L-鼠李糖的制備及檢測方法研究進展

高旭東，郝寶成，梁劍平*，陳士恩

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州 730050;2.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730030)

甘露糖六位的一個羥基被氫取代而衍生的一種單糖，稱為L-鼠李糖(Rhamnose)，又稱鼠李糖、甲基戊糖，L-鼠李糖的純品為無色粉末，呈結(jié)晶狀，自然界里主要存在于植物多糖、糖苷、植物膠及細菌多糖中，多為L型。其甜度是蔗糖的33%，可用于生產(chǎn)香精香料，可食用;可以作為藥物的中間體、合成強心藥物;可與其他物質(zhì)反應形成風味物質(zhì)、用作甜味劑;可用于農(nóng)作物疾病的防治;還可作為腸道滲透測試劑使用，并具有明顯的抗癌作用［1-3］。

L-鼠李糖可以在植物中提取，也可以用發(fā)酵法等途徑進行工業(yè)生產(chǎn)。目前，國內(nèi)外提取、分離和制備L-鼠李糖的技術(shù)工藝水平日趨提高，筆者就近年來L-鼠李糖的制備方法和檢測方法等幾方面概述L-鼠李糖的研究進展。

1 L-鼠李糖的制備方法

1.1 植物中L-鼠李糖的提取 在自然界中，由于L-鼠李糖多存在于植物和細菌中，故可利用植物資源提取L-鼠李糖。肖芳等在穿龍薯蕷皂甙酸解液中提取L-鼠李糖所選方法為醇提取聯(lián)合高壓酸解法［4］。具體操作為:取新鮮穿龍薯蕷100 g，研磨并過篩后離心15 min，加醇提取所得離心沉淀2次，合并提取液，水浴蒸餾，溶劑回收，剩余餾渣即皂甙粗提物;60℃干燥至恒重后，于0.14 MPa下將其加適量酸水解一定時間，過濾;濾液添加Ca(OH)2中和至中性或偏酸性，脫色并過濾，添加酵母培養(yǎng)數(shù)小時，跟蹤測定葡萄糖至耗盡，發(fā)酵終止;過濾除去酵母及部分雜質(zhì)，測定濾液的L-鼠李糖含量，計算L-鼠李糖得率;濾液濃縮后用乙醇重結(jié)晶，得L-鼠李糖晶體，最終L-鼠李糖得率最高為0.196%。

劉叔興等以盾葉薯蕷(黃姜)為原料，從皂苷酸解液中提取出L-鼠李糖［5］。粉碎干黃姜，研磨后過篩，精密稱取10 g，萃取劑選用體積分數(shù)30%的乙醇，與適量的十二烷基硫酸鈉混合均勻。試驗條件:黃姜和乙醇的質(zhì)量比是1∶10，25.8 kHz為超聲波頻率，超聲40 min，對總皂苷進行提取，抽濾后濃縮濾液，加入濃度為1.5 mol/L的硫酸20 ml，于電熱套內(nèi)水解4 h，完畢后抽濾，濾渣沖洗至中性后烘干，可于索氏提取器內(nèi)提取制備皂苷元，濾液即為酸解液，向酸解液中加入Ca(OH)2調(diào)節(jié)pH至中性或者偏酸性，過濾除去CaSO4沉淀，于濾液中加入活性炭進行脫色，過濾除去色素，得到無明顯顏色的濾液。然后加入2% 的活化酵母，36℃恒溫發(fā)酵，用薄層色譜法跟蹤測定葡萄糖，待其耗盡即可終止發(fā)酵，過濾除去雜質(zhì)，將濾液進行L-鼠李糖含量測定并計算得率。濾液濃縮后用甲醇重結(jié)晶，可得L-鼠李糖晶體，最終L-鼠李糖得率最高為1.5%。

以黃姜為原料，楊謙等研究了L-鼠李糖的提取工藝［6］。黃姜，也被稱為盾葉薯蕷，內(nèi)含薯蕷皂甙元的成甙糖類包含1個葡萄糖和2個L-鼠李糖，故可用于提取L-鼠李糖。優(yōu)化試驗后，以50 g/L稀硫酸溶液為水解液水解2 h后，加入酵母菌發(fā)酵2 h(pH為6)，得出L-鼠李糖提取率為1.5%。

雖然植物是提取L-鼠李糖的重要來源，但由于其復雜的分離工藝以及高濃度的多糖限制了發(fā)酵中氧和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，故該方法有一定的局限性。

1.2 生物酶解法制備L-鼠李糖 L-鼠李糖多從天然植物中獲得，如從橡樹皮中提取櫟皮酮，通過水解得到含L-鼠李糖的溶液，經(jīng)分離提純獲得L-鼠李糖純品。此類生產(chǎn)方法有一定缺點，如勞動強度大，分離提純過程中易生成有毒物質(zhì)，原材料受季節(jié)、地域及運輸?shù)纫蛩赜绊懀?］。

作為方法改進，張美超等利用微生物所產(chǎn)的蘆丁α-L-鼠李糖苷酶酶解制備L-鼠李糖［1］。試驗前期已篩選出一種蘆丁α-L-鼠李糖苷酶，該酶能特異性水解蘆丁上的L-鼠李糖苷鍵，生成異槲皮苷和L-鼠李糖［8］。取蘆丁24.0 g酶解，產(chǎn)物用大孔吸附樹脂分離，得L-鼠李糖粗糖液4.18 g，產(chǎn)率為17.4%?；诮Y(jié)晶法對L-鼠李糖粗糖液精制，在L-鼠李糖水溶液質(zhì)量濃度0.4 g/ml時，溶液達到過飽和狀態(tài)并開始結(jié)晶，得無色透明結(jié)晶，產(chǎn)率為27.5%。經(jīng)高效液相色譜檢測，L-鼠李糖純度高達99.0%。研究可為生物轉(zhuǎn)化法大量生產(chǎn)L-鼠李糖提供研究依據(jù)，生物酶法因其具有水解特異性好、環(huán)境友好等特點，為L-鼠李糖的制備提供了新的思路。

1.3 微生物發(fā)酵制備L-鼠李糖 利用微生物生產(chǎn)含有L-鼠李糖的L-鼠李糖脂是大規(guī)模生產(chǎn)L-鼠李糖較有發(fā)展前景的方法。發(fā)酵法生產(chǎn)L-鼠李糖較常選用假單孢菌，其中銅綠假單孢菌［9］最為常用。培養(yǎng)的碳源、氮源、無機離子種類及濃度變化，均會影響L-鼠李糖脂的生物合成，有些碳源適于糖脂的形成。在微生物發(fā)酵法制備L-鼠李糖的條件對比研究中，李祖義等選取糠油為碳源，利用假單胞菌發(fā)酵制備L-鼠李糖脂，水解后分離得L-鼠李糖［7］。

也可利用再生材料制備L-鼠李糖脂，水解后得L-鼠李糖。雖然生產(chǎn)L-鼠李糖脂的原料一直來源很廣，從石油化學衍生的物質(zhì)到天然原料，最常用的是植物油、糖和甘油。現(xiàn)已證明，許多廢棄物也可能用于生產(chǎn)L-鼠李糖脂，如脂肪酸、廢煎炸油、橄欖油的生產(chǎn)廢水、乳清廢物［10］?？偨Y(jié)了“傳統(tǒng)的”生產(chǎn)L-鼠李糖脂的可再生原料:糖、油、甘油及潛在的可利用廢棄物?？偨Y(jié)了對下一代產(chǎn)L-鼠李糖脂菌種的要求，如下:擴大原料譜，增加代謝譜，減少副產(chǎn)物的形成和更易于控制。如果能達到這點，L-鼠李糖脂的規(guī)?；a(chǎn)在經(jīng)濟上是可行的，并且在不遠的將來，可能在商業(yè)水平上獲得成功。

L-鼠李糖可由L-鼠李糖脂水解制備。堿法水解可用1 mol/L NaOH 40℃ 回流12 h，酸法水解可用1 mol/L HCl回流2.5 h，或者在30～100℃ 加H2SO4水解。L-鼠李糖脂水解后得到L-鼠李糖和3-羥基酸，可用乙酸乙酯萃取3-羥基酸，L-鼠李糖在水層;也可用離子交換法，調(diào)pH＞5，用陰離子柱分離3-羥基酸;還可用層析法分離L-鼠李糖［11］。

經(jīng)大量實踐后，工業(yè)化生產(chǎn)選用發(fā)酵法為L-鼠李糖的主要制備方法。生產(chǎn)的L-鼠李糖依據(jù)中間產(chǎn)物的不同可分為2類:一類為由微生物或藻類生產(chǎn)含L-鼠李糖基的多糖，水解獲得L-鼠李糖;另一類為利用微生物生產(chǎn)L-鼠李糖脂，水解L-鼠李糖脂得到L-鼠李糖。然而，該法在制備L-鼠李糖過程中明顯存在不足:L-鼠李糖在多糖中含量往往偏低，水解后含有其他單糖，為后期分離提取增加難度和成本;發(fā)酵液中時常混有雜蛋白，為多糖的分離提純增加困難;多糖易受本身性質(zhì)影響，如用發(fā)酵液黏度過高，工藝條件不易操控等［9］。

因此，利用微生物生產(chǎn)L-鼠李糖脂后經(jīng)水解制備L-鼠李糖是大規(guī)模生產(chǎn)L-鼠李糖較有發(fā)展前景的方法。

2 L-鼠李糖的檢測方法

L-鼠李糖是單糖，故其含量檢測方法可參照其他單糖的測定方法。單糖通常用二硝基水楊酸法(DNS法)［12-13］、高效液相色譜法［14-16］、毛細管柱氣相色譜法［17-18］和薄層色譜法［19-21］等方法進行含量測定。

2.1 二硝基水楊酸法(DNS法) 二硝基水楊酸法是依據(jù)二硝基水楊酸在堿性條件下與還原糖發(fā)生氧化還原反應生成產(chǎn)物在煮沸條件下實現(xiàn)棕紅色，再用比色法測定還原糖含量的一種檢測方法。因為糖類游離出還原基團的數(shù)量可決定其顯色的深淺，并對還原糖的種類無選擇性，故DNS法廣泛應用于多糖等水解后生產(chǎn)多種還原糖體系中。

選取盾葉薯蕷為原料，劉樹興等研究了從皂苷酸解液中提取L-鼠李糖的工藝［4］。在提取出L-鼠李糖后，采用DNS法進行L-鼠李糖含量的測定，并建立標準曲線，得出回歸方程，利用得率公式:得率(%)=L-鼠李糖質(zhì)量/盾葉薯蕷原料質(zhì)量×100%進行含量計算。測定結(jié)果為，盾葉薯蕷總還原糖的得率為2.19%，L-鼠李糖得率為1.5%。

張美超等采用DNS測糖法測定L-鼠李糖含量［1］，試驗配制 1 mg/ml的 L-鼠李糖溶液 25 ml，分別取 1、2、3、4、5 ml于5支刻度管中，分別用去離子水定容至10 ml，以制備L-鼠李糖標準品梯度溶液?？v坐標為標準糖濃度，橫坐標為光密度OD540nm，繪制準曲線。DNS法測得粗糖液含有L-鼠李糖4.18 g，得率為17.4%。

2.2 高效液相色譜法 高效液相色譜法(HPLC)是色譜法的一個重要分支，選取液體為流動相，利用高壓輸液系統(tǒng)，將不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，各組分在柱內(nèi)分離后進入檢測器檢測，以實現(xiàn)試樣的分析。該法在化工、醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)及商品檢驗檢疫領(lǐng)域中起到重要作用。

高效液相色譜法在單糖及多糖檢測中起到重要作用。在《國外醫(yī)學臨床生物化學與檢驗學分冊》［22］中曾刊登出《HPLC法定量測定尿中L-鼠李糖、甘露醇及乳果糖評估小腸通透性在兒科的應用》一文，文中介紹作者采用了示差高壓液相色譜法(HPLC法)，以乳果糖為大分子探針糖，甘露醇和L-鼠李糖為小分子探針糖，研究14名健康兒童在14 d內(nèi)無胃腸道癥狀，禁食一夜后收集試驗前尿樣。隨后，每人口服100 ml含5 g乳果糖、l g L-鼠李糖和1 g甘露醇的溶液，收集5 h內(nèi)的尿樣，記錄總體積，取20 ml尿液置-20℃凍存至分析。試驗以HPLC柱為氨基修飾的硅膠柱，流動相為乙睛∶水(70∶30，V/V)，流速為 1 ml/min，LC 1240 折射率示差檢測。結(jié)果得出L-鼠李糖保留時間為6.2 min，最低檢出濃度為0.1 mmol/L。

楊俊等選取Waters高效糖分析柱，利用梯度洗脫分離，建立了同時測定煙草中水溶性糖的新方法——高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC-ELSD)［23］。試驗條件:流動相為乙腈-水，流速1.0 ml/min，柱溫30℃，進樣量為20 μl;蒸發(fā)光散射檢測器漂移管的溫度為80℃，載氣選擇氮氣，流速為2.00 L/min。稱取0.45～0.30 mm粒徑的煙草樣品1.0 g，準確至0.000 1 g，加入25 ml的超純水，超聲波輔助浸提40 min，溫度40℃，過濾后量取5 ml溶液，流速為1.0 ml/min通過已活化的反相C18固相萃取柱，將最初2 ml溶液棄去，收集后面3 ml溶液，再經(jīng)0.45 μm的水系濾膜過濾。經(jīng)HPLC分析得出L-鼠李糖線性范圍為0.5～30.0 μg，煙草及其制品中包括低含量L-鼠李糖等糖類物質(zhì)的分析與質(zhì)量控制可用該法測定。

2.3 薄層色譜法 薄層色譜法(TLC)又稱薄層層析法，是對少量物質(zhì)進行快速分離、定性分析的一種很重要的實驗技術(shù)。是在玻璃板、塑料或鋁基片上涂抹一層薄厚均勻的固定相，點樣后展開，將比移值(Rf)與適宜的對照物的比移值(Rf)比較，進行藥物鑒定、檢查雜質(zhì)或測定含量。

據(jù)報道，采用薄層層析法對黃姜中的L-鼠李糖進行提取并定性分析［1］。劉叔興等從皂苷酸解液中提取L-鼠李糖時，也采用此法進行定性分析［5］。薄層色譜條件為:展開劑為V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(醋酸)∶V(水)=60∶15∶15∶10;顯色劑為10%硫酸乙醇溶液;Rf值為0.76，斑點為圓形且無拖尾;噴濕潤后于100℃烘烤10 min，得到L-鼠李糖斑點，與標準品斑點一致。

2.4 其他檢測方法 由于L-鼠李糖屬于單糖、水溶性還原糖，因此可參考其他類似糖類的檢測方法。目前國內(nèi)對食品中糖含量的檢測多采用化學檢測法、高效液相色譜-熒光檢測法、離子色譜法、毛細管柱氣相色譜法、流動注射分光度法［24］等。

3 結(jié)論

綜上所述，化學法與其他方法相比較為耗時，且只能測定總糖或還原糖的含量，無法進行準確的定性定量分析;高效液相色譜-示差折光法的靈敏度較低;離子色譜法在糖類含量測定中較為常見，靈敏度較好，但糖類在電極表面易發(fā)生氧化還原反應，影響方法準確度。因此，對于L-鼠李糖中檢測要求定性分析，選用薄層色譜法即可。對于在L-鼠李糖檢測中要求檢測靈敏度高，準確度好應該首選高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法，該方法也被廣泛應用于其他糖類的定性定量檢測中。

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