真菌蛋白激發(fā)子PevD1互作蛋白的酵母雙雜交篩選及融合蛋白的原核表達(dá)

唐小麗 伍文憲 韓磊 楊秀芬

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

真菌蛋白激發(fā)子PevD1互作蛋白的酵母雙雜交篩選及融合蛋白的原核表達(dá)

唐小麗 伍文憲 韓磊 楊秀芬

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

PevD1是大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）發(fā)酵液中分離純化的一種新蛋白激發(fā)子，能激發(fā)煙草和棉花的免疫防御反應(yīng)，提高抗病性。旨在深入研究PevD1的作用機(jī)理，利用酵母雙雜交系統(tǒng)，以PevD1為誘餌蛋白，篩選擬南芥中PevD1的互作蛋白，經(jīng)復(fù)篩、回轉(zhuǎn)驗(yàn)證得到3個候選互作蛋白基因R1，R2和R4。利用同源克隆技術(shù)獲得煙草中互作蛋白編碼基因NR1、NR2和NR4；經(jīng)酵母雙雜交驗(yàn)證其中的NR2蛋白能與PevD1特異性結(jié)合。利用原核表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pMAL-C2XNR2并轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了可溶性表達(dá)的NR2融合蛋白。

蛋白激發(fā)子 互作蛋白 酵母雙雜交 原核表達(dá)

蛋白激發(fā)子能激活植物免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)植物廣譜抗性，成為現(xiàn)代植物保護(hù)新的研究方向。蛋白激發(fā)子激發(fā)植物防御反應(yīng)主要包括植物對激發(fā)子的識別（與植物靶標(biāo)結(jié)合）、信號傳導(dǎo)以及防衛(wèi)基因表達(dá)調(diào)控等［1-3］，其中與植物靶標(biāo)結(jié)合是蛋白激發(fā)子誘導(dǎo)植物抗性的開關(guān)［4，5］，也是揭示激發(fā)子誘導(dǎo)植物抗性機(jī)制的關(guān)鍵。盡管已經(jīng)分離了眾多的微生物激發(fā)子（效應(yīng)子），但只鑒定了少數(shù)激發(fā)子的靶標(biāo)，主要是寡糖激發(fā)子和細(xì)菌、卵菌激發(fā)子，其中研究比較清楚的是細(xì)菌鞭毛效應(yīng)蛋白flg22的受體FLS2和延伸因子Tu（Elongation factor Tu，EF-Tu）的受體EFR［6-8］。細(xì)菌激發(fā)子（效應(yīng)子）通過分泌通道進(jìn)入植物并與植物靶標(biāo)蛋白互作，但目前真菌效應(yīng)子（激發(fā)子）進(jìn)入植物細(xì)胞的分子機(jī)制尚不清楚，而且這些激發(fā)子與植物互作蛋白的研究也比較緩慢。

PevD1是本實(shí)驗(yàn)室從大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）發(fā)酵液中分離到的一個新蛋白激發(fā)子，前期研究證明，該蛋白激發(fā)子能夠激活煙草早期防御

信號事件的發(fā)生（葉片H2O2的積累、細(xì)胞活性氧的爆發(fā)、胞外堿化以及NO的產(chǎn)生和積累）；引起防御物質(zhì)（胼胝質(zhì)、酚類和木質(zhì)素）的產(chǎn)生和積累；誘導(dǎo)煙草葉片的苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanin ammonia-lyase，PAL）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）等防御酶活性的提高，激發(fā)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性（Systemic aquired resistance，SAR）［9，10］。但煙草如何識別PevD1而激發(fā)煙草抗病反應(yīng)目前尚不清楚。本研究用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選PevD1互作蛋白，利用植物識別激發(fā)子的蛋白序列具有保守性的特點(diǎn)，同源克隆PevD1在煙草中的互作蛋白，同時建立該互作蛋白的大腸桿菌表達(dá)體系，以期為深入研究PevD的功能以及二者在植物細(xì)胞體內(nèi)和體外結(jié)合驗(yàn)證研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

三生煙（Nicotiana tabacum var. Sumsun NN）種子由本實(shí)驗(yàn)室保藏。酵母雙雜交系統(tǒng)中的擬南芥cDNA文庫，酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）Y2H-gold，pGADT7（AD）和pGBKT7（BD）質(zhì)粒，培養(yǎng)基：SD/-Trp，SD/-Leu，SD/-Trp/-Leu（DDO），SD/-His/-Trp/-Leu（TDO），SD/Ade/-His/-Trp/-Leu（QDO），SD/Ade/-His/-Trp/-Leu/x-α-gal等購于Clontech公司。大腸桿菌感受態(tài)Trans5α購自北京全式金公司；原核表達(dá)載體pMAL-C2X由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 誘餌載體的構(gòu)建 質(zhì)粒提取、雙酶切、連接及轉(zhuǎn)化等參照試劑說明書和相關(guān)的分子生物學(xué)方法手冊［10］。簡要操作步驟如下：PCR擴(kuò)增得到PevD1全長序列，將PevD1全長序列和提取的BD載體進(jìn)行雙酶切，再連接形成BD-PevD1重組載體，在ADH1啟動子驅(qū)動下表達(dá)GAL4 BD-PevD1的融合蛋白并測序驗(yàn)證。

1.2.2 誘餌蛋白PevD1在酵母細(xì)胞中的表達(dá)及自激活的檢測 采用PEG/LiAc法將上述構(gòu)建的BD-PevD1載體轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold，然后用菌落PCR和Western blot檢測驗(yàn)證PevD1在酵母細(xì)胞中的表達(dá)。雖然PevD1是一個真菌激發(fā)子，在酵母細(xì)胞中也具有潛在的激活基因轉(zhuǎn)錄的活性，所以在進(jìn)行酵母雙雜交試驗(yàn)前，先檢測BD-PevD1能否自激活雙雜交宿主菌Y2Hgold的報(bào)告基因。將分別轉(zhuǎn)化BD-PevD1+ AD和BD+AD組合質(zhì)粒的酵母細(xì)胞涂于DDO和QDO平板，30℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察酵母菌的生長情況。

1.2.3 PevD1在擬南芥中互作蛋白的篩選 將轉(zhuǎn)入BD-PevD1的酵母懸浮細(xì)胞（濃度大于1×108個細(xì)胞/mL）5 mL與1 mL文庫細(xì)胞混合，加入含有50 μg/mL的卡那霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24 h（30℃，30-50 r/min）。1 000 r/min離心10 min，收集菌體，然后用10 mL 0.5×YPDA重懸。取細(xì)胞懸浮液200 μL涂于TDO和QDO平板（共50-55個），30℃，倒置培養(yǎng)3-8 d。在QDO平板上得到的陽性克隆，再劃線于QDO+X-α-Gal平板，30℃恒溫培養(yǎng)3-5 d觀察是否變藍(lán)［11］。排除明顯的假陽性克隆后，用酵母PCR檢測試劑盒進(jìn)行菌落PCR，瓊脂糖電泳分離后進(jìn)行膠回收、測序。通過美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中的BLAST進(jìn)行同源性比較，剔除非編碼序列及移碼蛋白，以確認(rèn)與PevD1相互作用的候選蛋白。

1.2.4 酵母雙雜交陽性克隆的鑒定 將從文庫中篩選到的陽性克隆連接到誘餌載體BD上，同時將PevD1克隆到AD載體上，然后將兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞Y2Hgold。將共轉(zhuǎn)酵母細(xì)胞涂于DDO和QDO平板，30℃，恒溫培養(yǎng)3-5 d。在QDO平板上生長的菌落，劃線于QDO+x-α-gal平板，30℃恒溫培養(yǎng)3-5 d觀察是否變藍(lán)［12］。

1.2.5 PevD1在煙草中互作蛋白基因的同源克隆在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找與R1、R2和R4同源的煙草基因序列NR1、NR2和NR4，用植物組織RNA提取試劑盒（北京全式金公司）提取三生煙總RNA，取2 μg mRNA用于cDNA第一鏈的合成（具體方法參見北京全式金公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書）。根據(jù)從數(shù)據(jù)庫中獲得的NR1、NR2和NR4基因序列設(shè)計(jì)特異引物，通過PCR擴(kuò)增目的基因：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。目的條帶經(jīng)膠回收純化后連接到pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans5α，由北京華大公司完成測序。

1.2.6 互作蛋白NR2的原核表達(dá) 提取原核表達(dá)載體pMAL-C2X以及測序正確的pMD18-T-NR2質(zhì)粒，

用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切并回收載體片段及目的基因片段，22℃連接15 min后轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coli BL21（DE3）中，28℃過夜培養(yǎng)，待長出單菌落，以單菌落為模板進(jìn)行菌落PCR，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子后送公司測序。挑取pMAL-C2XNR2和pMAL-C2X空載體的單菌落，分別接種于50 mL含Amp（終濃度為100 μg/mL）的液體LB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/m振蕩培養(yǎng)6-7 h，再按1∶100的比例稀釋到1 L含Amp（100 μg/mL）新鮮液體LB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，溫度調(diào)至16℃，轉(zhuǎn)速調(diào)至200 r/min，待溫度降至16℃后，加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜，次日將菌液分別移入離心管中，4℃，5 000 r/min 離心15 min，棄上清，然后用40-50 mL pH8.0的Tris緩沖液重懸沉淀菌體，超聲破碎后的破碎液12 000 r/min離心50 min，取上清，將上清液先后通過麥芽糖結(jié)合蛋白親和層析和鎳柱親和層析進(jìn)行純化，最后用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 誘餌載體構(gòu)建與鑒定

PCR擴(kuò)增PevD1基因全長為468 bp，構(gòu)建含BD結(jié)構(gòu)域的誘餌載體BD-PevD1，形成在ADH1啟動子驅(qū)動下表達(dá)的GAL4 BD-PevD1融合蛋白。融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，通過菌液PCR 鑒定證明，PevD1已經(jīng)轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中（圖1-A），用PCR鑒定的陽性克隆培養(yǎng)液進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果（圖1-B）顯示，PevD1在酵母中能正確地表達(dá)。

圖1 PevD1基因在酵母細(xì)胞Y2Hgold中的表達(dá)鑒定

2.2 誘餌蛋白PevD1的自激活檢測

共轉(zhuǎn)BD+AD和BD-PevD1+AD組合質(zhì)粒的酵母菌均能在DDO平板上正常生長，菌落直徑一般都＞2 mm，說明該組合質(zhì)粒均成功轉(zhuǎn)入，而且BD-PevD1表達(dá)的融合蛋白對Y2Hgold 酵母細(xì)胞生長無毒性、無抑制作用。轉(zhuǎn)化BD-PevD1的酵母細(xì)胞在QDO平板未生長，說明誘餌載體BD-PevD1自身不具有轉(zhuǎn)錄激活活性，可進(jìn)行PevD1互作蛋白篩選（圖2）。

圖2 誘餌蛋白PevD1的自激活檢測

2.3 酵母雙雜交篩選PevD1擬南芥中互作蛋白

通過多次篩選，在QDO平板上得到108個陽性結(jié)果（菌落＞3 mm），再次將菌落劃線于QDO+X-α-Gal平板培養(yǎng)3 d后菌落變藍(lán)的為陽性。提取陽性克隆質(zhì)粒并進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在擬南芥基因庫進(jìn)行序列比對，經(jīng)過對測序的108個克隆分析，剔除一些假陽性結(jié)果，從中挑選15個與植物的發(fā)育、凋亡、抗逆、抗菌的相關(guān)基因克隆到BD載體，同時將PevD1基因克隆到AD載體，進(jìn)行酵母雙雜交的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，最終得到4個陽性結(jié)果（圖3），其中兩個基因與植物的發(fā)育與死亡相關(guān)（分別命名為R1，R2），一個與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)相關(guān)（R3），另一個與植物的抗菌相關(guān)（R4）。但其中轉(zhuǎn)有R1、R2和R4基因的轉(zhuǎn)化子在加有X-α-Gal的QDO平板上生長非常旺盛（圖3-1，3-2，3-4），而且均在2-3 d變藍(lán)。而圖3-3顯示，R3在加有x-α-gal的QDO平板上生長較弱，而且變藍(lán)需要時間長。所以最終確定R1、R2和R4為PevD1在擬南芥中的候選互作蛋白。

2.4 PevD1候選互作蛋白基因的同源克隆

通過PCR擴(kuò)增獲得三生煙中的3個候選互作蛋

白基因，分別命名NR1（PUT-173a-Nicotiana_tabacum-115714）、NR2（PUT-173a-Nicotiana_tabacum-64-888）和NR4（PUT-173a-Nicotiana_tabacum-29571），大小為891、951和774 bp。在NCBI數(shù)據(jù)庫比對，NR1、NR2和NR4與擬南芥同源基因的氨基酸序列一致性分別達(dá)到68.98%、51.27%和40.84%。

圖3 酵母雙雜交篩選擬南芥cDNA文庫互作蛋白

圖4 煙草同源基因NR1、NR2和NR4的克隆

2.5 煙草中PevD1候選互作蛋白的酵母雙雜交驗(yàn)證

利用上述的酵母雙雜交系統(tǒng)，將3個候選互作蛋白基因構(gòu)建到AD載體并與上述已構(gòu)建的BDPevD1載體共轉(zhuǎn)酵母細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果（圖5-1，5-2）表明組合質(zhì)粒已成功共轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞，其中AD-NR1+BD、AD-NR2+BD和AD-NR4+BD轉(zhuǎn)化子在QDO平板上不生長，說明這3個蛋白均無自激活活性（圖5-3）。能在加入AbA和X-α-Gal的QDO培養(yǎng)基上生長且在2-3 d之內(nèi)形成菌落的只有ADNR2+BD-PevD1轉(zhuǎn)化子（圖5-4），說明只有NR2 與PevD1 特異性結(jié)合。

圖5 PevD1在煙草中候選互作蛋白酵母雙雜交驗(yàn)證

2.6 候選互作蛋白NR2生物信息學(xué)分析

通過SMART在線預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)軟件預(yù)測分析，NR2含有335個氨基酸殘基，在N端1-199 aa形成4個低復(fù)雜區(qū)域，在C 端有一段包含130 aa的非常保守的氨基酸序列，命名為生長發(fā)育與細(xì)胞死亡（Development and cell death，DCD）結(jié)構(gòu)域。根據(jù)預(yù)測DCD功能結(jié)構(gòu)域在蛋白中的位置，NbR2屬于含DCD結(jié)構(gòu)域蛋白家族的I亞組，目前已報(bào)道的有 4類蛋白，包括B2 蛋白、Gda1 蛋白、天門冬酰胺豐富蛋白（N-rich protein，NRP）和GDA2蛋白（AJ491856.1）。這些蛋白與植物發(fā)育、細(xì)胞死亡、植物對病原菌和非生物脅迫的早期反應(yīng)均有直接或者間接的關(guān)系。系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）顯示，NR2與胡蘿卜的B2蛋白和大豆的N-rich 蛋白聚類為一類。推測NR2可能與B2和N-rich蛋白具有相似的功能。

圖6 通過鄰接法構(gòu)建的 NR2與包含DCD結(jié)構(gòu)域的蛋白構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.7 候選互作蛋白的原核表達(dá)

為了進(jìn)一步研究候選互作蛋白的功能，需要獲得可溶性表達(dá)的蛋白。通過原核表達(dá)載體的篩選，pMAL-C2X適于NR2蛋白表達(dá)，該表達(dá)載體可以提高目標(biāo)蛋白的可溶性。為了便于表達(dá)蛋白的純化，設(shè)計(jì)引物時在蛋白的C端引入6個組氨酸密碼子的HIS標(biāo)簽。將構(gòu)建的重組原核表達(dá)載體pMALC2X-NR2和空白對照質(zhì)粒pMAL-C2X分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后SDS-PAGE凝膠電泳檢測，目標(biāo)蛋白可以可溶性表達(dá)。由于所克隆的NR2基因?yàn)?51 bp，其編碼蛋白分子量約為38 kD，pMAL-C2X上的MBP標(biāo)簽蛋白為40 kD，因此pMAL-C2X-NR2融合蛋白的分子量約為78 kD。SDSPAGE（圖7）分析顯示，與pMAL-C2X空載體表達(dá)產(chǎn)物相比，在70 kD左右多了一條比較明顯的蛋白條帶。將pMAL-C2X-NR2破碎的菌液經(jīng)過鎳柱和麥芽糖結(jié)合蛋白親和層析之后得到單一的蛋白條帶，分子量為78 kD左右。說明pMAL-C2X-NR2在大腸桿菌中成功表達(dá)，經(jīng)過親和層析純化，得到了純化的融合表達(dá)蛋白。

圖7 pMAL-C2X-NR2原核表達(dá)和純化SDS-PAGE電泳分析

3 討論

植物在長期抵御生物和非生物逆境因子過程中逐漸形成了先天免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含復(fù)雜的識別機(jī)制，使植物通過感知“非我”分子來啟動防衛(wèi)反應(yīng)抵抗外來入侵者［13］。植物與病原真菌互作是通過激發(fā)子或效應(yīng)子來實(shí)現(xiàn)的，植物細(xì)胞接受微生物產(chǎn)生的激發(fā)子，通過特有的信號傳導(dǎo)途徑，調(diào)控防御基因的表達(dá)和防御物質(zhì)的形成，使植物獲得免疫特性?；诘鞍踪|(zhì)的相互作用來研究蛋白激發(fā)子與植物互作機(jī)理是當(dāng)前植物病理學(xué)的熱點(diǎn)領(lǐng)域，也是揭示激發(fā)子誘導(dǎo)植物抗性機(jī)制的重要基礎(chǔ)，對人類有效控制植物病害具有非常重要的指導(dǎo)作用［14］。

許多植物可以通過程序性細(xì)胞死亡或稱過敏反應(yīng)（Hypersensitive response，HR）的形式識別病原微生物或其產(chǎn)生的激發(fā)子。死亡細(xì)胞產(chǎn)生信號激發(fā)植物免疫系統(tǒng)，使受刺激的周圍細(xì)胞乃至整株植株產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)以限制病原微生物的擴(kuò)展［15］。本研究的蛋白激發(fā)子PevD1是大麗輪枝菌分泌蛋白，引起煙草的HR、激發(fā)煙草免疫反應(yīng)，而HR反應(yīng)之后的免疫分子機(jī)制尚不清楚。NR2屬于含DCD結(jié)構(gòu)域蛋白家族的I亞組，該家族蛋白參與植物發(fā)育、細(xì)胞死亡、植物對病原菌和非生物脅迫的早期反應(yīng)等，但NR2在煙草中的功能尚未見報(bào)道。本研究用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選并驗(yàn)證獲得了蛋白激發(fā)子PevD1互作蛋白NR2，該蛋白含有非常保守的DCD結(jié)構(gòu)域。2001年Ludwig和Tenhaken［16］首次發(fā)現(xiàn)了大豆HR反應(yīng)強(qiáng)烈誘導(dǎo)了含DCD結(jié)構(gòu)域的天門冬酰胺豐富蛋白（N-rich protein，NRP），其定位于細(xì)胞壁［16］，此后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了胡蘿卜B2 蛋白［17］，豌豆Gda1蛋白［18］都包含DCD結(jié)構(gòu)域。DCD是一個約130個氨基酸的長鏈，包含了幾個保守的基序，如N端的FGLP和 LFL基序、C端的 PAQV和PLxE基序。目前只在植物中發(fā)現(xiàn)了含有DCD結(jié)構(gòu)域的蛋白，隨著對該類蛋白研究的不斷深入，已證明含有DCD結(jié)構(gòu)域的蛋白參與由臭氧和病原菌引起的程序性植物細(xì)胞死亡、對病原菌刺激的早期反應(yīng)以及抗逆反應(yīng)等［16，18，19］。蛋白間的相互作用對于生物學(xué)功能的發(fā)揮是非常重要的，本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出108個PevD1擬南芥文庫的候選互作蛋白，通過理論分析和酵母雙雜交回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，最終確定煙草NR2與PevD1特異結(jié)合?？梢约僭O(shè)PevD1可能是通過識別煙草中的NR2后引起煙草的過敏反應(yīng)，繼而激發(fā)了一系列的信號傳遞通路，最終引起煙草對TMV的免疫反應(yīng)，但這些假設(shè)需要今后深入探討。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證NR2與PevD1的體外互作，需要獲得可溶性的表達(dá)蛋白。本研究曾篩選多種表達(dá)

NR2的載體，但均未能得到理想的蛋白表達(dá)。原核表達(dá)載體pMAL-C2X能提高目標(biāo)蛋白的可溶性，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化，獲得了正確表達(dá)的可溶性蛋白，并通過在表達(dá)載體上加組氨酸標(biāo)簽和自身帶有MBP標(biāo)簽進(jìn)行親和層析純化得到了一定純度和一定濃度的目的蛋白，為候選互作蛋白的功能研究和體外結(jié)合驗(yàn)證研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究以蛋白激發(fā)子PevD1為誘餌蛋白，從擬南芥cDNA文庫中篩選到R1、R2和R4三個互作蛋白。利用同源克隆技術(shù)獲得了煙草中的3個同源基因，其蛋白分別命名為NR1、NR2和NR4。用酵母雙雜交技術(shù)驗(yàn)證了只有NR2與PevD1特異性結(jié)合，確定了NR2是PevD1在煙草細(xì)胞中的結(jié)合蛋白。將NR2蛋白基因構(gòu)建于原核表達(dá)載體pMAL-C2X上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)得到大量可溶性重組蛋白，通過麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽和組氨酸標(biāo)簽親和層析技術(shù)獲得了純度較高、性質(zhì)穩(wěn)定的MBP-NR2融合表達(dá)蛋白。

［1］Okinaka Y, Yang CH, Perna NT, et al. Microarray profiling of Erwinia chrysanthemi 3937 genes that are regulated during plant infection［J］. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2002, 7：619-629.

［2］Garcia BA, Lamotte O, Vandelle E, et al. Early signaling events induced by elicitors of plant defenses［J］. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2006, 19（7）：711-724.

［3］Schwessinger B, Ronald PC. Plant innate immunity：perception of conserved microbial signatures［J］. Annual Review of Rlant Biology, 2012, 63：451-482.

［4］Heath MC. Hypersensitive response-related death［J］. Plant Molecular Boilogy, 2000, 44：321-334.

［5］Kamoun S. Nonhost resistance to Phytophthora：novel prospects for a classical problem［J］. Curr Opin Plant Biol, 2001, 4：295-300.

［6］Gómez GL, Boller T. Flagellin perception：a paradigm for innate immunity［J］. Trends in Plant Science, 2002, 7（6）：251-256.

［7］Zipfel C, Kunze G, Chinchilla D, et al. Perception of the bacterial PAMP EF-Tu by the receptor EFR restricts agrobacterium-mediated transformation［J］. Cell, 2006, 125（4）：749-760.

［8］Chinchilla D, Bauer Z, Regenass M, et al. The Arabidopsis receptor kinase FLS2 binds flg22 and determines the specificity of flagellin perception［J］. The Plant Cell, 2006, 18：465-476.

［9］Wang B, Wang S, Tan B, et al. The purification and characterization of a novel hypersensitive-like response-inducing elicitor from Verticillium dahliae that induces resistance responses in tobacco［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93：191-120.

［10］王炳楠, 王雙超, 檀貝貝, 等.大麗輪枝菌蛋白激發(fā)子PevD1誘導(dǎo)的煙草對煙草花葉病毒（TMV）系統(tǒng)獲得性抗性及其分子機(jī)制［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2012, 20（2）：188-195.

［11］薩姆布魯克丁, 曼尼阿蒂斯T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.第2版.北京：科學(xué)出版社, 1989：34-74.

［12］Cho SK, Ryu MY, Song C, et al. Arabidopsis PUB22 and PUB23 are homologous U-Box E3 Ubiquitin ligases that play combinatory roles in response to drought stress［J］. The Plant Cell, 2008, 20：1899-1914.

［13］Hogenhout SA, Vander Hoornr AL, Terauchi R, et al. Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms［J］. Molecular Plant Microbe Interactions, 2009, 2：115-122.

［14］Dewit M, Mehrabi R, Vandenburg H, et al. Fungal effector proteins：past, present and future［J］. Molecular Plant Pathology, 2009, 10（6）：735-747.

［15］Tenhaken R, Doerks T, Bork P. DCD—a novel plant specific domain in proteins involved in development and programmed cell death［J］. BMC Bioinformatics, 2005, 6：169.

［16］Ludwig AA, Tenhaken R. A new cell wall located N-rich protein is strongly induced during the hypersensitive response in Glycine max L.［J］. Eur J Plant Pathol, 2001, 107：323-336.

［17］Schrader S, Kaldenhoff R, Richter G. Expression of novel genes during somatic embryogenesis of suspension-cultured carrot cells（Daucus carota）［J］. J Plant Pathol, 1997, 150：63-68.

［18］Li HY, Guo ZF, Zhu YX. Molecular cloning and analysis of a pea cDNA that is expressed in darkness and very rapidly by gibberellic acid［J］. Mol Gen Genet, 1998, 259：393-397.

［19］Reis PAA, Rosado GL, Silva LAC, et al. The binding protein BiP attenuates stress-induced cell death in soybean via modulation of the N-rich protein-mediated signaling pathway［J］. Plant Physiology, 2011, 157（4）：1853-1865.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Screening of Interacting Proteins with Fungal Elicitor PevD1 by Yeast Two Hybrid System and High Expression of Recombinant in E. coli

Tang Xiaoli Wu Wenxian Han Lei Yang Xiufen
（The State Key Laboratory for Biology of Plant Disease and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100081）

PevD1, a fungal protein elicitor, was secreted from Verticillium dahliae and could induce hypersensitive responses（HR）and systemic acquired resistances（SAR）in tobacco plant. In this study, we screened its interaction partners using yeast two hybrid system with Arabidopsis thaliana cDNA library. Three potential interacting proteins were obtained. Homologous genes NR1, NR2 and NR4 in Nicotiana tobacum were cloned. Yeast two-hybrid binding assays confirmed NR2 protein strangely binding with PevD1. The entire coding region of NR2 gene was cloned into the bacterial expression vectors pMAL-C2X. After IPTG induction and SDS-PAGE analysis showed that the target protein was expressed at a high level in bacterial cells.

Fungal elicitor PevD1 Interacting protein Yeast two hybrid system Protein expression

2014-02-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272086）

唐小麗，女，碩士研究生，研究方向：微生物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：tangxiaoli200845@163.com

楊秀芬，研究員，研究方向：蛋白激發(fā)子誘導(dǎo)植物抗病性作用機(jī)理；E-mail：yangxiufen@caas.cn