產(chǎn)漆酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

王巍杰，張 杰

(1.河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北唐山063009;2.河北聯(lián)合大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，河北唐山063000)

漆酶(Laccase，E.C.1.10.3.2)是一種含銅多功能多酚氧化酶，屬于藍(lán)色氧化酶家族［1］，漆酶能夠催化O－和P－聯(lián)苯酚、多酚、芳香胺、苯硫醇和酚類染料等的氧化反應(yīng)，在紙漿生物漂白、廢水處理、苯氧基類除草劑去毒等領(lǐng)域得到了廣泛的研究和應(yīng)用［2］。產(chǎn)漆酶菌株在自然界中分布廣泛，但自然條件下能夠有效分解木質(zhì)素且產(chǎn)酶率較高的菌株不多，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法滿足工業(yè)生產(chǎn)對(duì)漆酶的需要。漆酶最早從漆樹(shù)中發(fā)現(xiàn)，一些高等真菌和細(xì)菌也能分泌漆酶，目前研究和應(yīng)用最廣泛的是擔(dān)子菌、子囊菌等微生物，尤其是擔(dān)子菌中的白腐真菌［3］。本文研究從腐木中篩選產(chǎn)漆酶較高的菌株，探索葵花粉發(fā)酵產(chǎn)漆酶的優(yōu)化條件。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品:來(lái)源于河北省唐山市南湖公園潮濕土壤的腐朽木材。

葵花粉:向日葵花盤(pán)采摘自河北唐山周邊地區(qū)，沖洗、曬干、粉碎、過(guò)篩。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 愈創(chuàng)木酚PDA固體培養(yǎng)基:土豆浸液1000 mL，葡萄糖20 g，KH2PO43.0 g，MgSO41.5 g，酵母浸膏0.5 g，瓊脂18 g，愈創(chuàng)木酚0.4 mL，pH自然，于121℃滅菌20 min。

1.2.2 液體種子培養(yǎng)基:葡萄糖10 g，酵母浸膏0.5 g，CuSO4·5H2O 4 mg，營(yíng)養(yǎng)鹽濃縮液100 mL，微量元素濃縮液1 mL，pH5.8醋酸緩沖溶液50 mL，定容至1000 mL，于121℃滅菌20 min;

營(yíng)養(yǎng)鹽濃縮液:MgSO4·7H2O 0.2g，KH2PO420g，(NH4)2SO414g，CaCl2·2H2O 4g，H2O 1000 mL。

微量元素濃縮液:FeSO4·7H2O 5g，MnSO4·7H2O 1.6g，CoCl2·6H2O 3.7g，ZnSO4·7H2O 1.4g，H2O 1000 mL。

1.2.3 產(chǎn)酶培養(yǎng)基:葵花粉50.00 g，KH2PO43.0 g，MgSO41.5 g，CaCl40.1 g，酵母浸膏0.5 g，微量元素濃縮液1 mL，pH5.8醋酸緩沖溶液100 mL，定容至1000 mL，分裝后于121℃滅菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 初篩

將腐朽木材粉碎成直徑2 mm的小塊，用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)漂洗2～3次，每次約1 min，然后用少量醫(yī)用乙醇進(jìn)行短時(shí)間漂洗消毒，最后用無(wú)菌蒸餾水洗掉乙醇。用無(wú)菌濾紙將樣品吸干后，點(diǎn)接到愈創(chuàng)木酚PDA固體培養(yǎng)基平板上，每個(gè)平板2－3塊，28℃培養(yǎng)，觀察菌落顏色及其周?chē)袩o(wú)棕紅色菌圈產(chǎn)生，挑選出長(zhǎng)菌落生長(zhǎng)活力較高、變色圈直徑較大顏色較深的菌株，反復(fù)純化直至初步獲得純菌株，4℃冰箱保藏。

1.3.2 復(fù)篩

將保藏的菌種菌絲接種到不含愈創(chuàng)木酚的PDA平板上，28℃培養(yǎng)活化，待平板剛好長(zhǎng)滿菌絲，將菌絲接種到含有玻璃珠的50 mL基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基，28℃，150 r/min，振蕩培養(yǎng)5 d，測(cè)漆酶活性。

1.3.3 種子液制備及發(fā)酵培養(yǎng)

挑取菌絲接種到含有玻璃珠的50mL種子培養(yǎng)基中，28℃，150 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h，備用。

稱取2.50 g葵花粉于250 mL三角瓶中，按1:20加入基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基50 mL，121℃滅菌20 min。待冷卻至常溫，接入適量種子液，28℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液于4℃、4000 r/min離心的上清液，即為粗酶液。

1.3.4 漆酶活力測(cè)定

準(zhǔn)確量取0.1 mL粗酶液于2.5 mL pH4.5的醋酸緩沖液后，加入0.4 mL 1 mmol/L的ABTS溶液，靜置30 s，紫外－可分光光度計(jì)在420 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算漆酶活力［4，5］。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

經(jīng)平板篩選純化、美蘭染色、顯微鏡觀察菌絲形態(tài)和漆酶活性測(cè)定得到一株產(chǎn)漆酶白腐菌菌株［6］。

2.2 產(chǎn)漆酶條件的初步優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)漆酶的影響

將適量種子液接種到適宜基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，150 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)，從2 d開(kāi)始測(cè)定漆酶活力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示:隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力逐漸增加，7d酶活達(dá)到34.35U/mL，隨后酶活變化不大，10 d后隨著時(shí)間增加酶活力逐漸降低，因此，確定產(chǎn)漆酶時(shí)間為7 d。

2.2.2 不同氮源對(duì)產(chǎn)漆酶的影響

分別按0.025%的添加量向適量產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基加入硝酸銨、尿素、氯化銨、硫酸銨和蛋白胨四種氮源，控制相同適宜接種量，150 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)7 d，測(cè)定漆酶活力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。表明不同氮源產(chǎn)漆酶活力的影響順序?yàn)榱蛩徜@＞硝酸銨＞氯化銨＞尿素＞蛋白胨，因此，確定硫酸銨為最佳氮源。

2.2.3 pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

控制相同接種量和培養(yǎng)基，將發(fā)酵液 pH值分別用0.1 mol/L的乙酸、乙酸鈉溶液調(diào)節(jié)至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，150 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)7 d，測(cè)定漆酶活力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明隨著培養(yǎng)基pH值從4.0至5.5，漆酶活力逐漸升高，pH值5.5產(chǎn)漆酶活力最大49.79 U/mL;pH值在6.0～7.0之間，漆酶活力逐漸降低。因此，確定pH值為5.5。

2.3.4 接種量對(duì)產(chǎn)漆酶的影響

分別接種6%、8%、10%、12%、14%不同體積比的種子液于相同發(fā)酵液中，控制相同的發(fā)酵條件:pH值5.5，28℃振蕩150 r/min培養(yǎng)7 d，測(cè)定漆酶活力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4，結(jié)果顯示，在接種量2%～12%的范圍內(nèi)，隨著接種量的逐漸增加，酶活力逐漸增加，8% 時(shí)達(dá)到最大值，隨后酶活力呈下降趨勢(shì)。因此，確定接種量為8%。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖2 不同氮源對(duì)產(chǎn)漆酶的影響

圖3 pH對(duì)產(chǎn)漆酶的影響

2.3.5 裝液量對(duì)產(chǎn)漆酶條件的影響

將30、40、50、60、70、80、90 mL發(fā)酵培養(yǎng)基分別裝入250 mL三角瓶，接種8%的種子液，調(diào)節(jié)pH值為5.5，150 r/ min、28℃振蕩培養(yǎng)7 d，測(cè)定漆酶活力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示在裝液量30～80 mL范圍內(nèi)，隨著裝液量的逐漸增加，酶活力逐漸增加，50 mL時(shí)酶活力達(dá)到最大值50.55 U/mL，隨后逐漸減小。因此，確定裝液量為50 mL

2.3.6 誘導(dǎo)劑及表面活性劑對(duì)產(chǎn)酶的影響

在250 mL的50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.01%的愈創(chuàng)木酚、ABTS、苯酚、吐溫－80、吐溫－20和SDS，控制接種量8%、pH值5.5、150 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)7 d，測(cè)定漆酶活力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果表明:與不加任何誘導(dǎo)劑及表面活性劑的空白相比，加入愈創(chuàng)木酚和苯酚，漆酶活力均得到了較大程度的提高，而ABTS對(duì)漆酶活力影響不大;吐溫－80對(duì)漆酶分泌有較高的促進(jìn)作用，而其他表面活性劑特別是吐溫－20對(duì)漆酶的分泌都有明顯的抑制作用，可能是因?yàn)檫@些表面活性劑對(duì)菌體細(xì)胞造成了一定程度的損害，影響了漆酶的分泌。因此，可在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.01%的愈創(chuàng)木酚。

圖4 接種量對(duì)產(chǎn)漆酶的影響

圖5 裝液量對(duì)產(chǎn)漆酶的影響

圖6 誘導(dǎo)劑及表面活性劑對(duì)產(chǎn)漆酶的影響

3 結(jié)論

從潮濕腐木篩選產(chǎn)漆酶白腐菌菌株菌種，以漆酶活性為指標(biāo)，確定以葵花粉為原料產(chǎn)漆酶的條件:發(fā)酵培養(yǎng)基中0.025%硫酸銨，pH5.5，接種量8%，裝液量50 mL，愈創(chuàng)木酚0.10%，培養(yǎng)時(shí)間7d。

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