可變修飾為N末端蛋白質(zhì)乙酰化、N末端谷氨酸焦性沒食子酸（pyro-Glu）化和蛋氨酸氧化。單個(gè)離子得分值在55以上的蛋白是可信的。

2 結(jié)果

2.1 巴豆醛處理細(xì)胞與正常細(xì)胞圖譜分析

分別提取正常和巴豆醛處理的水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)過雙向電泳條件的優(yōu)化［14］，最后得到的電泳圖譜清晰干凈，紋理較少，拖尾現(xiàn)象不明顯，蛋白點(diǎn)主要集中在pH4-8之間。

通過雙向電泳分析巴豆醛處理對(duì)水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響，在忽略模糊點(diǎn)和不規(guī)則點(diǎn)的基礎(chǔ)上，得到正常培養(yǎng)的水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)中大約有889個(gè)蛋白點(diǎn)（圖1-A），巴豆醛處理水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)中大約有926個(gè)蛋白點(diǎn)（圖1-B）。

應(yīng)用PDQuest軟件分析巴比醛處理與對(duì)照水處理表達(dá)的差異蛋白點(diǎn)，共得到表達(dá)差異2倍以上、并同時(shí)在3塊膠上都存在差異蛋白點(diǎn)45個(gè)。

2.2 差異蛋白點(diǎn)的鑒定及蛋白鑒定結(jié)果

將得到的45個(gè)差異蛋白點(diǎn)經(jīng)酶解處理送入LCQ-Fleet ion trap系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。所得結(jié)果通過MASCOT搜索引擎進(jìn)行分析，依據(jù)設(shè)定的檢索參數(shù)，45個(gè)差異蛋白點(diǎn)均得到鑒定，最后將鑒定蛋白點(diǎn)的理論等電點(diǎn)及分子量與雙向電泳圖譜的等電點(diǎn)及分子量進(jìn)行綜合分析，確定26個(gè)可信蛋白質(zhì)（圖1中數(shù)字表示表達(dá)差異在2倍以上并得到鑒定的蛋白點(diǎn)，相同數(shù)字表示對(duì)照與處理間表達(dá)量存在差異的同一個(gè)蛋白），這些蛋白的相關(guān)表達(dá)量（圖2）顯示，spot1、2、3、5、6、7、8和9蛋白點(diǎn)僅在處理樣品中特異表達(dá)，spot4是處理比對(duì)照表達(dá)量上調(diào)2倍的差異蛋白點(diǎn)，spot10-19、22、23和26這13個(gè)

蛋白點(diǎn)僅在對(duì)照中有表達(dá)，spot20、21、24和25這4個(gè)蛋白點(diǎn)是處理后表達(dá)量下調(diào)2倍的差異蛋白，這些差異蛋白點(diǎn)在雙向電泳圖譜上的位置，見圖1。這些蛋白功能涉及防御相關(guān)蛋白、代謝相關(guān)的酶類、與蛋白質(zhì)命運(yùn)相關(guān)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相關(guān)蛋白等（表1）。不同類型的蛋白表達(dá)變化不一致，既有上調(diào)的蛋白也有下調(diào)的蛋白，說明巴豆醛處理影響水稻懸浮細(xì)胞的代謝過程，相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)生不同變化，

以適應(yīng)處理后的生理活動(dòng)。

表1 質(zhì)譜鑒定差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)

圖2 26個(gè)差異蛋白點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

細(xì)胞周期是真核細(xì)胞自我復(fù)制，高度保守的固有機(jī)制，植物細(xì)胞周期相關(guān)基因與植物的整個(gè)生命周期密切相關(guān)，相關(guān)研究已有綜述報(bào)道［15］。細(xì)胞凋亡過程是機(jī)體去除不需要的細(xì)胞，嚴(yán)格調(diào)控的生理過程。在人類研究上，巴豆醛處理會(huì)干擾正常的細(xì)胞周期，引起細(xì)胞的氧化脅迫，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死［16，17］。在植物上利用巴豆醛研究外界毒性物質(zhì)對(duì)細(xì)胞周期影響目前鮮見報(bào)道，本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究了巴豆醛處理水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞后蛋白質(zhì)組水平的變化，最后經(jīng)過質(zhì)譜鑒定的蛋白種類集中在脅迫反應(yīng)，蛋白質(zhì)命運(yùn)相關(guān)蛋白，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白以及代謝相關(guān)蛋白這四大類別。

3.1 防御相關(guān)蛋白

水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過巴豆醛處理后，熱激蛋白家族中的3個(gè)小分子量熱激蛋白誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)（spot1-3）。小分子Hsps（sHsps）是指大小為15-30 kD 的熱激蛋白家族，在細(xì)胞中廣泛存在，主要包含9個(gè)不同的成員：Hsp27、Hsp20、HspB3、MKBP/ HspB2、HspB8、HspB9、cvHsp、α-A crystallin和α-B crystallin。盡管這個(gè)家族成員間具有較低的氨基酸同源性，但它們之間具有相似的結(jié)構(gòu)和功能［18］。目前在人類細(xì)胞上的研究表明熱激蛋白與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，參與細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的多個(gè)環(huán)節(jié)，一方面，熱激蛋白主要起著抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活的作用。另一方面，某些熱激蛋白又能夠作為凋亡蛋白的分子伴侶，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［19］。α-B crystallin，作為sHsps家族的成員，參與抑制細(xì)胞的凋亡，在肌原性的分化過程中，α-B crystallin被證實(shí)能夠通過抑制caspase-3的活化來遏制細(xì)胞的凋亡［20］。Liu等［21］研究表明，在過氧化氫誘導(dǎo)的CeCl2細(xì)胞系的凋亡中，α-B crystallin能夠與p53（一個(gè)促凋亡蛋白）相互作用，并抑制p53從胞質(zhì)向線粒體的轉(zhuǎn)移，抑制細(xì)胞的凋亡。本試驗(yàn)中，巴豆醛處理后α-B crystallin的表達(dá)量上調(diào)。可見，其參與了巴豆醛引起的水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的脅迫反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞在逆境條件下的存活。

Spot13是一種假定蛋白，目前的基因組研究結(jié)果將其歸于熱激蛋白家族，具體的功能未有報(bào)告。

3.2 蛋白質(zhì)合成、分解相關(guān)蛋白

植物可利用多種途徑來調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的蛋白水平，其中泛素-蛋白酶體系（Ubiquitin-proteasome system，UPS）是主要調(diào)控途徑之一［22］，目前有報(bào)告指出UPS參與到植物生長(zhǎng)發(fā)育的許多方面，如細(xì)胞周期，細(xì)胞調(diào)亡過程和對(duì)環(huán)境的應(yīng)答反應(yīng)等［23］。本試驗(yàn)水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞用巴豆醛處理后，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)與UPS途徑相關(guān)的蛋白Skp1（spot4）和26S蛋白酶（spot17）的表達(dá)下調(diào)。有Skp1蛋白參與的Skp1/cullin/F-box（SCF）促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變［24］。26S蛋

白酶體廣泛分布于真核細(xì)胞中的胞質(zhì)和胞核，負(fù)責(zé)細(xì)胞大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解，在幾乎所有生命活動(dòng)中具有關(guān)鍵的調(diào)控作用，主要用于降解細(xì)胞不需要的或受到損傷的蛋白質(zhì)［25］。因?yàn)榈鞍酌阁w降解途徑對(duì)于細(xì)胞周期過程的正常運(yùn)轉(zhuǎn)都是必不可少的，本試驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)到的Skp1和26S蛋白酶的表達(dá)下調(diào)，表明巴豆醛處理導(dǎo)致水稻正常的細(xì)胞周期及由巴豆醛引起的細(xì)胞調(diào)亡過程均可能受到了影響，同時(shí)也說明了泛素—26S蛋白酶體系在水稻的細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)起到重要的調(diào)控作用，目前已有較多報(bào)道［22，26，27］，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制仍存在著爭(zhēng)議，這將是今后繼續(xù)研究的熱點(diǎn)問題。

Spot9是 CDC48（Cell division cycle protein 48）蛋白，是細(xì)胞周期調(diào)控的一個(gè)重要因素，是真核生物AAA 蛋白家族的一個(gè)重要成員，目前研究表明，CDC48對(duì)酵母菌、擬南芥、小鼠和人［28-31］等各種生物的細(xì)胞周期起著重要的調(diào)控作用。擬南芥CDC48主要定位在核區(qū)，通過功能缺失及顯性突變體的研究表明，擬南芥CDC48在細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)發(fā)育方面具有重要的調(diào)節(jié)作用［32］。煙草的NgCDC48定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，并可能參與蛋白水解過程［33］。而目前也有大量文獻(xiàn)報(bào)道，CDC48作為分子伴侶，也會(huì)影響細(xì)胞的凋亡過程［34-36］。目前在水稻中研究CDC48蛋白的功能未見有較多文獻(xiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)巴豆醛處理會(huì)導(dǎo)致CDC48蛋白表達(dá)量的上升，可能的原因是CDC48蛋白表達(dá)量的上升，其作為蛋白分子伴侶的功能活性增加，識(shí)別了在巴豆醛處理產(chǎn)生的有害的錯(cuò)誤折疊的異常蛋白，與其它因子協(xié)同作用，分解掉異常蛋白，縮短了巴豆醛導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，而其真正的調(diào)控機(jī)制需要通過進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)。

根據(jù)質(zhì)譜的鑒定結(jié)果，在水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞用巴豆醛處理后，折疊蛋白亞基3（prefoldin subunit3）的表達(dá)量上調(diào)，折疊蛋白屬于一種分子伴侶蛋白，在蛋白質(zhì)的從頭合成過程中起著重要的作用，在本試驗(yàn)中的機(jī)理可能是水稻細(xì)胞響應(yīng)巴豆醛會(huì)產(chǎn)生一些響應(yīng)蛋白，折疊蛋白表達(dá)量的升高，促進(jìn)響應(yīng)蛋白的正確折疊。

3.3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白

本試驗(yàn)鑒定出一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白TGF-beta receptor-interacting protein1（TRIP-1），TRIP-1具有雙重功能，首先TGF-β因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有重要的作用，在植物上已證實(shí)油菜素內(nèi)脂的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中TRIP-1發(fā)揮著重要作用［37］。另外，TRIP-1與真核生物翻譯起始因子eIF3的類似功能，在人和酵母中的研究表明，TRIP-1在調(diào)控發(fā)育、蛋白質(zhì)翻譯的起始及調(diào)控細(xì)胞周期方面具有重要的功能［38］。對(duì)擬南芥的研究表明，TRIP-1具有起始因子eIF3的功能，而TRIP-1是否具有其在類似酵母中在調(diào)控細(xì)胞分化方面的作用，目前的文獻(xiàn)并沒有明確的報(bào)道。在本試驗(yàn)中，當(dāng)巴豆醛處理水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞后，TRIP-1蛋白的表達(dá)量上調(diào)，這為研究其在水稻細(xì)胞周期過程的作用機(jī)制提供了一個(gè)有價(jià)值的信息，如何進(jìn)行調(diào)控，調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)途徑需要通過進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行明確。

3.4 新陳代謝和能量相關(guān)蛋白

根據(jù)質(zhì)譜鑒定分析結(jié)果，本試驗(yàn)共檢測(cè)到6種與糖代謝相關(guān)蛋白，包括糖酵解、三羧酸循環(huán)、戊糖磷酸途徑和其它的代謝途徑，在所檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)中，spot8是6-磷酸葡萄糖胺乙?；D(zhuǎn)移酶，是本試驗(yàn)中唯一個(gè)表達(dá)活性上調(diào)的糖代謝酶。在擬南芥的研究表明，該酶的活性與頂端生長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞的分裂與分化有關(guān)，用于細(xì)胞增殖所需的UDP-GlcNA和糖基磷脂酰肌醇錨［39，40］。在水稻的研究表明，此酶與根細(xì)胞的分化與植物激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)［41］。本研究中巴豆醛處理引起該酶的活性提高，根據(jù)前人研究結(jié)果，酶活性升高是促進(jìn)了細(xì)胞的分化，但本試驗(yàn)用巴豆醛處理是影響了細(xì)胞的分化，因此推斷6-磷酸葡萄糖胺乙?；D(zhuǎn)移酶可能是細(xì)胞自我進(jìn)行保護(hù)的一種方式。

其它與糖代謝相關(guān)的酶活性在巴豆醛處理后表達(dá)均下調(diào)，巴豆醛處理會(huì)導(dǎo)致糖代謝途徑部分酶活性減弱，其中spot15是核糖激酶，其與磷酸戊糖途徑有關(guān)，spot2是磷酸葡萄糖異位酶，存在于糖酵解途徑中；spot21是丙酮酸脫羧酶在無氧條件下丙酮酸的去路，spot26是順烏頭酸水解酶，是糖有氧分解檸檬酸循環(huán)途徑中的一個(gè)酶。上述酶活性的降低影響了細(xì)胞內(nèi)糖代謝水平，細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)能受到影響，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量的匱乏，影響了正常的細(xì)

胞周期活動(dòng)。spot24是蔗糖合成酶，目前有多個(gè)文獻(xiàn)［42，43］指出，蔗糖也是植物中的一個(gè)重要的“激素”信號(hào)分子，在細(xì)胞分裂過程中蔗糖是重要的調(diào)節(jié)物，尤其對(duì)于G1期的調(diào)控，本試驗(yàn)中巴豆醛會(huì)導(dǎo)致蔗糖合成途徑中關(guān)鍵酶活性降低，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蔗糖含量下降，從而影響其對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控。

巴豆醛處理后，糖代謝相關(guān)酶活性受到影響外，還鑒定出與蛋白質(zhì)代謝途徑相關(guān)的蛋白酶（spot22和spot25），與核酸代謝相關(guān)的蛋白酶（spot19）以及與次生物質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白酶（spot6），這些酶活性部分升高，部分降低，巴豆醛影響了細(xì)胞內(nèi)正常的代謝活動(dòng)，影響了細(xì)胞正常的分裂活動(dòng)。

3.5 膜活動(dòng)相關(guān)蛋白

本研究用巴豆醛處理后，膜聯(lián)蛋白（annexin，spot18）的表達(dá)下調(diào)，膜聯(lián)蛋白是一種廣泛分布于動(dòng)植物組織和細(xì)胞中依賴于鈣離子的磷脂結(jié)合蛋白家族，植物膜聯(lián)蛋白可參與細(xì)胞的胞吐、分泌和離子通道建立等一系列膜性活動(dòng)，有關(guān)其功能及調(diào)節(jié)機(jī)制處于起步階段，有研究表明其也參與植物逆境與發(fā)育等生理活動(dòng)中［44］。本試驗(yàn)證實(shí)了在正常的細(xì)胞活動(dòng)中，膜聯(lián)蛋白參與了細(xì)胞的分化，具體的調(diào)控機(jī)制目前無太多文獻(xiàn)報(bào)道，在水稻細(xì)胞中，膜聯(lián)蛋白與細(xì)胞周期活動(dòng)之間關(guān)系的研究是本試驗(yàn)得到的令人感興趣的問題，需要進(jìn)一步的研究。

本試驗(yàn)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果有一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白（spot7）兩個(gè)未知功能蛋白（spot10和spot16）這些蛋白在植物上的作用及其與細(xì)胞周期之間的關(guān)系需要進(jìn)一步的進(jìn)行研究。

4 結(jié)論

正常的水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過巴豆醛處理后，共檢測(cè)出45個(gè)差異蛋白點(diǎn)，經(jīng)過質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出26個(gè)蛋白質(zhì)身份，這些蛋白是與脅迫反應(yīng)、蛋白質(zhì)命運(yùn)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，新陳代謝和能量相關(guān)蛋白及與膜活性相關(guān)的蛋白。

［1］Vandepoele K, Raes J, De Veylder L, et al. Genome-wide analysis of core cell cycle genes in Arabidopsis［J］. Plant Cell, 2002, 14：903-916.

［2］Wang G, Kong H, Sun Y, et al. Genome-wide analysis of the cyclin family in Arabidopsis and comparative phylogenetic analysis of plant cyclin-like proteins［J］. Plant Physiol, 2004, 135：1084-1099.

［3］Menges M, Hennig L, Gruissem W, et al. Cell cycle-regulated gene expression in Arabidopsis［J］. J Biol Chem, 2002, 77：41987-42002.

［4］Zhao XA, Harashima H, Dissmeyer N, et al. A general G1/S-phase cell-cycle control module in the flowering plant Arabidopsis thaliana［J］. PLoS Genetics, 2012, 8（8）：e1002847.

［5］Leene JV, Hollunder J, Eeckhout D, et al. Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana［J］. Molecular Systems Biology, 2010, 6：397-405.

［6］Guo J, Song J, Wang F, et al. Genome-wide identification and expression analysis of rice cell cycle genes［J］. Plant Molecular Biology, 2007, 64（4）：349-360.

［7］Dori-Bachash M, Dassa B, Pietrokovski S, et al. Proteome-based comparative analyses of growth stages reveal new cell cycledependent functions in the predatory bacterium Bdellovibrio bacteriovorus［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2008：7152-7162.

［8］Agrawal GK, Rakwal R. Rice proteomics：A move toward expanded proteome coverage to comparative and functional proteomics uncovers the mysteries of rice and plant biology［J］. Proteomics, 2011, 11（9）：1630-1649.

［9］Neudecker T, Eder E, Deininger C, et al. Crotonaldehyde is mutagenic in Salmonella typhimurium TA100［J］. Environmental Molecular Mutagen, 1989, 14：146-148.

［10］Czerny C, Eder E, Runger TM. Genotoxicity and mutagenicity of the a, b-unsaturated carbonyl compound crotonaldehyde（butenal）on a plasmid shuttle vector［J］. Mutation Research, 1998, 407：125-134.

［11］Fernandes PH, Kanuri M, Nechev LV, et al. Mammalian cell mutagenesis of the DNA adducts of vinyl chloride and crotonaldehyde［J］. Environmental Molecular Mutagen, 2005, 45：455-459.

［12］Jenes B, Pauk J. Plant regeneration from protoplast derived calli in rice（Oryza sativa L.）using dicamba［J］. Plant Science, 1989, 62（3）：187-198.

［13］Wessel D, Flügge UI. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids［J］. Analytical Biochemistry, 1984, 138（1）：141-143.

［14］劉悅萍, 楊愛珍, 郭蓓, 等.適合水稻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)［J］.生物技術(shù)通報(bào), 2010（11）：82-86.

［15］Bryant JA, Francis D. The plant cell cycle［J］. Annals of Botany, 2011, 107：1063.

［16］Liu XY, Yang ZH, Pan XJ, et al. Gene expression profile and cytotoxicity of human bronchial epithelial cells exposed to crotonaldehyde［J］. Toxicology Letters, 2010a, 197（2）：113-122.

［17］Liu XY, Yang ZH, Pan XJ, et al. Crotonaldehyde induces oxidative stress and caspase-dependent apoptosis in human bronchial epithelial cells［J］. Toxicology Letters, 2010b, 195（1）：90-98.

［18］Waters ER, Lee GJ, Vierling E. Evolution, structure and function of the small heat shock proteins in plants［J］. Journal of Experimental Botany, 1996, 47（3）：325-338.

［19］Mehlen P, Schulze-Osthoff K, Arrigo AP. Small stress proteins as novel regulators of apoptosis［J］. Journal of Biological Chemistry, 1996, 271（28）：16510-16514.

［20］Kamradt MC, Chen F, Sam S. The small heat shock protein alpha B-crystallin negatively regulates apoptosis during myogenic differentiation by inhibiting caspase-3 activation［J］. Journal of Biological Chemistry, 2002, 277（41）：38731-38736.

［21］Liu S, Li J, Tao Y, et al. Small heat shock protein alpha Bcrystallin binds to p53 to sequester its translocation to mitochondria during hydrogen peroxide-induced apoptosis［J］. Biochemical Biophysical Research Communications, 2007, 354（1）：109-114.

［22］Smalle J, Vierstra RD. The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway［J］. Annual Review Plant Biology, 2004, 55：555-590.

［23］Baumeister W, Walz J, Zühl F, Seemüller E. The proteasome：Paradigm of a self compartmentalizing protease［J］. Cell, 1998, 92：367-380.

［24］Porat R, Lu P, O’Neil SD. Arabidopsis SKP1, a homologue of a cell cycle regulator gene, is predominantly expressed in meristematic cells［J］. Planta, 1998, 204（3）：345-351.

［25］Vierstra RD. The ubiquitin-26S proteasome system at the nexus of plant biology［J］. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2009, 10：385-397.

［26］Ciechanover A, Orian A, Schwartz AL. Ubiquitin-mediated proteolysis：biological regulation via destruction［J］. Bioessays, 2000, 22：442-451.

［27］Pickart CM. Mechanisms underlying ubiquitination［J］. Annual Review Biochemistry, 2001, 70：503-533.

［28］Feiler HS, Desprez T, Santoni V, et al. The higher plant Arabidopsis thaliana encodes a functional CDC48 homologue which is highly expressed in dividing and expanding cells［J］. The EMBO Journal, 1995, 14：5626-5637.

［29］Fr?hlich KU, Fries HW, Rudiger M, et al. Yeast cell cycle protein CDC48p shows full-length homology to the mammalian protein VCP and is a member of a protein family involved in secretion, peroxisome formation, and gene expression［J］. Journal of Cell Biology, 1991, 114：443-453.

［30］Shirogane T, Fukada T, Muller JM, et al. Synergistic roles for Pim-1 and c-Myc in STAT3-mediated cell cycle progression and Antiapoptosis［J］. Immunity, 1999, 11：709-719.

［31］Müller JM, Deinhardt K, Rosewell L, et al. Targeted deletion of p97（VCP/CDC48）in mouse resultsin early embryonic lethality［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007, 354：459-465.

［32］Sookhee P, David MR, Sebastian YB. In planta analysis of the cell cycle-dependent localization of AtCDC48A and its critical roles in cell division, expansion, and differentiation［J］. Plant Physiology, 2008, 148：246-258.

［33］Hansol B, Soo MC, Seong WY. Suppression of the ER-localized AAA ATPase NgCDC48 inhibits tobacco growth and development［J］. Molecular Cells, 2009, 28：57-65.

［34］Ralf JB, Hans Z. Mechanisms of Cdc48/VCP-mediated cell deathfrom yeast apoptosis to human disease［J］. Biochimica et Biophysica Acta, 2008, 1783：1418-1435.

［35］Rati V, Robert O, Ruihua F, et al. Cdc48/p97 mediates UV-dependent turnover of RNA pol II［J］. Molecular Cell, 2010, 41：82-92.

［36］Yeung HO, Kloppsteck P, Niwa H, et al. Insights into adaptor binding to the AAA protein［J］. Biochemical Society Transactions, 2008, 36：62-72.

［37］Müssig C, Fischer S, Altmann T. Brassinosteroid-regulated gene expression［J］. Plant Physiology, 2002, 129（7）：1241-1251.

［38］Mehra A, Wrana JL. TGF-β and the Smad signal transduction pathway［J］. Biochemistry and Cell Biology, 2002, 80（5）：605-622.

［39］Heike R, Herter T, Grishkovskaya I, et al. Crystal structure and

functional characterization of a glucosamine-6-phosphate N-acetyltransferase from Arabidopsis thaliana［J］. Biochemcal Journal, 2012, 443, 427-437.

［40］Nozakia M, Sugiyamab M, Duanc J, et al. A missense mutation in the glucosamine-6-phosphate N-Acetyltransferase-encoding gene causes temperature-dependent growth defects and ectopic lignin deposition in Arabidopsis［J］. The Plant Cell, 2012, 24（8）：3366-3379.

［41］Jiang H, Wang S, Dang L, et al. A novel short-root gene encodes a glucosamine-6-phosphate acetyltransferase required for maintaining normal root cell shape in rice［J］. Plant Physiology, 2005, 138：232-242.

［42］Riou-Khamlichi C, Menges M, Sandra HJM, et al. Sugar control of the plant cell cycle：differential regulation of Arabidopsis D-type cyclin gene expression［J］. Molecular and Cellular Biology, 2000, 7：4513-4521.

［43］Yang R, Tang Q, Wang H, et al. Analyses of two rice（Oryza sativa）cyclin-dependent kinase inhibitors and effects of transgenic expression of OsiICK6 on plant growth and development［J］. Annals of Botany, 2011, 107：1087-1101.

［44］Arpat AB, Waugh M, Sullivan JP, et al. Functional genomics of cell elongation in developing cotton fibers［J］. Plant Molecular Biology, 2004, 54：911-929.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Effects of Crotonaldehyde on the Protein Expression of Rice Suspension Cells

Liu Yueping1Guo Bei1Hu Hao2Zhang Guoqing1
（1. College of Biological Science and Engineering，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206；2. Plant Science and Technology College，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206）

In order to study the important proteins related to cell cycle of rice, the effect of crotonaldehyde on the protein expression of suspension cell line of rice was investigated. The proteins were separated by the method of two dimensional electrophoresis, the different protein spots were analyzed by PDQuest software, and then the different protein spots were identified by LCQ-Fleet ion trap and database searching. The results showed that there were forty-five protein spots expressed differently, and twenty-six of them were identified by mass spectrometry and database analysis. The predicted function of these proteins was related to stress response, protein synthesis and processing, signal transduction, metabolism membrane function. Some of the proteins, including small molecular proteins, Skp1, 26S proteasome, cell division cycle protein 48, glucosamine-6-phosphate acetyltransferase and sucrose synthase, were related with the cell cycle process. Other identified proteins should be study further to explore its function in cell cycle of rice. The normal cell cycle activity was effected by crotonaldehyde, some of the identified proteins were related with regulation of cell cycle. Other proteins related to cell differentiation had no reports about their function to cell cycle；these proteins should be study further to explore the mechanism of cell cycle regulation.

Crotonaldehyde Rice suspension cells Different proteomics Cell cycle

2014-02-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31101509）

劉悅萍，女，博士，副教授，研究方向：果實(shí)發(fā)育的蛋白質(zhì)組學(xué)；E-mail：cauping@sina.com